利用动态核极化固态核磁共振技术进行结构解析的真菌与植物材料制备

本方案可用于制备真菌和植物材料，以进行固体核磁共振（NMR）和动态核极化（DNP）实验，用于复杂生物系统的表征。该技术使我们能够在生物材料的天然环境中（例如完整细胞中）以原子分辨率水平对其进行研究。获取有关真菌材料的高分辨率结构信息将有助于抗真菌药物的开发。

该方法可深入了解真菌细胞壁中复杂碳水化合物的组成与结构，并可应用于多种富含碳水化合物的生物体，包括植物、真菌、藻类和细菌。一些研究者可能在细胞培养过程中遇到真菌污染问题。我的建议是在使用前对培养基和设备进行彻底灭菌，以防止此类污染。

本演示将帮助在核磁共振（NMR）或细胞培养方面经验较少的研究人员学习如何在真菌和植物系统中应用这些技术。制备未标记的液体培养基时，将6.5克酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）粉末溶解于100毫升蒸馏水中，然后在134摄氏度下高压灭菌25分钟。制备未标记的固体培养基时，将6.5克YPD琼脂粉末加入100毫升蒸馏水中，在121摄氏度下高压灭菌25分钟，随后将培养基冷却至约50摄氏度。

然后，将13至15毫升融化的固体培养基转移至各自的无菌塑料培养皿中，并立即盖上皿盖。制备碳-13、氮-15标记的液体培养基时，根据需要使用酸或碱将100毫升含同位素的最低限度培养基调节至pH 6.6。接着，将表格中所列的盐类溶解于100毫升蒸馏水中，加入碳-13、氮-15标记的液体培养基中，并将所得溶液在121摄氏度下高压灭菌25分钟。

当溶液冷却至室温后，向全部体积的碳-13、氮-15标记的最低培养基中加入100微升微量元素溶液。为了培养真菌材料，使用接种环从保存的菌种中转移少量真菌至YPD平板，然后在30摄氏度培养箱中培养真菌两天。培养结束后，使用新的接种环将活跃生长的菌丝边缘转移至碳-13、氮-15标记的液体培养基中，并将培养物置于30摄氏度、220转/分钟的摇床培养箱中振荡培养三至五天。

当大量真菌覆盖在烧瓶底部并悬浮于液体中时，通过离心收集真菌，并弃去上清液。用适当的溶液重悬菌体沉淀，用镊子取约0.5克充分水合的沉淀用于核磁共振（NMR）和动态核极化（DNP）分析。然后，将剩余材料与20%甘油溶液在锥形管中混合，并将真菌样品置于-80摄氏度下长期保存。

为进行固体核磁共振分析，首先将0.5克碳-13、氮-15标记的真菌样品置于截留分子量为3.5千道尔顿的透析袋中，在4摄氏度条件下，用1升10毫摩尔磷酸盐缓冲液透析三天，以去除培养基中的小分子物质。透析结束后，将样品转移至15毫升离心管中进行离心，并取70至80毫克均匀碳-13标记且充分水合的样品糊状物装入一个4毫米氧化锆转子中。使用金属棒轻轻反复挤压样品，同时用滤纸吸除多余水分。

然后，紧密盖上转子，将样品插入光谱仪中进行固态核磁共振表征。为准备用于DNP分析的烟曲霉样品，每个碳-13、氮-15标记的真菌样品取100微升DNP基质加入一个1.5毫升微量离心管中，并向每管中溶解0.7毫克极化剂，配制成10毫摩尔的自由基储备溶液。涡旋振荡2至3分钟，确保自由基完全溶解于溶液中后，将10毫克透析过的碳-13、氮-15标记真菌样品浸泡于50微升极化剂溶液中，并使用研钵和研杵轻轻研磨混合物，以确保自由基渗透进入多孔的细胞壁。

再向研磨后的沉淀中加入 30 微升自由基溶液，以进一步水合真菌样品，并将沉淀装入 3.2 毫米的蓝宝石转子中。轻轻挤压并去除多余的 DNP 溶剂，如图所示，然后加入一个 3.2 毫米的硅胶塞，以防止水分流失。随后，将转子放入核磁共振波谱仪中进行常规实验，或放入 DNP 波谱仪中，在微波照射下测量 DNP 增强谱。

为 DNP 研究准备植物材料时，使用剃刀将均匀标记碳-13的植物材料切成一至二毫米的片段。使用研钵和研杵将片段研磨成更小的颗粒，直至最终粉末呈现均匀的外观。向植物材料中加入 40 µL 的 10 mM 自由基储备溶液，并轻轻研磨样品额外五分钟，以确保与自由基充分均匀混合。

用另外20 µL自由基储备溶液润湿研磨后的样品，并将平衡后的植物样品装入3.2毫米的蓝宝石转子中用于DNP分析。然后插入硅胶塞以防止水分流失，并将样品装载至DNP波谱仪上。同位素标记显著增强了核磁共振（NMR）的灵敏度，使得能够测量一系列二维碳-13-碳-13和碳-13-氮-15相关谱，从而分析多聚物的组成、水合状态、流动性及排列方式，进而整合数据构建细胞壁结构的三维模型。

如果在二维碳-13-碳-13谱图中难以获得非对角线信号，则可能发生了统计学标记。化学位移为96和92 ppm的两个碳-13峰是葡萄糖的特征性碳-1信号。因此，在使用35秒较长重复延迟测得的定量碳-13直接极化谱图中，这两个峰的强度较高通常表明存在小分子残留，其原因可能是透析或洗涤不完全所致。

通过标记清晰的样品，可进一步测量长程相关性，以检测生物分子的空间邻近关系，并构建完整细胞壁的结构模型。该技术有助于探索多种天然存在及人工设计材料中的结构与功能关系，推动未来对富含碳水化合物的生物材料以及功能化聚合物的研究。由于某些真菌可能在人类中引起感染或系统性疾病，务必在层流罩中操作真菌材料，以提供保护并尽量减少暴露风险。