用于肺外结核检测的超顺磁性氧化铁纳米探针的合成、表征与应用

全球范围内，肺外结核的诊断常常被延误，因其临床表现不特异，且诊断检测性能不佳，通常需要通过手术干预才能确诊。为了改进针对结核分枝杆菌抗原的血清学诊断检测，我们开发了超顺磁性氧化铁纳米探针用于检测肺外结核。由于具有顺磁性，TB-SPIO 纳米探针在低浓度下即可提供精确的磁共振成像，且不会引发任何自身免疫反应。

TB-SPIO 纳米探针可实现对结核分枝杆菌感染的靶向和检测。它们还可作为磁共振成像（MRI）对比剂用于其他疾病的检测。在开展实验前，务必仔细研读本实验方案，因为实验的每个部分均涉及特定的核心技术。

该方法的可视化演示有助于学生理解如何实施该过程，尤其适用于一些较为复杂的实验。制备葡聚糖包被的氧化铁磁性纳米颗粒时，需在室温下将5毫升葡聚糖T40与45毫克六水合三氯化铁和32毫克四水合二氯化亚铁溶液剧烈混合。迅速加入10毫升氢氧化铵，然后使用搅拌子在室温下搅拌所形成的黑色悬浮液1小时。

搅拌孵育结束后，离心溶液并去除聚集体。为了将最终的超顺磁性氧化铁（SPIO）产物与未结合的葡聚糖T40分离，将全部5毫升反应混合物上样至尺寸为2.5 × 33厘米的凝胶过滤色谱柱，用含有0.1摩尔/升醋酸钠和0.15摩尔/升氯化钠的缓冲溶液洗脱葡聚糖。随后，收集空体积中纯化的葡聚糖包被的氧化铁磁性纳米颗粒，并根据标准操作流程，在330纳米和490纳米处分别检测洗脱液中的铁和葡聚糖含量。

为了制备SPIO偶联的结核分枝杆菌表面抗体，首先将10毫升SPIO-EBDE碱性溶液与1克丁二酸酐在室温下混合反应24小时，合成SPIO-EDBE-丁二酸酐。次日，使用截留分子量为12,000至4,000的透析膜管，对上述溶液进行透析，每次更换2升蒸馏水，每26小时换液一次。最后一次换液后，取100微升所得溶液加入400微升浓度为4.5毫克/毫升的结核分枝杆菌表面抗体溶液中，随后在室温下加入1-羟基苯并三氮唑和苯并三氮唑-1-氧基三吡咯啉磷六氟磷酸盐作为催化剂，持续搅拌反应24小时。

通过凝胶过滤色谱法使用 PBS 作为缓冲液将溶液与未结合的抗体分离。为测定平均粒径、形貌及粒径分布，将复合分散液滴加到 200 目铜网上，室温下空气干燥后，置于透射电子显微镜下以 100 千伏进行成像。为测量纳米探针的弛豫时间值，使用 20 兆赫兹、37 摄氏度 ±1 摄氏度的核磁共振弛豫仪进行测定。

进行纳米探针脉冲细胞成像时，首先根据标准细胞培养方案培养人THP-1单核细胞。当细胞达到适当的活化阶段后，将1×10⁷个单核细胞与1×10⁶个菌落形成单位的牛分枝杆菌BCG（Mycobacterium bovis BCG）预孵育一小时。孵育结束后，将细胞转移至1毫升微量离心管中，每管加入2毫摩尔的结核分枝杆菌表面抗体偶联超顺磁性氧化铁纳米探针，在37°C、5%二氧化碳条件下孵育一小时。

孵育结束后，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于 200 微升新鲜培养基中。然后，使用快速梯度回波脉冲序列通过 3.0-T 磁共振成像扫描样品，以确定纳米探针的特异性和灵敏度。为将牛分枝杆菌卡介苗（M.bovis BCG）接种至实验动物，首先将冻干疫苗或菌种储备液用索森培养基（Sauton's medium）重新溶解，并用生理盐水稀释重悬后的储备液。

接下来，将100微升溶液分别装入每只动物对应的一毫升注射器中，并将全部细菌体积皮内注射至每只小鼠左侧或右侧背部肩胛区皮肤。对于活体纳米探针注射动物的活体磁共振成像，首先在每只小鼠尾静脉注射200微升生理盐水悬浮的2纳摩尔SPIO-TB抗体探针之前，获取每只麻醉实验动物的基线T2加权快速自旋回波图像。随后，在注射后立即对动物进行再次成像，并在接下来的30分钟内每5分钟成像一次。

成像结束后，使用信号强度作为测量指标，对所有磁共振图像进行定量分析，比较结核分枝杆菌肉芽肿中心及邻近肉芽肿区域的背部肌肉中相应解剖位置的感兴趣区域。随后，利用注射对比剂前以及注射后0至3小时的信号强度测量值，通过公式计算相对信号增强率。接种后一个月，采集每只动物皮内接种部位的组织样本，对经福尔马林固定、石蜡包埋的5至10微米厚组织切片进行苏木精-伊红染色、抗酸杆菌的齐尔-尼尔森染色以及高铁铁染色（Berlin蓝染色）。

透射电子显微镜成像显示，SPIO-TB表面抗体纳米探针呈现出良好分散的状态，每核心平均大小为3.8 ± 0.4 纳米。牛分枝杆菌BCG及抗酸细菌菌株可通过齐尔-尼尔森染色法进行检测。在使用含三价铁的探针进行分离和培养后，可通过普鲁士蓝染色法对细菌进行鉴定。

可通过T2加权磁共振成像确定SPIO-TB表面抗体纳米探针对结核病的靶向程度，其表现为纳米探针存在时信号强度降低，且降低程度呈浓度依赖性。在注射纳米探针的动物中，结核分枝杆菌肉芽肿区域T2加权成像的信号减弱增强效果约为对照部位的14倍。感染一个月后，在注射纳米探针的C57黑6小鼠中可观察到结构完整的皮下肉芽肿，其病灶内可见新生血管化以及淋巴细胞和上皮样巨噬细胞的聚集。

在肉芽肿区域中也可观察到结核分枝杆菌（M. tuberculosis）呈阳性表达，且在病灶部位抗酸染色显示阳性杆菌。柏林蓝（Berlin blue）是一种三价铁阳性染色剂，也可用于评估探针对结核病的敏感性。为了进行活体磁共振成像，需在注射SPIO-TB抗体探针前，对每只麻醉后的实验动物进行基线T2加权快速自旋回波成像。目前我们已建立了检测肺外结核的标准操作程序（SOP）技术，这些抗体可用于肺外结核的特异性诊断。