Name: 1型糖尿病生物制药候选疫苗在红甜菜中的瞬态表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 了解利用红甜菜叶片瞬时转化技术生产1型糖尿病口服疫苗候选药物的方法。该技术通过植物表达系统高效积累重组蛋白光抗原，为开发可食用植物源疫苗提供新策略。

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本工作由维罗纳大学在2014年项目征集框架下资助，联合项目“利用植物生产自身免疫性糖尿病可食用疫苗（eDIVA）”（项目编号：891854）。

1. 红甜菜和菠菜的栽培
<ol>
	<li>在生长室中种植红甜菜（B. vulgaris cv Moulin Rouge）和菠菜（S. oleracea cv Industria），光照强度为150 µE，相对湿度65%，光/暗周期为12小时，温度分别为23/21 °C。</li>
	<li>种子萌发后，每周施用两次市售肥料溶液（浓度为1 g/L）（材料表）。进行农杆菌浸润实验时，使用五周大的菠菜和六周大的红甜菜植株。</li>
</ol>
2. 利用去构建的植物病毒载体技术进行瞬时表达
<ol>
	<li>植物表达载体的构建
	<ol>
		<li>使用标准技术将载体——5’模块（pICH20111）、3’模块（pICH31070.GAD65mut、pICH31070.∆87G65mut 和 pICH7410.eGFP，按先前所述方法制备）1,2,7，以及整合酶模块（pICH14011）——导入农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 菌株中。在含有 50 μg/mL 利福平及相应载体特异性抗生素的 LB 培养基中于 28 °C 培养 2 天（pICH20111、pICH14011 和 pICH7410.eGFP 使用 50 μg/mL 羧苄青霉素，pICH31070 使用 50 μg/mL 卡那霉素）。</li>
		<li>通过菌落 PCR 筛选菌落，各载体使用以下特异性引物：针对 3’模块 pICH31070.GAD65mut 和 pICH31070.∆87G65mut 的引物为 5’-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3’ 和 5’-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3’，退火温度 55 °C，延伸时间 110 s；针对第三个 3’模块 pICH7410.eGFP 的引物为 5’-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3’ 和 5’-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3’，退火温度 53 °C，延伸时间 30 s；针对 5’模块的引物为 5’-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3’ 和 5’-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3’，退火温度 53 °C，延伸时间 20 s；针对整合酶模块的引物为 5’-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3’ 和 5’-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3’，退火温度 57 °C，延伸时间 45 s。</li>
		<li>在总体积为 20 μL 的体系中进行 PCR 反应，反应循环程序如下：95 °C 预变性 5 min；进行 35 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 30 s、退火温度下退火 30 s 及 72 °C 延伸（退火温度和延伸时间根据每对引物特异性设定）；最后在 72 °C 延伸 7 min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射器农杆菌浸润法
	<ol>
		<li>将三种 A. tumefaciens 转化子分别接种于 50 mL 含 50 μg/mL 利福平及相应载体特异性抗生素的 LB 培养基中（转化了 pICH20111、pICH14011 或 pICH7410.eGFP 的 A. tumefaciens 使用 50 μg/mL 羧苄青霉素，转化了 pICH31070 的 A. tumefaciens 使用 50 μg/mL 卡那霉素），于 28 °C 摇床过夜培养。</li>
		<li>将过夜培养的菌液在 4,500 ×g 离心 20 min 收集菌体，用 100 mL（或初始菌液体积的两倍）浸润缓冲液（含 10 mM 4-吗啉乙磺酸（MES；pH 5.5）和 10 mM MgSO4）重悬，无需考虑 OD600。室温（RT）孵育 3 h。</li>
		<li>将含有三种模块之一（GAD65mut、∆87GAD65mut 或 eGFP 3’模块）的菌液与 5’模块和整合酶模块的菌液等体积混合。使用该混合菌液对红甜菜和菠菜叶片进行注射器浸润。</li>
		<li>将 5 mL 菌液装入无针头的注射器中。将注射器尖端紧贴红甜菜和菠菜叶片的下表面，同时在叶片另一侧施加轻微反向压力。</li>
		<li>从植株顶端开始，浸润前三个完全展开的叶片。用纸质标签在叶柄上标记已浸润的叶片。将植株放回生长室，在标准条件下培养。 
		注意：出于健康与安全考虑，浸润过程中应佩戴护目镜和手套。</li>
		<li>在侵染后 4 至 14 天（dpi）采集浸润过的叶片，并用液氮速冻。将植物组织储存在 -80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>真空农杆菌浸润法
	<ol>
		<li>将三种 A. tumefaciens 转化子分别在含 50 μg/mL 利福平及相应载体特异性抗生素的 50 mL LB 培养基中，于 28 °C 摇床过夜培养。</li>
		<li>将过夜培养的菌液在 4,500 ×g 离心 20 min 收集菌体，用 1 L 浸润缓冲液重悬至 OD600 为 0.35，室温（RT）孵育 3 h。</li>
		<li>向每种菌液中加入 0.01%（v/v）的去垢剂（聚山梨酯 20）。将含有三种模块之一（GAD65mut、∆87GAD65mut 或 eGFP 3’模块）的菌液与 5’模块和整合酶模块的菌液等体积混合。</li>
		<li>将一株植物（六周龄的红甜菜植株，见第 1 节）插入支架中。将支架倒置并置于盛有浸润液（2 L）的烧杯上方，使叶片完全浸入浸润菌液中。 
		注意：确保所有叶片完全浸没在菌液中。必要时可添加额外浸润液以提高液面。</li>
		<li>将带有浸没植株的浸润液转移至浸润室中并关闭舱门。启动真空泵，打开浸润室的真空进气阀。</li>
		<li>当浸润室内压力降至 90 mbar 时，维持真空 3 min，随后释放真空 45 s。待浸润室恢复至大气压后，打开舱门，将浸润过的植株从菌液中取出。</li>
		<li>将植株放回生长室，在标准条件下培养。</li>
		<li>根据重组蛋白的最大表达时间（dpi）采集浸润过的叶片，并用液氮速冻。将植物组织储存在 -80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 重组蛋白表达分析
<ol>
	<li>总可溶性蛋白（TSP）提取
	<ol>
		<li>使用研钵和研杵在液氮中将通过注射器或真空渗入法获得的红甜菜和菠菜叶片（分别在步骤2.2.6和2.3.8中收集）研磨成细粉。将粉末转移至15 mL塑料管中，并于-80 °C保存。</li>
		<li>向300 mg叶粉中加入900 µL提取缓冲液（50 mM 磷酸钠，pH 8.0，20 mM 亚硫酸氢钠）。 
		注意：所选植物组织重量（mg）与缓冲液体积（µL）的比例为1:3。</li>
		<li>通过涡旋振荡1分钟使混合物均质化，然后在4 °C下以30,000 ×g离心40分钟。</li>
		<li>将上清液收集至洁净的离心管中，并于-80 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>植物eGFP的可视化与定量
	<ol>
		<li>将来自表达eGFP的叶片的每种TSP提取物各100 µL（设三个技术重复）加入96孔板中。</li>
		<li>将96孔板放入荧光读板仪中并开始检测。使用适用于eGFP荧光检测的485/535 nm滤光片组合。</li>
		<li>为进行绝对定量，在同一块板中制备标准曲线，加入不同量（62.5、125、500、750和1,000 ng）的纯化eGFP。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双辛可宁酸（BCA）法测定TSP含量
	<ol>
		<li>将试剂A（材料表）50份与试剂B（材料表）1份混合。根据待测样品和标准品的数量，配制足量的新鲜BCA工作液。 
		注意：每个样品所需的BCA工作液体积为1.9 mL。对于包含9个标准品（含空白）的标准程序，共需17.1 mL BCA工作液。</li>
		<li>用移液器将每种标准品（包括空白）及TSP提取物各0.1 mL加入已标记的离心管中。 
		注意：作为校准标准品，应使用与样品相同的稀释液（如水）新鲜配制一系列浓度范围为10–1,000 μg/mL的牛血清白蛋白（BSA）标准品。空白组为0.1 mL用于标准品和样品配制的稀释液。</li>
		<li>加入1.9 mL BCA工作液并充分混匀。盖好管盖，在37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>将离心管冷却至室温，在10分钟内测定所有样品在562 nm处的吸光度。 
		注意：即使在室温下，显色反应仍会持续。只要在10分钟内完成所有管的吸光度测定，就不会引入显著误差。</li>
		<li>从各标准品和TSP提取物的读数中减去空白组在562 nm处的吸光度值。</li>
		<li>以各标准品浓度为横坐标，以其经空白校正后的562 nm吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，并据此确定每个TSP提取物的蛋白浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照Gecchele等8先前描述的方法进行考马斯亮蓝染色。</li>
	<li>Western印迹分析
	<ol>
		<li>按照Gecchele等8先前描述的方法进行Western印迹分析。</li>
		<li>蛋白质经电泳分离后，采用标准技术将其转印至硝酸纤维素膜上。通过将4%脱脂奶粉溶于磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中配制封闭液。用10 mL封闭液在室温下封闭膜1小时。</li>
		<li>在5 mL含0.1%去污剂的封闭液中，将兔源一抗按以下比例稀释：抗GAD65/67和抗LHCB2抗体为1:10,000，抗eGFP抗体为1:20,000。将膜与稀释后的一抗溶液在4 °C孵育过夜，或在室温下持续振荡孵育4小时。</li>
		<li>弃去一抗溶液，用含0.1%去污剂的封闭液洗涤膜3次，每次5分钟。</li>
		<li>在含0.1%去污剂的封闭液中，将辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔二抗按1:10,000稀释。将膜在室温下持续振荡孵育1.5小时。</li>
		<li>弃去二抗溶液，用PBS-T（含0.1%去污剂的PBS）洗涤膜5次，每次5分钟。</li>
		<li>根据制造商说明书，将膜与市售的鲁米诺溶液孵育，并使用化学发光成像系统检测信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 植物材料处理
<ol>
	<li>在表达高峰期（11 dpi）收获经真空农杆菌浸润表达 ∆87GAD65mut 的红甜菜叶片，并用液氮速冻。</li>
	<li>将冷冻的叶片在 -50 °C 和 0.04 mbar 条件下冻干 72 小时，然后于 -80 °C 保存。</li>
	<li>将叶片研磨成细粉，置于含硅胶的密封容器中，于室温下避湿保存。</li>
</ol>
5. 胃消化模拟与细胞完整性分析
<ol>
	<li>胃消化模拟
	<ol>
		<li>称取100 mg研磨后的冻干红甜菜叶片，用6 mL PBS（pH 7.4）重悬。</li>
		<li>用6 M HCl将样品pH调节至2。</li>
		<li>加入来自猪胃黏膜的4 mg/mL胃蛋白酶（溶于10 mM HCl），使终浓度达到1 mg/mL，或胃蛋白酶与总可溶性蛋白的比例为1:20。在37 °C下振荡反应120分钟。</li>
		<li>用1 M NaOH将样品pH调至8，以灭活胃蛋白酶。</li>
		<li>取每份样品750 µL，在4 °C下以20,000 x g 离心20分钟。分别收集上清液，并将沉淀物用相当于上清液体积的上样缓冲液（1.5 M Tris HCl，pH 6.8，3% SDS，15%甘油和4% 2-巯基乙醇）重悬。 
		注意：出于健康与安全考虑，样品制备时应佩戴手套并在通风橱中操作。</li>
		<li>通过Western印迹分析分别检测上清液和重悬后的沉淀物8。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞完整性分析
	<ol>
		<li>准备两份100 mg研磨后的冻干红甜菜叶片，分别用6 mL PBS（pH 7.4）重悬。</li>
		<li>仅将其中一份样品的pH用6 M HCl调节至2。将两份样品在37 °C下振荡120分钟。</li>
		<li>取每份样品750 µL，在4 °C下以20,000 x g 离心20分钟。分别收集上清液，并将沉淀物用相当于上清液体积的上样缓冲液重悬。</li>
		<li>通过Western印迹分析分别检测上清液和重悬后的沉淀物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 生物负载检测
<ol>
	<li>称取100 mg冻干的红甜菜叶片，将粉末重悬于8 mL无菌PBS（pH 7.4）中，涡旋振荡1分钟。</li>
	<li>制备不含抗生素的LB培养基，或分别添加：(i) 50 µg/mL利福平，(ii) 50 µg/mL利福平和50 µg/mL羧苄青霉素，(iii) 50 µg/mL利福平和50 µg/mL卡那霉素，或(iv) 50 µg/mL利福平、50 µg/mL羧苄青霉素和50 µg/mL卡那霉素。</li>
	<li>将每种冻干叶片匀浆液各取1 mL，分别接种于上述5种选择性LB培养基之一中。</li>
	<li>将所有培养皿在28 °C下培养3天。</li>
	<li>计数每块培养皿上生长的Agrobacterium菌落。</li>
	<li>计算并定义残留细菌载量，即每毫升冻干叶片匀浆液中的菌落形成单位数（CFU/mL）。</li>
</ol>
7. 代谢物提取
<ol>
	<li>初级代谢物提取
	<ol>
		<li>称取30 mg保存于-80 °C的、经真空农杆菌浸润表达∆87GAD65mut的红甜菜叶片粉末，置于2 mL塑料管中。</li>
		<li>加入750 µL预冷的70/30 (v/v) 甲醇/氯仿溶液，涡旋振荡30 s，于-20 °C孵育2 h。 
		注意：所有溶剂和添加剂必须为LC-MS级。</li>
		<li>加入600 µL预冷水，于4 °C以17,900 ×g离心10 min。收集上层水-醇相并转移至新的2 mL管中。弃去下层氯仿相及中间相。</li>
		<li>将样品置于真空浓缩仪中处理3 h，以蒸发溶剂。</li>
		<li>将步骤7.1.4所得沉淀溶解于300 µL的50/50 (v/v) 乙腈/水溶液中，超声处理3 min。</li>
		<li>将溶液经0.2 μm膜过滤器过滤后，转移至透明固定式300 µL插件玻璃管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>次级代谢物提取
	<ol>
		<li>称取300 mg保存于-80 °C的、经真空农杆菌浸润表达∆87GAD65mut的红甜菜叶片粉末，置于15 mL塑料管中。</li>
		<li>加入3 mL甲醇，涡旋振荡30 s，于40 kHz超声处理15 min。 
		注意：所有溶剂和添加剂必须为LC-MS级。</li>
		<li>于4 °C以4,500 ×g离心10 min，将上清液转移至新的15 mL管中。</li>
		<li>取100 µL提取液，按1:3 (v/v) 比例用水稀释，经0.2 μm膜过滤器过滤。</li>
		<li>将溶液转移至透明固定式300 µL插件玻璃管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>极性脂质提取
	<ol>
		<li>称取200 mg保存于-80 °C的、经真空农杆菌浸润表达∆87GAD65mut的红甜菜叶片粉末，置于15 mL塑料管中。</li>
		<li>加入200 µL水，再加入2 mL甲醇，冰上静置1 h。 
		注意：所有溶剂和添加剂必须为LC-MS级。</li>
		<li>涡旋振荡30 s，于40 kHz超声处理15 min。</li>
		<li>于4 °C以4,500 ×g离心25 min。收集氯仿相并转移至2 mL管中。弃去上层水-醇相及中间相。</li>
		<li>将样品置于真空浓缩仪中处理3 h，以蒸发溶剂。</li>
		<li>将步骤7.3.5所得沉淀用600 µL甲醇溶解。</li>
		<li>取100 µL提取液，按1:5 (v/v) 比例用甲醇稀释，经0.2 μm膜过滤器过滤。</li>
		<li>将溶液转移至透明固定式300 µL插件玻璃管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 液相色谱-质谱分析及数据处理
<ol>
	<li>按照供应商的建议设置液相色谱-质谱（LC-MS）系统。 
	注意：液相色谱部分包括一个自动进样器，与高效液相色谱（HPLC）相连，用于次级代谢物和极性脂质分析时，在C18分析柱（150 × 2.1 mm，粒径3 µm）前连接一个C18保护柱（75 × 2.1 mm，粒径5 µm）；用于亲水相互作用液相色谱（HILIC）分析时，则在HILIC分析柱（150 × 2.1 mm，粒径2.7 µm）前连接一个HILIC保护柱（7.5 × 2.1 mm，3 µm）。质谱仪为离子阱质谱仪，配备电喷雾电离（ESI）或大气压化学电离（APCI）离子源。</li>
	<li>为高效液相色谱梯度洗脱准备合适的溶剂。用于初级代谢物分析时，以20 mM甲酸铵作为流动相A，95%乙腈、5%水加10 mM甲酸铵作为流动相B；用于次级代谢物分析时，以含0.05%甲酸的水溶液为流动相A，含0.05%甲酸的乙腈为流动相B；用于极性脂质分析时，以含0.05%甲酸的水溶液为流动相A，100%乙腈为流动相B。 
	注意：所有溶剂及添加剂必须为LC-MS级。</li>
	<li>使用表1中列出的梯度程序进行代谢物洗脱。设定流速为0.2 mL/min。对于次级代谢物和极性脂质，每份样品进样10 µL；对于初级代谢物，每份样品进样5 µL。</li>
	<li>通过混合不同样品的等量部分制备质量控制（QC）样品，以获得代表各实验条件的混合样本。在实验过程中分析QC样品，以监测仪器性能。具体而言，每分析10个样品后插入一次QC样品分析。</li>
	<li>对样品进行随机化处理，以避免仪器引入的系统性偏差。</li>
	<li>每完成9次分析后，立即插入一次色谱柱清洗程序和一次空白分析。 
	注意：清洗程序应采用两种溶剂之间的缓慢梯度，并在强洗脱剂高比例条件下进行等度洗脱。空白分析采用纯甲醇:水（50/50, v/v）进样，以提高后续分析中保留时间的重现性。</li>
	<li>根据表2中列出的参数，设置仪器在正负交替离子化模式下采集质谱数据。 
	注意：其他参数取决于具体的仪器平台。</li>
	<li>后续数据处理步骤请参照Dal Santo等人的文献9中所述方法进行。</li>
</ol>

<ol><li>Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Edible+plants+for+oral+delivery+of+biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究展示了针对自身免疫性糖尿病候选口服疫苗设计的初步分析。本实验的目标蛋白是一种突变型人源65 kDa谷氨酸脱羧酶，其表达与功能易于检测和定量12。该蛋白在不同可食用植物组织中的表达由载体介导5，这些载体可在极短时间内实现高水平的重组蛋白表达。最佳候选可食用植物宿主的筛选基于通过农杆菌介导的瞬时转化（agroinfiltration）在红甜菜和菠菜叶片中进行eGFP表达的结果。由于手工农杆菌转化过程耗时，且菠菜叶片组织较难渗透，该步骤可能成为工业化放大的关键限制因素。
确定收获时的具体天数（dpi），以获得重组蛋白的最高积累水平，是重组蛋白研究中的关键步骤，需根据具体情况逐一测试和筛选。通过对不同天数（4至12天）荧光蛋白表达水平的分析，可确定每种植物系统中表达量最高的时间点。在这些表达峰值日，比较增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的浓度（µg/g FLW），结果表明红菜头是重组蛋白产量表现最优的表达平台。
由于这一原因，进一步测试了...

自20世纪80年代植物分子生物学革命以来，基于植物的生物制药生产系统可被视为对基于微生物和哺乳动物细胞的传统系统的替代方案1。与传统平台相比，植物系统具有多项优势，其中最重要的是可扩展性、成本效益和安全性2。重组产物可从转基因植物组织中纯化后通过注射或口服途径给药，此外，转基因的可食用植物也可直接用于口服递送。口服途径可同时促进黏膜免疫和全身免疫，并避免了对针头和专业医疗人员的需求。此外，口服给药省去了复杂的下游加工过程，而该过程通常占重组蛋白总生产成本的80%3。上述所有优势可转化为生产、物资和人力成本的节约，从而降低每剂药物的成本，使药物能够为全球大多数人群所负担。
已开发出多种策略，用于在植物中实现稳定转化和瞬时表达，以生产重组蛋白。其中，一种高产量的去构建植物病毒表达系统（例如 magnICON）表现出优异的性能，可在相对较短的时间内实现重组蛋白的高产量4。已有大量报道采用基于植物病毒的表达&#160;系统在Nicotiana benthamiana植株中进行瞬时表达，该植物被视为标准的生产宿主。然而，由于其叶片中会积累生物碱及其他有毒代谢物，这种模式植物不被认为是一种可食用物种。
本研究中，我们比较了两种可食用植物系统——红甜菜（Beta vulgaris cv Moulin Rouge）和菠菜（Spinacea oleracea cv Industria），利用基于植物病毒的载体5表达谷氨酸脱羧酶65 kDa同工型（GAD65）的两种候选形式。GAD65是与1型糖尿病（T1D）相关的主要自身抗原，目前正处于人体临床试验阶段，旨在通过诱导免疫耐受来预防或延缓T1D的发生6。GAD65在植物中的生产已在模式植物如Nicotiana tabacum和N. benthamiana中进行了广泛研究4,5,6,7。本文描述了利用可食用植物物种在可直接口服的组织中生产该分子的方法。从技术角度出发，我们通过评估多个参数，研究并筛选了适用于农杆菌浸润的植物系统及用于GAD65生产的可食用植物平台：包括重组蛋白的表达水平、用于口服的植物组织中残留的微生物载量、GAD65对胃消化的耐受性，以及转基因植物与野生型植物之间的生物等效性。

<table><tbody><tr><td>0.2-&amp;mu;m Minisart RC4 膜过滤器</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>17764</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;ndash;巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>有毒；4% 与甘油、SDS 和 Tris-HCl 配制成上样缓冲液</td></tr><tr><td>4-吗啉乙磺酸（MES）</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td>pH 5.5</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>833924</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma</td><td>27221</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>色谱纯乙腈（LC-MS 级）</td><td>Sigma</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>乙酰丁香酮</td><td>Sigma</td><td>D134406</td><td>有毒 &amp;ndash; 0.1 M DMSO 储存液</td></tr><tr><td>细菌级琼脂</td><td>Applichem</td><td>A0949</td><td>15 g/L 与酵母提取物、NaCl 和胰蛋白胨配制 LB 培养基（NaOH 调节 pH 至 7.5）</td></tr><tr><td>甲酸铵</td><td>Sigma</td><td>70221</td><td></td></tr><tr><td>抗 eGFP 抗体</td><td>ABCam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>抗 GAD 65/67 抗体</td><td>Sigma</td><td>G5163</td><td></td></tr><tr><td>抗 LHCB2 抗体</td><td>Agrisera</td><td>AS01 003</td><td></td></tr><tr><td>亮蓝 R-250</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>C18 柱</td><td>Grace</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; -</td><td>Alltima HP C18（150 mm × 2.1 mm；3 &amp;mu;m）色谱柱</td></tr><tr><td>C18 保护柱</td><td>Grace</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; -</td><td>Alltima HP C18（7.5 mm × 2.1 mm；5 &amp;mu;m）保护&amp;nbsp;柱</td></tr><tr><td>CalMag Grower</td><td>Peter Excel</td><td>15-5-15</td><td>肥料</td></tr><tr><td>羧苄青霉素二钠</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td>有毒</td></tr><tr><td>化学发光成像系统</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td>ChemiDoc Touch 成像系统</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>去垢剂</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td>聚山梨酯 20</td></tr><tr><td>荧光读板仪</td><td>Perkin-Elmer</td><td>&amp;nbsp;1420-011</td><td>VICTOR 多功能计数器</td></tr><tr><td>色谱纯甲酸（LC-MS 级）</td><td>Sigma</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>15% 与 Tris-HCl、SDS 和 2&amp;ndash;巯基乙醇配制成上样缓冲液</td></tr><tr><td>GoTaq G2 聚合酶</td><td>Promega</td><td>M7841</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>HILIC 柱</td><td>Grace</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; -</td><td>Ascentis Express HILIC（150 mm × 2.1 mm；粒径 2.7 &amp;mu;m）色谱柱</td></tr><tr><td>HILIC 保护柱</td><td>Grace</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; -</td><td>Vision HT HILIC（7.5 mm × 2.1 mm；3 &amp;mu;m）保护&amp;nbsp;柱</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔抗体</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>避免反复冻融</td></tr><tr><td>HPLC 自动进样器</td><td>Beckman Coulter</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; -</td><td>System Gold 508 自动进样器</td></tr><tr><td>HPLC 系统</td><td>Beckman Coulter</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; -</td><td>System Gold 128 溶剂模块 HPLC</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Sigma</td><td>24137</td><td>易燃</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>Sigma</td><td>K4000</td><td>有毒</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>2 g/L 与 NaCl、Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和 KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 配制 PBS</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td>2.4 g/L 与 NaCl、Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和 KCl 配制 PBS</td></tr><tr><td>上样缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鲁米诺溶液</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td>使用 ECL Prime Western Blot 试剂盒配制溶液</td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>5Pascal</td><td>LIO5P0000DGT</td><td></td></tr><tr><td>质谱仪</td><td>Bruker Daltonics</td><td>&amp;nbsp; -</td><td>Bruker Esquire 6000；质谱仪配备 ESI 源，分析器为离子阱</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶封闭液</td><td>Ristora</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; -</td><td>在 PBS 中配制成 3%</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td>与 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 配制磷酸钠缓冲液</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>80 g/L 与 KCl、Na2HPO4 和 KH2PO4 配制 PBS；10 g/L 与酵母提取物、胰蛋白胨和细菌级琼脂配制 LB 培养基（NaOH 调节 pH 至 7.5）</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>&amp;nbsp;与 Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 配制磷酸钠缓冲液；14.4 g/L 配制 PBS</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Ge Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>猪胃黏膜来源胃蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>P7000</td><td></td></tr><tr><td>过氧化物酶底物 ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2235</td><td>避光材料</td></tr><tr><td>真空加压泵</td><td>VWR</td><td>111400000098</td><td></td></tr><tr><td>试剂 A</td><td>Sigma</td><td>B9643</td><td>将此试剂 50 份与试剂 B 1 份混合，配制 BCA 工作液</td></tr><tr><td>试剂 B</td><td>Sigma</td><td>B9643</td><td>将此试剂 1 份与试剂 A 50 份混合，配制 BCA 工作液</td></tr><tr><td>利福平</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td><td>有毒 &amp;ndash; 25 mg/mL DMSO 储存液</td></tr><tr><td>SDS（十二烷基硫酸钠）</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>易燃、有毒、腐蚀性—10% 储存液；3% 与 Tris-HCl、甘油和 2&amp;ndash;巯基乙醇配制成上样缓冲液</td></tr><tr><td>焦亚硫酸钠</td><td>Sigma</td><td>7681-57-4</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎系统</td><td>Soltec</td><td>090.003.0003</td><td>Sonica&amp;reg; 2200 MH；频率 40 kHz</td></tr><tr><td>注射器</td><td>Terumo</td><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp; -</td><td></td></tr><tr><td>透明固定式 300-&amp;micro;L 插入式玻璃管</td><td>Thermo Scientific</td><td>11573680</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>用 1N HCl 调节 pH 配制 Tris-HCl 缓冲液，使用 1.5 M Tris-HCl（pH 6.8）与 SDS、甘油和 2&amp;ndash;巯基乙醇配制上样缓冲液</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Formedium</td><td>TRP03</td><td>10 g/L 与酵母提取物、NaCl 和细菌级琼脂配制 LB 培养基（NaOH 调节 pH 至 7.5）</td></tr><tr><td>真空浓缩仪</td><td>Heto</td><td>3878 F1-3</td><td>Speed-vac 系统</td></tr><tr><td>色谱纯水（LC-MS 级）</td><td>Sigma</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Sigma</td><td>Y1333</td><td>5 g/L 与胰蛋白胨、NaCl 和细菌级琼脂配制 LB 培养基（NaOH 调节 pH 至 7.5）</td></tr></tbody></table>

红花菜豆中表达一种用于1型糖尿病的候选生物制药疫苗的瞬时表达研究

Transient Expression in Red Beet of a Biopharmaceutical Candidate Vaccine for Type-1 Diabetes

植物分子农业是指利用植物生产目标分子。在此领域中，植物既可作为生物反应器用于目标产物的生产及后续纯化，也可在使用可食用植物物种时，实现异源蛋白的直接口服递送。本研究中，我们采用基于去结构化植物病毒的重组DNA技术，结合真空渗透法递送，开发了一种以可食用植物系统为基础的1型糖尿病（T1D）候选口服疫苗。研究结果表明，红甜菜可作为表达人源T1D相关自身抗原的适宜宿主，该抗原被认为是T1D疫苗的潜在候选分子。我们对表达自身抗原的叶片进行了系统表征，包括其对胃消化的耐受性、残留细菌负荷以及次生代谢物谱，从而全面概述了植物用于异源蛋白直接口服递送的生产工艺。分析结果显示，在模拟胃消化条件下，冻干的候选口服疫苗几乎完全降解，提示在植物源性GAD疫苗的制备过程中需采用包封策略以提高其稳定性。

本研究展示了在可食用植物组织中开发口服疫苗的工作流程。重点在于目标蛋白在可食用宿主植物物种中的表达，以及对潜在口服疫苗的表征。
第一步是评估基于植物病毒的表达技术在可食用植物系统中生产重组蛋白的适用性。为此，我们首先选用eGFP作为模型蛋白，并在两种可食用的叶用植物系统——红甜菜和菠菜中进行表达。通过人工农杆菌浸润法，将携带eGFP重组表达载体的A. tumefaciens菌液接种至植物组织中。利用Western印迹分析（图1A,B,D,E）检测荧光蛋白的表达，并在紫外光下进行定量分析。结果显示，红甜菜系统的eGFP表达水平显著高于菠菜：红甜菜在接种后第9天（dpi）的eGFP表达量达到544.9 ± 10.9 µg/g鲜叶重（FLW）（图1C），而菠菜的最高表达量为113.4 ± 0.3 µg/g FLW，出现在接种后第11天（dpi）（<...

本文介绍了一种在可食用植物中制备针对1型糖尿病的口服候选疫苗的实验方案。

植物分子农业是指利用植物生产目标分子。在此领域中，植物既可作为生物反应器用于……

在利用植物生产重组蛋白的各种策略中，基于植物的去构建型VERS表达系统表现出更优越的性能，可在相对较短的时间内实现高产量。该技术在口服疫苗生产中的复制应用具有巨大潜力，有望在不久的将来成为传统疫苗的替代方案。经瞬时转化的冻干红甜菜叶片可积累足量的光敏抗原，适用于诱导口服耐受，以预防1型糖尿病。在对重组蛋白积累情况进行逐案评估后，该实验方案可推广至多种不同的可食用物种。演示该实验步骤的人员为 Edoardo Bertini、Mattia Santoni、Anna Cuccurullo 和 Roberta Zampieri。开始此实验步骤时，需按照文本方案中所述，在人工气候室中种植红甜菜和菠菜植株。种子萌发后，用市售肥料配制成每升含一克的溶液，每周施肥两次。进行农杆菌浸润实验时，使用五周龄的菠菜和六周龄的红甜菜植株。构建植物表达载体后，将三种农杆菌（A. tumefaciens）转化子接种于50毫升含有利福平（50 µg/mL）以及文本方案中所述载体特异性抗生素的LB培养基中。在28摄氏度下振荡培养过夜。次日，于4500 × g离心20分钟，收集菌体沉淀。将沉淀重悬于100毫升含10毫摩尔MES和10毫摩尔硫酸镁的浸润缓冲液中。将悬液在室温下孵育三小时。取含有此处所示模块之一的细菌悬液，与五端模块和整合酶模块按等体积混合。使用无针头的注射器，吸取五毫升悬液混合物。将注射器尖端抵住植物叶片的下表面，同时在叶片另一侧施加轻微的反向压力。每株植物从顶端开始，浸润前三个完全展开的叶片。用叶片茎上的纸质标签标记农杆菌浸润的叶片。然后将植株放回标准条件下的生长室中。在接种后第4至14天，采集农杆菌浸润的叶片，并用液氮速冻。将该植物组织在-80摄氏度下保存。首先，将三种 A.tumefaciens 转化子分别接种于 50 毫升含有利福平（50 微克/毫升）及相应载体特异性抗生素的 LB 培养基中，在 28 摄氏度下振荡培养过夜。次日，于 4500 × g 离心 20 分钟收集菌体沉淀。将菌体沉淀重悬于 1 升浸润缓冲液中，调节 OD600 至 0.35，并将菌悬液于室温孵育 3 小时。然后向每种悬浮液中加入0.01%的去垢剂。取含有此处所示模块之一的细菌悬浮液，与五端模块和整合酶模块按等体积混合。将一株六周大的红甜菜植株插入支架中。将支架倒置并放置在含有两升浸润液的烧杯上方，使叶片浸入浸润悬浮液中。随后，将带有浸没植株的浸润液转移至浸润室中并关闭浸润室。启动真空泵，打开浸润室上的真空进气阀。当室内的压力降至90毫巴时，保持该真空状态3分钟。然后释放真空45秒。当室内恢复至大气压后，打开真空室，将浸润过的植物从细菌溶液中取出。将植物放回生长室。在表达量达到峰值时，收获经农杆菌渗透的叶片，并按照之前所述方法用液氮速冻。首先，在表达高峰时收获经真空农杆菌渗透表达红甜菜来源的delta 87 GAD65mut的叶片，并用液氮速冻。在 -50 摄氏度和 0.04 毫巴条件下对冷冻的叶片进行 72 小时冻干处理，然后在 -80 摄氏度下保存。准备继续操作时，将叶片研磨成细粉，并在室温下置于含有硅胶的密封容器中，以防止受潮。进行胃消化模拟时，称取100毫克精细研磨的冻干红甜菜叶，重悬于6毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。使用6摩尔盐酸将样品pH值调节至2。加入来自猪胃黏膜的胃蛋白酶，使其终浓度为每毫升4毫克，同时加入10毫摩尔盐酸，使胃蛋白酶的终浓度为每毫升1毫克。在37摄氏度下振荡样品120分钟。接着，使用氢氧化钠将样品pH值调节至8，以灭活胃蛋白酶。将每份样品750 µL等分转移至微量离心管中，并在4摄氏度下以20,000 ×g离心20分钟。分别收集各上清液，并将每份沉淀重悬于一体积的上样缓冲液中。随后通过蛋白质印迹分析分别检测上清液和重悬的沉淀。对于细胞完整性分析，取两份100毫克精细研磨的冻干红甜菜叶片样品，均重悬于6毫升PBS中。使用6摩尔盐酸将一份样品的pH值调节至2。将两份样品在37摄氏度下振荡120分钟。然后将每份样品各取750微升分装至微量离心管中。在 20,000 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟。分别收集上清液，并将每份沉淀重悬于一体积上清液的上样缓冲液中。随后通过 Western 印迹分析检测上清液和重悬的沉淀。首先，称取100毫克精细研磨的冷冻干燥红甜菜叶片，加入八毫升无菌PBS重悬。涡旋震荡一分钟。取每种冷冻干燥叶片匀浆液一毫升，分别接种于五种已准备好的选择性LB培养基之一中。将平板在28摄氏度下孵育三天。之后，计数每块平板上生长的农杆菌菌落，并以每毫升冻干叶片匀浆液中的菌落形成单位数计算残余细菌载量。本研究中，一种口服疫苗在可食用的植物组织中得到开发。通过农杆菌介导的瞬时转化方法，将携带EGFP重组表达载体的根癌农杆菌悬浮液人工接种至红甜菜和菠菜植株。利用Western blot分析检测荧光蛋白的表达，并在紫外光下进行定量。红甜菜系统的EGFP表达水平较高，在接种后第9天达到约544微克/克鲜叶重量，而菠菜在接种后第11天的最高表达量仅为约113.4微克/克鲜叶重量。因此，选择红甜菜作为后续所有实验的表达宿主。随后用农杆菌（A.tumefaciens）悬浮液对植物进行真空渗透。在从农杆菌瞬时转化的叶片中提取TSP后，通过蛋白质印迹法（Western blot）分析样品，并采用密度分析法对重组蛋白进行相对定量。最后，评估潜在口服疫苗开发的相关参数。如图所示，目标蛋白在冻干过程后保持稳定。通过向冻干样品中加入猪胃酶胃蛋白酶，模拟胃消化过程，胃蛋白酶的终浓度为每毫升一毫克，或与总可溶性蛋白（TSP）的比例为1:20。两种消化处理条件均导致重组蛋白发生降解。胃蛋白酶消化后，沉淀样品中未检测到特异性信号，表明在冻干之后，植物细胞失去了完整性，从而导致目标蛋白降解。该实验步骤应根据植物种类优化真空渗透条件，并根据目标重组蛋白调整时间进程分析。所展示的实验流程也可用于生产用于口服递送的生物制药，例如疫苗和抗体。

transient-expression-red-beet-biopharmaceutical-candidate-vaccine-for

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

1型糖尿病生物制药候选疫苗在红甜菜中的瞬态表达

我们描述了通过使用辅助依赖型腺病毒载体（HDAd）将Neurogenin3（Ngn3）和Betacellulin（Btc）基因转移至链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠体内，从而诱导肝脏中新生胰岛的形成，并实现高血糖的逆转。本方法利用了辅助依赖型腺病毒载体在体内高效转导以及外源基因持久表达的优势。...

通过辅助依赖型腺病毒载体介导的基因转移在糖尿病小鼠肝脏中形成新胰岛

我们提供了一种可重复的方法，通过过继转移针对胰岛抗原的特异性初级 CD4+ T 细胞，在两周内诱导小鼠产生 1...

通过过继性转移致糖尿病性CD4+ T细胞在小鼠中加速诱导1型糖尿病

瞬时蛋白表达在 烟草属 基于真空渗透的植物 农杆菌...

农杆菌介导的烟草属植物瞬时蛋白表达的优化与应用

本研究比较了不同生产平台中目标人源重组蛋白的表达。我们重点探讨了基于传统发酵罐的培养系统和植物系统，分别描述了每种系统的建立过程，并根据已报道的结果，阐明了各平台固有的局限性和优势。...

不同生物反应器中重组蛋白表达的比较分析：细菌、昆虫细胞与植物系统

本文介绍了一种利用虫蜕激素类似物特普呋酯处理，通过pEUI(+)单基因开关调控外源基因表达的实验方案。...

基于蜕皮激素受体的单基因开关用于稳健、可逆且泄漏极低的外源基因精确表达

本方案详细描述了用于表达免疫调节剂的溶瘤病毒的生成及其体外表征的工作流程，以编码双特异性T细胞衔接器的麻疹病毒为例。该方法可应用于其他载体平台和转基因，从而加速新型免疫病毒治疗药物的临床转化开发。...

用于肿瘤靶向免疫调节的副粘病毒：体外设计与评估

本文介绍了一种利用携带短发夹RNA（shRNA）的慢病毒转导分散的人胰岛细胞，从而制备基因修饰的人源假胰岛的实验方案。该方案使用常规易得的酶和培养器具，操作简便，可生成适用于功能学和形态学研究的基因修饰人源假胰岛。...

利用慢病毒介导的基因沉默技术在低吸附培养板中制备的人类假胰岛中的应用

本文介绍了一种用于生成抗原特异性CD8...

用于自身免疫性糖尿病模型功能检测的高效生成抗原特异性原代小鼠细胞毒性T细胞

本方案描述了一种简单且微创的方法，用于在非肥胖型糖尿病（NOD）-重度联合免疫缺陷小鼠体内移植并成像NIT-1细胞，这些小鼠经来自自发性糖尿病NOD小鼠的纯化脾细胞攻击后建立疾病模型。...

生物发光监测小鼠过继转移自身免疫性糖尿病模型中的移植物存活

本方案概述了使用非整合型mRNA生成瞬时嵌合抗原受体（CAR）T细胞以用于癌症免疫治疗的详细步骤，并提供了评估CAR-T细胞及其细胞毒功能的可靠方法。...

一种利用mRNA生成非病毒性短暂嵌合抗原受体T细胞用于癌症免疫治疗的方法

了解利用红甜菜叶片瞬时转化技术生产1型糖尿病口服疫苗候选药物的方法。该技术通过植物表达系统高效积累重组蛋白光抗原，为开发可食用植物源疫苗提供新策略。

红花菜豆中表达一种用于1型糖尿病的候选生物制药疫苗的瞬时表达研究

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