人主动脉周围血管脂肪前体细胞的分化潜能

血管周围脂肪组织包绕着血管，并调节心血管生理功能。本方案用于解答与人类脂肪前体细胞在血管微环境中的功能相关的关键问题。脂肪前体细胞因其解剖位置不同而存在差异。

我们证明，可以从患有心血管疾病的患者的血管周围脂肪组织中成功分离出一群多能祖细胞。演示该实验操作的是本实验室的医学生Spencer Scott。按照文本方案所述，从手术室获取一块500毫克的人类血管周围脂肪组织（PVAT）。

将新鲜的人类PVAT从DMEM转移至含有25毫升抗生素溶液的50毫升锥形管中。在4摄氏度下振荡孵育20分钟。在PVAT处于抗生素溶液中的同时，将一份解离缓冲液在37摄氏度下解冻。

向 5 毫升解离缓冲液中加入 50 微升 100 倍抗生素/抗真菌溶液，并使用 0.22 微米注射器滤器进行灭菌。将 1 毫升明胶溶液加入 24 孔板的一个孔中。在超净工作台内，使用无菌镊子和剪刀将 PVAT 从抗生素溶液转移至无菌培养皿中。

向组织中加入1 mL预热的解离缓冲液。使用无菌镊子和解剖剪将整个组织精细剪碎成匀浆。将1 mL匀浆转移至4 mL解离缓冲液中。

将离心管置于预热至37摄氏度、转速为200 rpm的摇床中，水平孵育1小时。1小时后，应无可见的组织碎片，溶液呈现浑浊的细胞悬液。将溶液经置于50毫升锥形管上方的70微米细胞滤筛过滤。

用额外的 10 毫升抗生素溶液冲洗滤网，以尽可能收集全部细胞。切勿挤压滤网。现在将细胞在摆桶式离心机中以 300 × g 离心 12 分钟，形成沉淀。

离心后，离心管将分为三层：上层为含有脂肪细胞的脂肪层，中间为界面层，下层为沉淀。该沉淀即为基质血管组分，包含内皮细胞、免疫细胞、血细胞及前体细胞。将沉淀用 10 毫升 HBSS 重悬，并在 300 × g 条件下离心 5 分钟。

用 HBSS 重复此步骤，共洗涤两次。现在从 24 孔板中吸除明胶。用 HBSS 轻轻洗涤 1 次，以去除未结合的明胶。

将含有完整红细胞的基质血管组分沉淀物用1毫升培养基重悬，并接种至明胶包被的培养孔中。然后向培养基中加入人FGF2，使其终浓度达到25纳克/毫升。于37摄氏度、5%CO2条件下培养24小时。

细胞培养24小时后，移除生长培养基，并用HBSS洗涤细胞五次。此洗涤步骤可去除红细胞和死细胞。然后向每孔加入1毫升新鲜生长培养基，其中添加25纳克/毫升FGF2。

每48小时更换一次培养基，每次补充新鲜的FGF2至终浓度为25纳克/毫升。在组织块贴壁后7至10天，当细胞达到100%汇合时进行传代。操作时，吸除生长培养基，用1毫升HBSS将单层细胞洗涤两次。

吸弃各孔中的所有HBSS，加入数滴细胞解离液。轻敲并旋转培养板数次，于37°C、5% CO2条件下孵育5至7分钟，使细胞脱落。随后向脱落的细胞中加入约1毫升新鲜培养基。

将脱离的细胞各500微升分别加入含500微升生长培养基和25纳克FGF2的24孔板的两个孔中。同时，按照文本方案中所述培养人骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSC）或MSC集落。将适当数量的骨髓和PVAT来源细胞接种至12孔板的每孔中。

对于成脂和成骨诱导条件，每孔接种约 200,000 至 225,000 个细胞；而对于软骨诱导条件，每孔接种 150,000 至 175,000 个细胞。随后，加入细胞解离液，将人外周脂肪组织来源祖细胞群体和人骨髓间充质干细胞群体的细胞分别解离。

将细胞在37摄氏度、5% CO2条件下于解离溶液中孵育5分钟。将细胞悬液转移至 separate 15毫升锥形管中。在500 × g下离心7分钟，使细胞沉淀。

然后将细胞重悬于 1 毫升 PBS 中，使用血细胞计数板估算细胞数量。将细胞按之前方法接种至 12 孔板中。为诱导和非诱导的成脂分化及成骨分化条件分别提供独立的培养孔。

向诱导条件的每个孔中加入1.5毫升脂肪生成和成骨诱导培养基。然后向非诱导条件的每个孔中加入1.5毫升脂肪生成和成骨非诱导培养基。将脂肪生成和成骨诱导及非诱导的细胞群体置于37°C和5%CO2条件下开始孵育。

将剩余的人体PVAT前体细胞和人骨髓MSCs在500 × g条件下离心7分钟。确定重悬剩余骨髓及PVAT来源细胞沉淀所需的体积，以达到每10微升含100,000个细胞的密度。随后，将沉淀重悬于计算体积的MSC成软骨诱导培养基中。

使用移液器轻轻吹打细胞悬液，上下吹打数次，确保细胞均匀分布。然后吸取10 µL浓缩的细胞悬液，滴加到每个孔的中央，形成含有100,000个细胞的微团。在相邻的孔中加入1 mL无菌水，以防止蒸发。

将微团培养物在37摄氏度、5% CO2条件下孵育2小时，以使微团聚集。2小时后，向诱导组孔中轻轻加入含有10纳克/毫升人TGF-beta-1的软骨诱导分化培养基。随后，向非诱导组孔中轻轻加入1.5毫升非诱导培养基。

将诱导成软骨条件下的微团块刮取或倒入包埋盒中，以便按照文本方案所述进行脱水、包埋和染色。脂肪生成分化研究与人骨髓来源的间充质干细胞及血管周围脂肪组织来源的前体细胞平行进行。在非诱导条件下，未见脂质积聚。

这与使用油红O染色中性脂质后显示的诱导条件形成对比。尽管来源于人主动脉PVAT的细胞分化程度更高，但两种来源的人体细胞均表现出向脂肪细胞系分化的潜能。对来源于人骨髓的间充质干细胞及PVAT来源的细胞均采用成骨分化方案。未诱导的细胞不被茜素红染色。

经过成骨分化方案处理后，人源MSCs形成了可被茜素红染色的钙化结节，而人源主动脉PVAT细胞则未形成。来源于人骨髓MSCs和人PVAT的细胞均表现出软骨分化特征，在微团中可见大量胶原蛋白积聚。微团由人骨髓MSCs形成，而来源于主动脉PVAT的细胞在微团中也表现出大量糖胺聚糖积聚，这由阿利新蓝染色结果所证实。

形态学上，可观察到类似于陷窝的结构，细胞位于由胶原沉积物包围的腔隙中。在进行酶解离之前，必须将血管周围脂肪组织充分剪碎，并确保每种细胞谱系分化实验所接种的细胞密度适当。通过该方法分离的细胞，应采用定量PCR联合Western印迹和流式细胞术，对来自血管周围脂肪组织和骨髓来源的分化后祖细胞的谱系特异性标志物进行表征。

通过这一技术，我们能够开始理解肥胖过程中调控血管周围脂肪组织扩张和功能障碍的机制，以及前体细胞对血管功能和心血管疾病的影响。