Name: 超超磁氧化铁纳米探针在肺外结核检测的合成、表征及应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 了解超顺磁性氧化铁纳米探针的合成与表征方法，用于结核分枝杆菌抗原的血清学检测。该技术可在低浓度下提供精确的磁共振成像，且无自身免疫反应，为肺外结核诊断提供非侵入性替代方案。

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作者感谢中国台湾经济部提供的经费支持（项目编号：NSC-101-2120-M-038-001、MOST 104-2622-B-038 -007、MOST 105-2622-B-038-004）以开展本项研究工作。本稿件由 Wallace Academic Editing 进行了语言编辑。

所有动物实验方案均遵循美国国立卫生研究院《实验动物管理和使用指南》（第8版，2011年）规定的实验动物饲养标准操作程序，并经机构动物护理与使用委员会批准。
1. 超顺磁性氧化铁纳米颗粒的合成
<ol>
	<li>在室温下，将葡聚糖T-40（5 mL；50% w/w）与氯化铁(III)六水合物（FeCl3×6H2O，0.45 g；2.77 mmol）和氯化铁(II)四水合物（FeCl2×4H2O，0.32 g；2.52 mmol）的水溶液混合，并剧烈搅拌，制备葡聚糖包被的氧化铁磁性纳米颗粒。</li>
	<li>迅速加入氢氧化铵（NH4OH，10 mL；7.5% v/v）。</li>
	<li>继续搅拌黑色悬液1小时；随后在17,300 × g 条件下离心10分钟，并去除聚集物。</li>
	<li>通过凝胶过滤色谱法将最终的超顺磁性氧化铁（SPIO）产物与未结合的葡聚糖T-40分离20。</li>
	<li>将反应混合物（总体积 = 5 mL）上样至2.5 cm × 33 cm的色谱柱中，并用含有0.1 M乙酸钠和0.15 M氯化钠、pH为7.0的缓冲液进行洗脱。</li>
	<li>在空体积部分收集纯化的葡聚糖包被氧化铁磁性纳米颗粒，并分别采用盐酸法和苯酚-硫酸法在330 nm和490 nm处检测各洗脱组分中的铁和葡聚糖含量20。</li>
</ol>
2. SPIO-MtbsAb 的合成
<ol>
	<li>采用先前报道的方法合成SPIO-偶联EDBE21,22。</li>
	<li>合成SPIO-EDBE-丁二酸酐（SA）。
	<ol>
		<li>将SPIO-EDBE的碱性溶液（5 M NaOH；10 mL）与SA（1 g；10 µmol）在室温下搅拌反应24小时。</li>
		<li>使用分子多孔膜透析管（截留分子量12,000–14,000）在2 L蒸馏水中透析，共更换20次，每次6小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后，将100 μL SPIO-EDBE-SA（含铁4 mg/mL）加入400 μL 4.5 mg/mL的MtbsAb溶液中，使用1-羟基苯并三唑和（苯并三唑-1-氧基）三吡咯啉基六氟磷酸磷作为催化剂，在室温下搅拌反应24小时，以合成SPIO-MtbsAb。</li>
	<li>最后，通过凝胶过滤层析法将未结合的抗体从溶液中分离。</li>
	<li>将反应混合物（5 mL）上样至2.5 cm × 33 cm的层析柱，用PBS缓冲液洗脱。使用二喹啉甲酸蛋白检测试剂盒23确认抗体–纳米颗粒复合物（即纳米探针）。</li>
</ol>
3. 颗粒形态观察与松弛层级测量
<ol>
	<li>使用透射电子显微镜在100 kV电压下检测平均粒径、形貌及粒径分布。
	<ol>
		<li>将复合分散液滴铸到200目铜网上，在室温下自然风干后装入显微镜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用核磁共振弛豫仪在20 MHz和37.0 °C ± 0.1 °C条件下测量纳米探针的弛豫时间值（T1 和 T2）。
	<ol>
		<li>每次测量前对弛豫仪进行校准。</li>
		<li>分别通过反转恢复法和Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列生成的八个数据点记录 r1 和 r2 值，以确定 r1 和 r2 弛豫率20。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞成像
<ol>
	<li>在含有10%胎牛血清、50 µg/mL硫酸庆大霉素、100单位/mL青霉素G钠、100 µg硫酸链霉素和0.25 µg/mL两性霉素B的RPMI 1640培养基中，于37 °C、5% CO2培养箱中培养人单核细胞THP-1。</li>
	<li>将SPIO-MtbsAb纳米探针（2 mM）与预先在微离心管（1 mL）中与1 × 107个活化单核细胞共孵育的106菌落形成单位（CFU）的牛分枝杆菌BCG菌株，在37 °C、5% CO2培养箱中孵育1小时。</li>
	<li>以200 × g离心，弃去上清液，将沉淀重悬于200 µL培养基中。</li>
	<li>使用快速梯度回波脉冲序列（重复时间（TR）= 500；回波时间（TE）= 20；翻转角 = 10°），通过3.0-T磁共振成像（MRI）扫描样品，以评估纳米探针的特异性和灵敏度21,22。</li>
</ol>
5. 卡介苗（Bacillus Calmette–Guérin）接种
<ol>
	<li>将冻干的疫苗或细菌储备液用Sauton培养基重悬，然后用生理盐水稀释，直至充分分散，具体方法如前所述24。</li>
	<li>取自ADIMMUNE（中国台湾台北）的减毒活疫苗株M. bovis BCG（Connaught株；ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux），以每只小鼠0.1 mL（即107 CFU）的剂量，经皮内注射至小鼠左侧或右侧背部肩胛区皮肤，操作方法如前所述23。以生理盐水注射小鼠作为阴性对照。BCG接种后每日观察动物状态。</li>
	<li>细菌接种1个月后，采用二氧化碳安乐死法处死动物。采集皮内接种部位的组织样本，用10%福尔马林固定，石蜡包埋，并切成5–10 µm的连续切片。使用苏木精/伊红染色和抗酸染色（Ziehl-Neelsen法）检测抗酸菌24，同时使用普鲁士蓝染色（Berlin blue）检测三价铁25。</li>
</ol>
6. 体内 MRI
<ol>
	<li>对小鼠皮下注射氯胺酮（80 mg/kg 体重）和赛拉嗪（12 mg/kg 体重）以实现动物麻醉。</li>
	<li>经小鼠尾静脉注射 SPIO-TbsAb 探针（2 nmol/200 µL）。在注射探针前、注射后即刻以及此后每 5 分钟进行一次磁共振成像，持续 30 分钟，以获取 T2 加权快速自旋回波图像（TR = 3000；TE = 90；视野 = 8）。</li>
	<li>使用信号强度（SI）对所有磁共振图像进行定量分析，信号强度为在结核分枝杆菌肉芽肿中心及邻近肉芽肿区域的背部肌肉中位置相当的感兴趣区域的测量值。</li>
	<li>利用注射前（SIpre；对照）和注射造影剂后 0–3 小时（SIpost）的信号强度测量值，按以下公式计算相对信号增强度： 
	 
	[(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100 
	 
	其中 SIpre 为增强前扫描中病灶的信号强度，SIpost 为增强后扫描中病灶的信号强度21,22。</li>
</ol>

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</ol>

本研究中所有作者均对所检测的材料无任何所有权利益。

与相关研究类似，我们关于SPIO-MtbsAb纳米探针的研究结果表明其对结核分枝杆菌（Mtb）具有显著的特异性27,28。在小鼠模型中，皮下结核分枝杆菌肉芽肿于结核菌接种后1个月被发现。典型的结核病肉芽肿组织学特征包括淋巴细胞浸润、上皮样巨噬细胞的存在以及新生血管形成。抗酸染色显示抗酸杆菌散在分布于结核病灶中，这与MtbsAb免疫组化结果一致，表明结核分枝杆菌表面抗原与MtbsAb之间发生了免疫反应。普鲁士蓝染色在与MtbsAb相同区域显色，进一步证实了该探针对结合抗酸性结核分枝杆菌的特异性。
值得注意的是，结核分枝杆菌（Mtb）和单核细胞THP1细胞在MRI上的负性对比增强程度与SPIO-MtbsAb纳米探针的浓度成正比。当向携带Mtb肉芽肿的小鼠注射SPIO-MtbsAb纳米探针后，与注射PBS的对侧部位相比，肉芽肿部位在T2加权MR图像上显示出14倍的信号降低。这表明对比剂在病灶部位有显著富集。该结果表明，实现对比剂的特异性靶向是可行的，这可能降低临床诊断所需...

在全球范围内，肺外结核病（ETB）占结核病（TB）病例的相当大比例。然而，由于其临床表现隐匿且诊断检测性能不佳，ETB 常常被漏诊或延误诊断；常见的假阴性结果包括痰涂片抗酸杆菌检测呈阴性、组织病理学未见肉芽肿样病变，或无法培养出Mycobacterium tuberculosis（Mtb）。与典型病例相比，ETB 发生频率较低，且结核分枝杆菌（Mtb）释放较少。此外，病变通常局限于难以取样的部位，如淋巴结、胸膜以及骨关节区域1。因此，获取足够临床标本往往需要侵入性操作，使得细菌学确诊具有较高风险且实施困难2,3,4。
目前市面上可获得的用于检测肺外结核（ETB）的抗体检测方法在临床应用中不可靠，因其对所有肺外部位联合检测的敏感性（0.00-1.00）和特异性（0.59-1.00）范围过宽5。针对干扰素-γ的酶联免疫斑点（ELISPOT）检测、培养滤液蛋白（CFP）以及早期分泌抗原靶蛋白（ESAT）已被用于潜伏性和活动性结核病的诊断。然而，在不同病变部位用于诊断肺外结核时，检测结果存在差异6,7,8。此外，结核菌素皮肤试验（PPD，纯化蛋白衍生物）和QuantiFERON-TB检测常出现假阴性结果9。QuantiFERON-TB-2G是一种全血免疫反应检测方法，无需采集受累器官的标本，可能成为一种替代性诊断工具6,10,11。其他常用于结核性脑膜炎的诊断方法，如聚合酶链式反应（PCR），仍因敏感性不足而无法可靠地排除临床诊断12,13。这些传统检测方法所提供的诊断信息不足以确定肺外感染的具体部位。因此，临床上迫切需要新的诊断手段。
分子影像学致力于设计新型工具，以直接在活体中筛选疾病过程中特定的分子靶点14,15。超顺磁性氧化铁（SPIO）是一种T2加权核磁共振（NMR）对比剂，可显著提高磁共振（MR）成像（MRI）的特异性和灵敏度16,17。这种新型功能成像技术可通过配体-受体相互作用，精确描绘组织在分子水平上的变化。本研究合成了一种新型分子影像探针，该探针由SPIO纳米颗粒组成，并与结核分枝杆菌表面抗体（MtbsAb）偶联，用于肺外结核（ETB）的诊断。SPIO纳米探针对被检组织和机体的侵入性极小18,19。此外，由于其顺磁性特性，这些纳米探针在低浓度下即可呈现清晰的磁共振图像。同时，SPIO纳米探针引发过敏反应的可能性最低，因为铁离子的存在属于正常生理组成部分。本研究在细胞和动物模型中评估了靶向ETB的SPIO-MtbsAb纳米探针的灵敏度和特异性。结果表明，该纳米探针可作为超灵敏的影像学试剂用于ETB的诊断。

<table><tbody><tr><td>(苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷基磷六氟磷酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-羟基苯并三唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖(T-40)</td><td>GE Healthcare Bio-sciences AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>环氧氯丙烷，2,2'-(亚乙基二氧基)双(乙胺)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>六水合三氯化铁</td><td>Fluka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四水合氯化亚铁</td><td>Fluka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人单核细胞THP-1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M. bovis BCG</td><td>Pasteur M&amp;eacute;rieux</td><td>Connaught菌株；ImmuCyst Aventis</td><td></td></tr><tr><td>MRI</td><td>GE medical Systems</td><td>3.0-T，Signa</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>Fluka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR弛豫仪</td><td>Bruker</td><td>NMS-120 Minispec</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-300</td><td>GE Healthcare Bio-sciences AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25</td><td>GE Healthcare Bio-sciences AB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPECTRUM分子多孔膜管，截留分子量12,000–14,000</td><td>Spectrum Laboratories Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>结核病表面抗体—抗结核分枝杆菌多克隆抗体</td><td>Acris Antibodies GmbH</td><td>BP2027</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JEM-2000 EX II</td><td></td></tr></tbody></table>

用于肺外结核检测的超顺磁性氧化铁纳米探针的合成、表征与应用

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

一种分子成像探针，包含超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒和 结核分枝杆菌 表面抗体（MtbsAb）被合成以增强肺外结核（ETB）的成像灵敏度。合成了超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米探针，并与MtbsAb偶联。纯化的SPIO-MtbsAb纳米探针通过透射电子显微镜（TEM）和核磁共振（NMR）进行表征。为评估该探针的靶向能力，将SPIO-MtbsAb纳米探针与结核分枝杆菌（Mtb）共孵育用于体外成像实验，并注射至接种Mtb的小鼠体内，通过磁共振（MR）进行体内研究。磁共振成像（MRI）显示，Mtb和THP1细胞的对比度增强程度与SPIO-MtbsAb纳米探针浓度呈正比。在将SPIO-MtbsAb纳米探针静脉注射至感染Mtb的小鼠体内30分钟后，T2加权MR图像中肉芽肿部位的信号强度较注射磷酸盐缓冲液（PBS）的小鼠增强了14倍。MtbsAb纳米探针可作为检测肺外结核的一种新型手段。

SPIO-MtbsAb 纳米探针的合成与表征 
设计将 SPIO 纳米颗粒与 MtbsAb 进行偶联。SPIO 纳米颗粒表面稳定的葡聚糖通过环氧氯丙烷交联。随后，SPIO 纳米颗粒与 EDBE 结合，以活化葡聚糖末端的伯胺官能团。接着将 SA 偶联，形成 SPIO-EDBE-SA。最终一步中，在偶联剂存在下，MtbsAb 与 SPIO-EDBE-SA 偶联形成 SPIO-MtbsAb 纳米探针。SPIO-MtbsAb 纳米探针的透射电镜图像（图1）显示其具有良好的分散性。SPIO-MtbsAb 纳米探针核心的平均粒径为 3.8 ± 0.4 nm（基于 200 个颗粒的统计计算）。
在水溶液中，纳米探针的弛豫率值 r1 和 r2 在 20 MHz 和 37.0 °C ± 0.1 °C 条件下分别为 23 ± 3 和 151 ± 8 mM-1s-1。SPIO-Mtb...

为了改进血清学诊断检测方法 结核分枝杆菌 抗原，我们开发了超顺磁性氧化铁纳米探针用于检测肺外结核病。

一种分子成像探针，包含超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米颗粒和结核分枝杆菌表面抗体（MtbsAb），其……

全球范围内，肺外结核的诊断常常被延误，因其临床表现不特异，且诊断检测性能不佳，通常需要通过手术干预才能确诊。为了改进针对结核分枝杆菌抗原的血清学诊断检测，我们开发了超顺磁性氧化铁纳米探针用于检测肺外结核。由于具有顺磁性，TB-SPIO 纳米探针在低浓度下即可提供精确的磁共振成像，且不会引发任何自身免疫反应。TB-SPIO 纳米探针可实现对结核分枝杆菌感染的靶向和检测。它们还可作为磁共振成像（MRI）对比剂用于其他疾病的检测。在开展实验前，务必仔细研读本实验方案，因为实验的每个部分均涉及特定的核心技术。该方法的可视化演示有助于学生理解如何实施该过程，尤其适用于一些较为复杂的实验。制备葡聚糖包被的氧化铁磁性纳米颗粒时，需在室温下将5毫升葡聚糖T40与45毫克六水合三氯化铁和32毫克四水合二氯化亚铁溶液剧烈混合。迅速加入10毫升氢氧化铵，然后使用搅拌子在室温下搅拌所形成的黑色悬浮液1小时。搅拌孵育结束后，离心溶液并去除聚集体。为了将最终的超顺磁性氧化铁（SPIO）产物与未结合的葡聚糖T40分离，将全部5毫升反应混合物上样至尺寸为2.5 × 33厘米的凝胶过滤色谱柱，用含有0.1摩尔/升醋酸钠和0.15摩尔/升氯化钠的缓冲溶液洗脱葡聚糖。随后，收集空体积中纯化的葡聚糖包被的氧化铁磁性纳米颗粒，并根据标准操作流程，在330纳米和490纳米处分别检测洗脱液中的铁和葡聚糖含量。为了制备SPIO偶联的结核分枝杆菌表面抗体，首先将10毫升SPIO-EBDE碱性溶液与1克丁二酸酐在室温下混合反应24小时，合成SPIO-EDBE-丁二酸酐。次日，使用截留分子量为12,000至4,000的透析膜管，对上述溶液进行透析，每次更换2升蒸馏水，每26小时换液一次。最后一次换液后，取100微升所得溶液加入400微升浓度为4.5毫克/毫升的结核分枝杆菌表面抗体溶液中，随后在室温下加入1-羟基苯并三氮唑和苯并三氮唑-1-氧基三吡咯啉磷六氟磷酸盐作为催化剂，持续搅拌反应24小时。通过凝胶过滤色谱法使用 PBS 作为缓冲液将溶液与未结合的抗体分离。为测定平均粒径、形貌及粒径分布，将复合分散液滴加到 200 目铜网上，室温下空气干燥后，置于透射电子显微镜下以 100 千伏进行成像。为测量纳米探针的弛豫时间值，使用 20 兆赫兹、37 摄氏度 ±1 摄氏度的核磁共振弛豫仪进行测定。进行纳米探针脉冲细胞成像时，首先根据标准细胞培养方案培养人THP-1单核细胞。当细胞达到适当的活化阶段后，将1×10⁷个单核细胞与1×10⁶个菌落形成单位的牛分枝杆菌BCG（Mycobacterium bovis BCG）预孵育一小时。孵育结束后，将细胞转移至1毫升微量离心管中，每管加入2毫摩尔的结核分枝杆菌表面抗体偶联超顺磁性氧化铁纳米探针，在37°C、5%二氧化碳条件下孵育一小时。孵育结束后，通过离心收集细胞，并将沉淀重

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科研

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Medicine

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超超磁氧化铁纳米探针在肺外结核检测的合成、表征及应用

用于评估纳米颗粒在细胞内生物分布的生物成像方法，适用于纳米制剂化合物的治疗和诊断监测。通过组织学共定位分析，本文所述方法具有高灵敏度和特异性。这些方法为从啮齿类动物到人类的应用提供了转化路径。...

用于诊断与治疗监测的纳米材料注册生物成像

本视频展示了一种用于检测肺外结核病的技术。将偶联了针对Mycobacterium特异性抗体的超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米探针注射到先前感染了Mycobacterium bovis...

一种通过超顺磁性纳米探针检测肺外结核病的技术

本文介绍一种合成具有强磁矩和强近红外（NIR）吸收能力的磁等离子体纳米颗粒的实验方案。该方案还包括通过抗体的Fc片段将抗体偶联到纳米颗粒上，适用于需要分子特异性靶向的各种生物医学应用。...

免疫靶向磁-等离子体纳米簇的合成

靶向细胞递送在多种生物医学应用中具有重要意义。本实验方案旨在利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）标记细胞，从而实现磁性细胞靶向，以高度可控的方式进行细胞递送与定位。...

使用超顺磁性氧化铁纳米颗粒进行细胞标记与靶向

微波技术可实现用于动脉粥样硬化斑块表征的氧化铁纳米颗粒的极快速合成。在纳米颗粒外侧使用氨基双膦酸盐可促进其在动脉粥样硬化区域的快速富集。...

微波驱动合成氧化铁纳米颗粒用于快速检测动脉粥样硬化

采用平面频率混合磁检测技术研制了一种用于平面样品中磁性颗粒成像的扫描仪。该技术通过双频激励，记录颗粒非线性无滞回磁化产生的磁互调响应，可用于对薄层生物样品进行二维成像。...

用于平面样品中磁性颗粒成像的频率混合磁检测扫描仪

本实验方案的总体目标是合成一种功能性纳米传感器，通过结合磁弛豫和荧光发射两种模式，实现对特定目标病原菌的便携式、低成本且快速的检测。...

使用磁荧光纳米传感器进行食源性致病菌筛查：快速检测 E. Coli O157:H7

我们描述了利用报告酶荧光（REF）对感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，M. tuberculosis）的小鼠进行光学成像的方法。该方案有助于在结核病发病机制、治疗及疫苗研究的临床前动物模型中，实现对M.

成像 结核分枝杆菌 在携带报告酶荧光的小鼠中

在此，我们介绍一种获取 68镓掺杂的氧化铁纳米颗粒 通过 快速微波驱动合成。该方法可制备 PET/(T1)MRI 纳米颗粒，标记效率高于 90%，放射化学纯度达 99%，合成时间仅需 20...

68Ga 掺杂铁氧化物纳米颗粒的合成用于双模正电子发射断层扫描/(T1)磁共振成像

本研究描述了磁性纳米颗粒的制备方法，其表面包覆 SiO2，随后使用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）进行氨基功能化，并通过琥珀酰基团作为连接臂与去铁胺偶联。此外，还详细描述了对所有中间产物纳米颗粒及最终偶联物进行的深入结构表征，以及利用Y.

功能化磁性纳米颗粒的合成、与铁载体去铁胺的偶联及其在细菌检测中的应用评价

在本研究中，我们提供了一种利用抗体对磁性纳米材料进行生物功能化的方案，以实现对特定细胞的靶向。作为示例，我们使用铁纳米线来靶向癌细胞。...

磁性纳米材料的生物功能化

了解超顺磁性氧化铁纳米探针的合成与表征方法，用于结核分枝杆菌抗原的血清学检测。该技术可在低浓度下提供精确的磁共振成像，且无自身免疫反应，为肺外结核诊断提供非侵入性替代方案。

用于肺外结核检测的超顺磁性氧化铁纳米探针的合成、表征与应用

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