Name: 一种用自动表型分析预测线虫化学毒性的高通量测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学习使用秀丽隐杆线虫进行高通量化学毒性自动表型分析的方法。该方案通过384孔板处理线虫并量化33种毒性相关表型，可在12至24小时内快速预测化学物质的急性毒性，适用于食品添加剂、药物及环境化合物的安全性评估。

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作者感谢 CGC 慷慨提供秀丽隐杆线虫（C. elegans）。本研究得到中国国家重点研发计划（#2018YFC1603102，#2018YFC1602705）；国家自然科学基金项目（#31401025，#81273108，#81641184）；北京市首都卫生发展专项基金（#2011-1013-03）；北京市环境毒理学重点实验室开放基金（#2015HJDL03）；以及中国山东省自然科学基金（ZR2017BF041）的资助。

本方案遵循中国北京市疾病预防控制中心动物伦理委员会的动物护理指南。
1. 化学试剂的制备
<ol>
	<li>获取化学品（表1 和 材料表）。</li>
	<li>确定单个化学品的最高和最低剂量，使其在24小时内的最低致死浓度为100%（LC100，24 h），最高非致死浓度为100%（LC0，24 h），以用于线虫实验。使用至少六种不同稀释度的最高浓度溶液（表1）。 
	注意：对于新化学品，需进行初步的线虫致死率测试9，以探索其LC100和LC0，从而确定合适的剂量。</li>
	<li>用K缓冲液（材料表）将每种化学品稀释至所需浓度的2倍。使用K缓冲液作为对照，以比较化学品引起的表型变化。
	<ol>
		<li>例如，配制7个梯度浓度的氯化镉（CdCl2）（表1）。为配制2倍最高浓度的水溶液（4.64 mg/mL），将92.8 mg的CdCl2固体粉末溶解于8 mL K缓冲液中，待粉末完全溶解后加水定容至10 mL。其余浓度梯度通过K缓冲液稀释获得。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为化学品浓度梯度中的每一浓度准备八个平行孔。每个孔中含有50 µL的2倍浓度化学品溶液。同时准备至少三组每组八个平行孔，仅含K缓冲液作为&#160;对照（表2）。 
	注意：简而言之，每种化学品单次剂量需要500 µL的2倍工作液。</li>
</ol>
2. 线虫制备
<ol>
	<li>从秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center, CGC）获取野生型 N2 线虫和大肠杆菌（Escherichia coli）OP50 菌株。</li>
	<li>获取同步化的 L4 期线虫。
	<ol>
		<li>从划线平板上挑取单个大肠杆菌（E. coli）OP50 菌落，无菌接种于 100 mL LB 液体培养基中，37 °C 过夜培养。 
		注意：E. coli OP50 菌液现已可用于接种线虫生长培养基（NGM，材料表）平板。</li>
		<li>将 NGM 培养基倒入 90 mm 塑料培养皿中，倒板次日每皿加入 300 µL E. coli OP50 菌液进行接种。将 N2 线虫接种于含 OP50 的 NGM 平板上，在 20 °C 培养约 2–3 天，直至大多数线虫发育至成虫阶段。</li>
		<li>用无菌 H2O 将产卵成虫收集至 15 mL 无菌锥形离心管中。静置至少 2 分钟使线虫沉降，吸除上清 H2O，加入 5 mL 漂白液缓冲液（材料表）。</li>
		<li>涡旋振荡管子 5 分钟，以 1,300 × g 离心 30 秒使卵沉淀，弃去上清液。</li>
		<li>用 5 mL 无菌 H2O 洗涤卵，涡旋振荡 5 秒；以 1,300 × g 离心 30 秒，移除上清液后再次洗涤。</li>
		<li>将卵用移液器转移至新的含 OP50 的 NGM 平板上，20 °C 培养。次日清晨观察孵化的 L1 期线虫；线虫约在 40 小时后发育至 L4 期。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 K 培养基将 L4 期线虫从 90 mm 培养皿中冲洗至 50 mL 无菌锥形管中。在体视显微镜下调整线虫浓度至每 100 µL K 培养基中约含 40 条线虫。向 384 孔板的每孔中加入 50 µL（约含 20 条线虫）。这些同步化的 L4 期线虫可用于后续化学药物处理。</li>
</ol>
3. 化学处理与视频采集
注意：在384孔板中，线虫（每孔50 µL）接受单个化学物质的六至七个不同剂量处理（表1）。每个剂量准备八个平行孔，每孔含有50 µL的2倍浓度化学溶液（八个孔中加入相同化学物质且浓度相同，表2）。所有视频均使用连接倒置显微镜的数字相机采集（材料表）。化学处理实验持续24小时。在24小时化学处理期间，各孔中均不添加细菌食物。
<ol>
	<li>在添加化学物质之前，将含有同步化线虫的384孔板置于自动载物台上，使用预设的采集程序对每个孔进行录像（每秒7帧，持续2秒；扫描每块板约需25&#160;分钟）。</li>
	<li>向每个孔中加入50 µL根据第1节配制的2倍浓度化学储备液（表2）。将此时设定为0小时时间点。</li>
	<li>将384孔板在20 °C条件下孵育，并在摇床培养箱中以80 rpm振荡。</li>
	<li>从培养箱中取出孔板并转移至自动载物台。在12小时和24小时时，对整块板的每个孔进行录像，以检测K培养基中每种特定化学处理下线虫的表型。每块板的扫描约需25分钟。</li>
</ol>
4. 实验视频处理
注意：已编写并打包了一个用于实验视频和图像处理的程序，可免费下载（参见材料表）。实验视频以图像帧序列的形式存储，每个视频的帧序列均保存在特定目录中。该程序可自动识别线虫并量化其表型。
<ol>
	<li>在图形用户界面（GUI，图1）中，添加参数，例如帧序列目录、输出目录、线虫大小参数和运动阈值参数。点击分析按钮以处理实验图像。
	<ol>
		<li>点击选择按钮以选定源图像目录。</li>
		<li>在界面中添加中间结果目录。 
		注意：中间结果包括分割后的图像。这些中间结果有助于对处理后的图像进行视觉观察。</li>
		<li>在界面中添加最终结果目录。</li>
		<li>在界面的线虫大小文本框中输入平均线虫大小参数。 
		注意：实验中使用的大小参数为2,000。</li>
		<li>在界面中添加移动比例阈值。 
		注意：实验中使用该比例为0.93。</li>
		<li>点击分析按钮以开始图像处理。点击重置按钮可清除已添加的参数。 
		注意：共定义并量化了33个线虫特征。所有定义的表型均按类别排序（见表3）。这些特征可从实验图像中量化获得。通过比较这些特征，可对具有不同毒性的不同化学物质进行定量比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+behavioral+toxicity+with+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assessing behavioral toxicity with Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 23 (5), 1235-1240 (2004).</li>
<li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+assessing+chemical+toxicity+using+a+Caenorhabditis+elegans+reproduction+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for assessing chemical toxicity using a Caenorhabditis elegans reproduction assay.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 245 (2), 153-159 (2010).</li>
<li>Boyd, W. A., Williams, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+sensitivity+of+three+nematode+species+to+copper+and+their+utility+in+aquatic+and+soil+toxicity+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of the sensitivity of three nematode species to copper and their utility in aquatic and soil toxicity tests.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 22 (11), 2768-2774 (2003).</li>
<li>Dengg, M., van Meel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+model+system+for+rapid+toxicity+assessment+of+pharmaceutical+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 50 (3), 209-214 (2004).</li>
<li>Schouest, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicological+assessment+of+chemicals+using+Caenorhabditis+elegans+and+optical+oxygen+respirometry%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Toxicological assessment of chemicals using Caenorhabditis elegans and optical oxygen respirometry.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (4), 791-799 (2009).</li>
<li>Sprando, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+rank+order+water+soluble+compounds+according+to+their+toxicity+using+Caenorhabditis+elegans%2C+a+Complex+Object+Parametric+Analyzer+and+Sorter%2C+and+axenic+liquid+media%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Chemical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans, a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter, and axenic liquid media.</a> Food and Chemical Toxicology. 47 (4), 722-728 (2009).</li>
<li>Wang, D., Xing, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+locomotion+behavioral+defects+induced+by+acute+toxicity+from+heavy+metal+exposure+in+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+Sciences+%28China%29%22%5BJournal%5D)">Assessment of locomotion behavioral defects induced by acute toxicity from heavy metal exposure in nematode Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Environmental Sciences (China). 20 (9), 1132-1137 (2008).</li>
<li>Leung, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicological Sciences. 106 (1), 5-28 (2008).</li>
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<li>Gao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+and+prediction+of+toxicity+of+chemicals+using+an+automated+phenotypic+profiling+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Classification and prediction of toxicity of chemicals using an automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 19 (1), 18(2018).</li>
<li>Moyson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixture+effects+of+copper%2C+cadmium%2C+and+zinc+on+mortality+and+behavior+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology+and+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mixture effects of copper, cadmium, and zinc on mortality and behavior of Caenorhabditis elegans.</a> Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (1), 145-159 (2018).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+DMSO+is+dependent+on+sir-2.1+and+daf-16%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by DMSO is dependent on sir-2.1 and daf-16.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 400 (4), 613-618 (2010).</li>
<li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Effect+of+the+ToxCast+Phase+I+and+Phase+II+Chemicals+in+Caenorhabditis+elegans+and+Corresponding+Responses+in+Zebrafish%2C+Rats%2C+and+Rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Developmental Effect of the ToxCast Phase I and Phase II Chemicals in Caenorhabditis elegans and Corresponding Responses in Zebrafish, Rats, and Rabbits.</a> Environmental Health Perspectives. 124 (5), 586-593 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

C. elegans 的优势使其在毒理学研究中的应用日益广泛9，无论是在作用机制研究还是高通量筛选方法中均得到广泛应用。近年来，C. elegans 在补充其他模式系统进行毒理学研究方面发挥了愈加重要的作用，尤其是在新型化学物质的快速毒性评估中表现突出。本文介绍了一种基于384孔板的高通量、定量筛选线虫表型的新方法，可实现化学物质毒性的自动识别与评估。该方法适用于在24小时内完成化学物质的急性毒性测试，若增加数据采集时间点并为线虫提供食物来源（OP50），也可用于亚急性毒性测试。
用于稀释化学品的培养基可能有所不同；在本实验中，我们参考Sofieet al.13 的研究选择使用K培养基。对照组和化学处理组的线虫均在K培养基中培养。人工淡水溶液或低离子强度的土壤溶液可作为K培养基的替代选择。
不同毒性的化学物质会以不同的模式改变秀丽隐杆线虫（C. elegans）...

随着应用于工业生产和人们日常生活的化学物质迅速发展，研究化学品的毒性检测模型显得尤为重要。在许多情况下，啮齿类动物模型被用于评估不同化学物质对健康的潜在毒性。通常，在啮齿类动物（大鼠/小鼠）体内实验中，致死浓度（即不同化学物质的半数致死剂量&#160;[LD50]）被用作传统参数，但该方法耗时较长且成本高昂。此外，根据动物福利与伦理中的“减少、优化、替代”（3R）原则，能够替代高等动物的新方法对科学研究具有重要价值1,2,3。C. elegans 是一种自由生活的线虫，最初从土壤中分离获得。由于其生命周期短、易于培养且繁殖效率高，已被广泛用作实验室研究的模式生物。此外，C. elegans 中许多基本的生物学通路，包括基本生理过程和应激反应，在高等哺乳动物中具有高度保守性4,5,6,7,8。我们及他人的多项比较研究表明，C. elegans 的毒性反应与啮齿类动物中的毒性反应具有良好的一致性9。这些优势使C. elegans 成为在活体条件下检测化学物质毒性的理想模型。
最近，一些研究对表型特征进行了量化 秀丽隐杆线虫这些特征可用于分析化学品的毒性2,3,10 以及线虫的衰老11我们还开发了一种结合液体线虫培养系统与图像分析系统的方法，其中线虫在384孔板中接受不同化学处理进行培养。12该定量技术旨在自动分析线虫在384孔液体培养板中经12-24小时化学处理后的33项参数。实验通过自动显微镜载物台采集视频，随后由定制程序处理视频数据，量化与线虫运动行为相关的33个特征。该方法被用于评估10种化合物处理下线虫表型的变化。结果表明，不同毒性可改变线虫的表型 秀丽隐杆线虫这些定量的表型可用于识别和预测不同化合物的急性毒性。该方法的总体目标是促进实验中表型的观察与定量分析 秀丽隐杆线虫 在液体培养基中。该方法适用于 秀丽隐杆线虫 在化学毒性评估和表型定量分析中，有助于预测不同化合物的急性毒性，并为在啮齿类动物模型中进一步开展传统化学毒性评估试验建立优先级排序。&#160;此外，该方法还可用于新化学物质或作为食品添加剂污染物、药物化合物、环境外源性化合物等的毒性筛选与检测。

<table><tbody><tr><td>2-丙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59300</td><td></td></tr><tr><td>384孔板</td><td>血栓</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Bacto</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>硫酸阿托品</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHL80892</td><td></td></tr><tr><td>漂白缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.5 mL 10 M NaOH，0.5 mL 5% NaClO，9 mL 超纯水</td></tr><tr><td>氯化镉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202908</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21074</td><td></td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>Zeiss</td><td>AxioCam HRm</td><td>蔡司显微系统有限公司</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铜(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>451657</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24105</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>K-培养基</td><td></td><td></td><td>3.04 g NaCl 和 2.39 g KCl 溶于 1 L 超纯水中</td></tr><tr><td>LB肉汤&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>10&amp;nbsp;g/L&amp;nbsp;胰蛋白胨&amp;nbsp;5&amp;nbsp;g/L&amp;nbsp;酵母&amp;nbsp;提取&amp;nbsp;5&amp;nbsp;g/L&amp;nbsp;NaCl&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>七水硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td></td></tr><tr><td>NGM 平板</td><td></td><td></td><td>3 g NaCl，17 g 琼脂，2.5 g 蛋白胨溶于 1 L 超纯水中，灭菌后加入 1 mL 胆固醇（乙醇中 5 mg/mL），1 mL MgSO4（1 M），1 mL CaCl2（1 M），25 mL PPB 缓冲液</td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60130</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795496</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>PPB缓冲液</td><td></td><td></td><td>35.6 克 K2HPO4，108.3 克 KH2PO4 溶于 1 升超纯水中</td></tr><tr><td>摇床</td><td>ZHICHENG</td><td>ZWY-200D</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>氟化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s7920</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>次氯酸钠溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239305</td><td></td></tr><tr><td>程序链接</td><td></td><td></td><td>https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>蔡司自动显微镜&amp;nbsp;</td><td>蔡司</td><td>AXIO Observer.Z1</td><td>蔡司自动显微镜配备专有软件 Zen2012 和电荷耦合器件（CCD）相机</td></tr></tbody></table>

一种通过自动化表型分析预测化学毒性的高通量检测方法 秀丽隐杆线虫

A High-throughput Assay for the Prediction of Chemical Toxicity by Automated Phenotypic Profiling of Caenorhabditis elegans

在高等生物（如小鼠或大鼠）中进行化学品毒性测试由于其寿命较长且饲养维护复杂，耗时且成本高昂。相比之下，线虫Caenorhabditis elegans（C. elegans）具有寿命短、易于培养和繁殖效率高等优势，是进行毒性测试的理想选择。本文介绍了一种在384孔板中对C. elegans进行自动表型分析的实验方案。将线虫在含有液体培养基和化学处理物的384孔板中培养，并对每个孔拍摄视频，以量化化学品对线虫33项特征的影响。实验结果表明，通过量化获得的表型特征可对不同化合物的急性毒性进行分类和预测，并为后续在啮齿类动物模型中开展的传统化学品毒性评估实验提供优先级排序依据。

我们测试了线虫在暴露于10多种不同浓度化学物质下的表型12。在该测试中，每种化合物在三个时间点（0 h、12 h和24 h）共量化了33种不同的特征。此前，已有研究对寿命测定中手动分析与自动分析进行了比较11,12。在本实验中，我们发现化学物质及其浓度会影响线虫的表型。该方法的概览见图2。
结果（图3 和 图4c,d）显示，随着化学物质浓度的增加，蠕虫迅速死亡。在较高浓度下，蠕虫的形态比低浓度组或对照组更趋于伸直，弯曲程度降低（图3</s...

已开发出一种定量方法，通过自动分析秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的表型谱来识别和预测化学品的急性毒性。本实验方案描述了如何在384孔板中用化学品处理线虫、采集视频，以及量化与毒理学相关的表型。

在较高等的生物体（如小鼠或大鼠）中进行化学品毒性测试，由于其寿命较长，耗时且成本高昂……

秀丽隐杆线虫（C.elegans）毒理学检测具有重要价值。本实验方案描述了如何在384孔板中对秀丽隐杆线虫进行化学物质处理、采集视频，并对与毒理学相关的表型进行定量分析。该方法有助于识别和预测化学物质潜在的急性毒性。该定量技术已开发用于在384孔板液体培养基中对秀丽隐杆线虫（C.elegans）进行12至24小时化学处理后，自动分析其33项参数。秀丽隐杆线虫作为新型化学品快速毒性评估的良好模型具有重要价值。与小鼠类似，该技术可用于新型化学品的毒性筛选与检测，或用于食品添加剂污染物、药物化合物、环境外源性化合物等的毒性评估。仔细阅读方案，并始终逐步遵循操作步骤，这样您就能熟练掌握。通过视觉演示，用户可以更直观地观察每一步的操作过程及操作结果。本实验操作将由 Wenjing Zhang 和 Gaochao Han 进行示范。他们是我实验室的研究生。首先，对一种新化学物质进行初步的线虫致死率测试，以确定最高剂量和最低剂量，即达到100%致死率的最低浓度和达到100%非致死率的最高浓度。本实验中，需配制七种梯度浓度的氯化镉溶液。为制备两倍最高浓度的水溶液，将92.8毫克氯化镉固体粉末溶解于装有8毫升K培养基的离心管中。涡旋混匀。待粉末完全溶解后，使用移液器加液至10毫升。通过使用K培养基稀释来制备其他浓度梯度。在超净工作台中，使用无菌枪头从划线平板上挑取单个大肠杆菌OP50菌落，并将其放入含有100毫升LB液体培养基的锥形瓶中以接种菌落。在37摄氏度的摇床培养箱中过夜培养。将NGM倒入90毫米的塑料培养皿中。每块培养皿接种300微升大肠杆菌OP50溶液。将N2线虫在含有OP50的NGM培养皿上于20摄氏度培养约2至3天，直至大多数线虫发育至成虫阶段。用无菌水将带有卵的成虫冲入一个15毫升无菌锥形离心管中以收集。让虫体静置至少2分钟。吸去上清液，加入5毫升次氯酸钠缓冲液。将离心管涡旋震荡5分钟，然后将离心管放入离心机，以1300 ×g的相对离心力离心30秒，使虫卵沉淀。用移液器吸除上清液。向离心管中加入5毫升无菌水以洗涤虫卵，再将离心管涡旋震荡5秒。在相对离心力1300下离心试管30秒。弃去上清液，加入5毫升无菌水再次洗涤。用移液器将虫卵转移至含OP50的新NGM平板上。在20摄氏度下过夜培养。次日早晨，孵化的线虫达到L1阶段。大约40小时后，线虫达到L4阶段。用 K 培养基将 L4 期线虫从培养皿中冲洗至一个 50 毫升无菌锥形管中。从管中吸取 50 微升虫液至载玻片上。在体视显微镜下，使用移液器调节线虫浓度，使每 100 微升 K 培养基中约含 40 条线虫。向384孔板的每个孔中加入50 µL制备好的培养基。这些同步化的L4期线虫已准备好进行后续化学物质处理。在添加化学物质之前，将含有同步化线虫的384孔板放置在自动载物台上，并设置好摄像机及程序化的图像采集流程。在384孔板中，线虫用每种化学物质的六到七个不同剂量进行处理，每个剂量设置八个平行孔，每孔加入50微升的两倍浓度化学溶液。至少准备三组K培养基作为对照，每组包含八个平行孔。每孔加入50微升的两倍浓度化学溶液。将时间设为零时点。然后，将384孔板放入设定为20摄氏度、80转/分钟的培养摇床中。经过所需时间后，从培养箱中取出孔板，并将其转移至自动载物台。在12小时和24小时分别拍摄培养板每个孔的视频，以观察线虫的表型。开始处理实验视频时，先将视频文件传输到计算机。通过图形用户界面，单击“选择”按钮，以选定源图像目录。添加中间结果目录。中间结果包含分割后的图像，可用于处理后图像的视觉观察。在界面中添加最终结果目录。在界面的“Worm Size”文本框中将平均线虫大小参数设置为 2,000。在界面中将移动比例的阈值设置为 0.93。单击“Analyze”按钮以开始图像处理。所开发的程序能够自动识别线虫并量化表型。在本实验中，对三个时间点（0小时、12小时和24小时）的氯化镉处理，共量化了33个不同的特征。实验图像显示，随着化学物质浓度的增加，线虫死亡速度加快。起初，对照组与化学处理组之间无显著差异。处理12小时后，经高浓度处理的蠕虫变得比低浓度处理组或对照组更挺直且弯曲程度降低。随着处理时间的延长，蠕虫体覆盖区域的主轴长度增加。在长轴和短轴方向上，化学物质浓度均呈现出从低到高的梯度趋势。根据面积和比值评估的蠕虫运动能力表现出相似的模式。在实验初期未观察到显著差异。随着时间的推移，对照组中的蠕虫运动能力表现出稳定的下降。在处理 12 小时和 24 小时后，经氯化镉处理的蠕虫与对照组相比，其运动能力显示出显著差异。此外，与低浓度处理组的蠕虫相比，高浓度处理组的蠕虫运动能力更弱。总之，该技术为多个领域的快速毒性评估开辟了途径。研究人员可将该方法应用于食源性中毒事件的应急毒性分析、药物化合物的安全性评价，以及新化学物质和环境外源性化合物的急性毒性筛选与检测。氯化镉是一种低毒物质。操作过程中请佩戴手套和口罩，并遵循操作说明。

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