Name: 神经系统疾病中的脂质组学和转录组学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学习神经系统疾病脂质组学和转录组学联合分析方法，使用小鼠脑组织样本进行脂质与RNA共提取。该技术可同时检测炎症相关脂质和神经活动标志物，适用于癫痫等神经疾病模型研究。

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我们谨将本文献给埃尔梅琳达·洛马佐博士。在本文稿即将完成之际，埃尔梅琳达·洛马佐博士不幸逝世。她以满腔热忱投身科学事业，无私地参与团队合作，致力于实现富有意义的科研目标，是科学精神的典范。她始终怀抱着为人类更大福祉作出实质性贡献的梦想。无论科学探索与人生道路多么艰辛，她善良的本性始终未曾动摇。她将永远是我们心中不可替代的宝贵存在。
Julia M. Post 的研究由约翰内斯·古腾堡-美因茨大学医学中心转化神经科学重点研究项目（FTN）资助，目前由SPP-2225 EXIT项目资助至LB。Raissa Lerner 的研究部分由德国心血管研究中心（DZHK）项目81X2600250资助至LB以及脂质组学核心设施资助。本研究的部分经费由约翰内斯·古腾堡-美因茨大学医学中心生理化学研究所脂质组学核心设施以及医学中心内部资金（资助至LB）提供。

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<li>Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+brain+and+peripheral+plasticity+of+the+lipidome+in+acute+kainic+acid-induced+epileptic+seizures+in+mice+via+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).</li>
<li>Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+lipidomics+on+a+LTQ+Orbitrap+mass+spectrometer+by+successive+switching+between+acquisition+polarity+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes.</a> Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).</li>
<li>Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+analytical+methods+for+eicosanoids+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).</li>
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<li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).</li>
<li>Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+temporal+lobe+epilepsy+following+systemic+chemoconvulsant+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).</li>
<li>Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-Neuron+Communication+in+Epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia-Neuron Communication in Epilepsy.</a> Glia. 65 (1), 5-18 (2017).</li>
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<li>Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+lipidomic+and+transcriptional+changes+of+prophylactic+PEA+administration+in+control+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 527(2019).</li>
<li>Post, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiepileptogenic+Effect+of+Subchronic+Palmitoylethanolamide+Treatment+in+a+Mouse+Model+of+Acute+Epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).</li>
<li>Schauwecker, P. E., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+determinants+of+susceptibility+to+excitotoxic+cell+death%3A+Implications+for+gene+targeting+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).</li>
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<li>Konsman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).</li>
<li>Spijker, S. Dissection of Rondent Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpijker%2C+S+%22Neuroproteomics%22">Neuroproteomics</a>. Li, K. W. 57, 13-27 (2011).</li>
<li>Gross, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+lipidomics+through+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">The evolution of lipidomics through space and time.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).</li>
<li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li>
<li>Abbott, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high-throughput+lipid+extraction+method+for+the+analysis+of+human+brain+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids.</a> Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).</li>
<li>Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+extraction+by+methyl-tert-butyl+ether+for+high-throughput+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics.</a> Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述的神经脂质组学与转录组学方法可用于在脑组织及外周器官中，以高空间分辨率和低空间分辨率研究任何疾病或健康发育过程。由于优化了血浆采样与处理流程，可从用于组织脂质组学和转录组学分析的同一动物个体中获取血浆样本，进而开展血浆脂质组学分析，从而提高组织与血液分子关联性分析及生物标志物发现的可靠性。通过单独应用或组合应用这三种实验方案，可获得广泛的数据集，不仅有助于在特定研究背景（动物模型实验）下探究神经系统疾病，也有助于跨实验模型及不同实验背景之间的比较研究。此外，采样、样本处理和分子分析的高度标准化，有助于分子数据的高重复性，从而在不同研究之间及不同实验室之间可靠地比对分子变化。
然而，要实现这一目标，关键在于建立一种实验设计，以最大限度地发挥既定研究目标的检测潜力。为了在实验组之间对分子变化进行可靠的比较，建议每组至少使用十只动物，以弥补个体动物的变异性以及脂质水平的生物学差异范围。当动物获取和/或动物操作的后勤条件受限时，每组至少使用六只动物是确保统计分析可靠性的必要条件。样本量计算时需考虑模型相关的死亡率（即尽管模型可能存在一定的死亡率，每组仍至少需要六只、理想情况下十只动...

脂质功能及其在神经系统疾病发生和发展中作用的最新研究进展，为发现新的治疗靶点和阐明疾病机制开辟了新的研究与开发方向1。现代分子成像技术（如质谱成像和高阶质谱分析）已明确揭示不同脑区之间存在脂质组成差异，这使得脂质研究的范式从全脑水平转向功能上独立且解剖上分立的特定脑区。由于不同脑区的脂质组成存在差异，促使人们重新思考在脑损伤或刺激条件下，功能各异的脑区中膜脂质敏感性及下游脂质信号传导的机制。因此，脂质研究方法亟需进一步发展，以应对组织样本量少所带来的高空间分辨率检测与定量挑战，同时实现对细胞膜和信号通路中多种脂质成分的联合分析。此外，明确参与调控脂质水平与功能的酶、脂质配体及其受体，对于阐明神经系统疾病中受影响的信号通路、并指导病理生理背景下新的机制性研究至关重要。
除了提高大脑空间分辨率外，新型神经脂质组学方法的发展还面临两大主要困难。首先，与膜结构脂质相比，脂质信号分子通常丰度极低。其次，脂质组具有高度的结构异质性，难以通过单一分析方法进行解析。因此，提取和分析方法需针对不同类别的脂质进行定制，通常在不同的组织样本中分别进行2。霰弹枪脂质组学方法3是快速揭示膜脂质广泛谱型的优秀工具，而靶向发现与定量质谱方法则因其更高的灵敏度和选择性，被广泛用于研究低丰度信号脂质，包括：i）炎症性脂质和ii）参与神经元活动调节的脂质，如内源性大麻素（eCBs）、氨基酸连接脂质等4,5。为了全面涵盖神经系统疾病模型中脑区细胞膜和&#160;信号水平上的脂质变化，通常需在不同组织样本中分别进行脂质提取与分析，这些样本可能来自不同动物批次、不同半脑，或通过将较大组织区域分割为多个部分获得。当同时关注酶和受体的mRNA水平时，其检测通常也需要独立的组织样本。例如，对膜脂质、内源性大麻素和mRNA的研究将需要三个不同的组织样本（例如，两个样本分别用于两种脂质提取方法——膜脂质和信号脂质——以及后续的两种脂质分析方法，一个样本用于mRNA分析）。对炎症性脂质和内源性大麻素的研究则分别需要两个独立的组织样本、提取方法和分析方法。另一个例子是对脑组织穿孔或激光显微切割样本中mRNA及任一类脂质的研究，这相应地需要两只动物，以从每个脑（亚）区获取两个样本。在这种情况下，结果常常出现较大程度的变异性或重复性差，其来源主要是生物学变异和/或组织异质性。基于上述多分子分析在实际操作中的局限性，尤其是在脑组织高空间分辨率研究中的挑战，我们设计了一种三模块神经脂质组学方案，包括：1）采用LC/MRM技术对炎症性脂质（如二十碳类化合物（eiCs））以及参与神经元活动调节的脂质（如eCBs）进行共提取与共分析2；2）对磷脂（PLs）和eCBs进行共提取，随后进行多扫描LC/MRM及前体离子/中性丢失扫描分析2；以及3）对膜（磷）脂质、eCBs和mRNA进行双相提取，随后进行LC/MRM和qPCR或RNA测序分析6。根据所研究的神经系统疾病及目标脑区的具体生物学问题，可在同一组织样本上联合应用第一和第二种方案，或第一和第三种方案，适用于约4 mg重的组织。第一和第三种方案可独立用于约2 mg的组织。第二种方案则可应用于低至0.5 mg的组织。无论选择哪种神经脂质组学方案模块，组织取样与分析前处理、脑组织分离与区域解剖，以及动物模型处死的操作流程在所有三个模块中均标准化且保持一致。在我们对神经系统疾病的研究中，始终同时采集并分析与疾病病理后果相关的外周器官组织，使用上述模块化方案进行检测。此外，常规采集血液样本进行血浆脂质组学分析，以期为神经系统疾病的转化应用提供读出指标。本文所介绍的模块化脂质组学方案具有高度通用性：可扩展至更大组织量，并可广泛适用于几乎所有组织类型和疾病。在神经系统疾病中应用该模块化方案（图1）时，任何标准化的啮齿类动物神经疾病发生与进展模型，如创伤性脑损伤、帕金森病、阿尔茨海默病或癫痫模型，均可适用。
这些方案已广泛应用于研究海人酸（kainic acid, KA）诱导的小鼠癫痫模型在癫痫急性期的组织脂质组和/或转录组变化2,7，该模型因其与人类颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy, TLE）高度相似，被广泛用于临床前研究8,9,10,11。利用这些方案，研究人员在同一癫痫小鼠模型中评估了棕榈酰乙醇胺（Palmitoylethanolamide, PEA）等药物的治疗潜力12,13。该研究在癫痫发作强度达到峰值的时间点（发作诱导后60分钟），以及在KA诱导癫痫发作后不同时间点（20、60、120和180分钟）进行急性与亚慢性PEA治疗期间，以高和低空间分辨率检测了脑组织及外周组织中的脂质和mRNA变化，覆盖了癫痫急性期的时间窗口。在各个时间点采集了未治疗的KA注射小鼠、急性及亚慢性PEA处理小鼠，以及溶剂对照和PEA溶剂对照小鼠的血浆、脑组织和外周器官样本12,13，并对其进行上述分子分析。分子数据与通过癫痫评分获得的行为表型，以及基于免疫组织化学的神经退行性过程数据进行了关联分析，以揭示癫痫急性期的进展机制及PEA缓解该过程的潜在作用。

<table><tbody><tr><td>12(S)-HETE</td><td>Biomol</td><td>Cay10007248-25</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>12(S)-HETE-d8</td><td>Biomol</td><td>Cay334570-25</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>1200系列液相系统</td><td>Agilent</td><td></td><td>仪器设备/LCMS</td></tr><tr><td>2100生物分析仪</td><td>Agilent</td><td></td><td>仪器设备/qPCR</td></tr><tr><td>5(S)-HETE-d8</td><td>Biomol</td><td>Cay 334230</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>ABI 7300实时荧光定量PCR仪</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>仪器设备/qPCR</td></tr><tr><td>乙腈LC-MS级Chroma Solv溶剂</td><td>Honeywell</td><td>9814920</td><td>溶剂/LCMS</td></tr><tr><td>棕色Eppendorf管</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>样品制备</td></tr><tr><td>Analyst 1.6.2软件</td><td>AB SCIEX, Darmstadt</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>分析天平</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>仪器设备/样品制备</td></tr><tr><td>花生四烯酸-d8质谱标准品</td><td>Biomol</td><td>Cay-10007277</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>Bessmann组织研磨器</td><td>Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands)</td><td></td><td>仪器设备/样品制备</td></tr><tr><td>Bino</td><td>Zeiss</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>裂解型Caspase 3抗体</td><td>Cellsignaling</td><td>9661S</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>Leica CM3050 S冷冻切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>仪器设备/样品制备</td></tr><tr><td>CTC HTC PAL自动进样器</td><td>CTC Analytics AG</td><td></td><td>仪器设备/LCMS</td></tr><tr><td>Dumont弯头镊子Dumoxel #7</td><td>FST</td><td>11271-30</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>Dumont超细尖头镊子#5SF（x2）</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>EDTA 1000 A R&amp;ouml;hrchen</td><td>Kabe Labortechnik</td><td>078001</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>EP-1 EconoPump泵</td><td>BioRAD</td><td>700BR07757</td><td>仪器设备/样品制备</td></tr><tr><td>镜面抛光精细镊子</td><td>FST</td><td>11412-11</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>精细直头锐利虹膜剪</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>碳化钨直头精细剪刀</td><td>FST</td><td>14568-09</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>虹膜刮匙</td><td>FST</td><td>10094-13</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>红藻氨酸</td><td>Abcam</td><td>ab120100</td><td>抗癫痫药物</td></tr><tr><td>Lipid View软件</td><td>AB SCIEX, Darmstadt</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>LPC 17:0</td><td>Avanis Polaris</td><td>855676P</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>LPC 18:0</td><td>Avanis Polaris</td><td>855775P</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>Luna 2.5&amp;micro;m C18(2)- HAST 100A液相色谱柱</td><td>Phenomenex</td><td>00D-4446-B0</td><td>仪器设备/LCMS</td></tr><tr><td>放大照明灯</td><td>Maul GmbH</td><td></td><td>仪器设备/样品制备</td></tr><tr><td>甲醇LC-MS级Chroma Solv 99.9%</td><td>Honeywell</td><td>9814920</td><td>溶剂/LCMS</td></tr><tr><td>Motic相机</td><td>Motic</td><td></td><td>显微镜</td></tr><tr><td>MTBE</td><td>Honeywell</td><td>34875-1L</td><td>溶剂/LCMS</td></tr><tr><td>MultiQuant 3.0定量分析软件包</td><td>AB SCIEX, Darmstadt</td><td></td><td>软件</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>仪器设备/qPCR</td></tr><tr><td>PA 16:0-18:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>840857P</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>PA 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1404</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>棕榈酰乙醇胺</td><td>Biomol</td><td>Cay90350-100</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>棕榈酰乙醇胺-d5</td><td>Biomol</td><td>Cay9000573-5</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>PC 16:0-18:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>850457P</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>PC 16:0-18:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>850457P</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>PC 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1004</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>PE 16:0-18:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>850757P</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>PE 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1104</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>PG 16:0-18:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>840457P</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>PG 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1204</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>PI 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1504</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>Precellys 24</td><td>Peqlab</td><td></td><td>仪器设备/样品制备</td></tr><tr><td>Precellys陶瓷研磨珠&amp;uuml;</td><td>Peqlab</td><td>91-pcs-ck14p</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>Precellys钢珠2.8 mm</td><td>Peqlab</td><td>91-PCS-MK28P</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>Precellys陶瓷研磨套件1.4 mm</td><td>VWR</td><td>91-PCS-CK14</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>前列腺素D2</td><td>Biomol</td><td>Cay 12010</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>前列腺素D2-d4</td><td>Biomol</td><td>Cay 312010</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>前列腺素E2</td><td>Biomol</td><td>Cay10007211-1</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>前列腺素E2-d9</td><td>Biomol</td><td>Cay10581-50</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>PS 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1304</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>Q Trap 5500三重四极杆线性离子阱质谱仪</td><td>AB SCIEX</td><td>AU111609004</td><td>仪器设备/LCMS</td></tr><tr><td>实时荧光定量PCR系统</td><td>Appliert Biosystem</td><td></td><td>仪器设备/qPCR</td></tr><tr><td>消退素D1</td><td>Biomol</td><td>Cay10012554-11</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>RNeasy Mini试剂盒 - 无RNA酶的DNase试剂组（50次）</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>Security Guard预柱</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>仪器设备/LCMS</td></tr><tr><td>Shandon盖板</td><td>Thermo Fisher</td><td>72110017</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>Shandon载玻片架及盖</td><td>Thermo Fisher</td><td>73310017</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>SM 18:0</td><td>Avanis Polaris</td><td>860586P</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>SM d18:1/12:0</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-2312</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>直头平滑标准镊子</td><td>FST</td><td>11016-17</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>ToughCut标准型手术剪</td><td>FST</td><td>14130-17</td><td>手术工具</td></tr><tr><td>T3000 PCR仪</td><td>Biometra</td><td></td><td>仪器设备/qPCR</td></tr><tr><td>血栓素B2</td><td>Biomol</td><td>Cay19030-5</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>血栓素B2-d4</td><td>Biomol</td><td>Cay319030-25</td><td>脂质标准品</td></tr><tr><td>Tissue Lyser II组织研磨仪</td><td>Qiagen/ Retsch</td><td>12120240804</td><td>仪器设备/样品制备</td></tr><tr><td>Tissue Tek</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>甲苯胺蓝</td><td>Roth</td><td>0300.2</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>Vapotherm</td><td>Barkey</td><td>4004734</td><td>仪器设备/样品制备</td></tr><tr><td>水LC-MS级Chroma Solv溶剂</td><td>VWR</td><td>9814920</td><td>溶剂/LCMS</td></tr></tbody></table>

神经疾病中的脂质组学与转录组学

Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases

脂质作为脑部损伤或诱发神经系统疾病的刺激因素的主要界面，同时也是具有多种信号传导或配体功能的脂类物质的储存库，可能在疾病的发生与发展过程中发挥关键作用。脂质常在症状出现前即发生改变，因此正逐渐成为药物靶点和生物标志物的重要来源。许多神经系统疾病均表现出神经炎症、神经退行性变以及神经元兴奋性异常等共同特征，这些过程部分受到特定脂质信号系统的调控。多种脂质在合成上的相互依赖性和关联性，促使研究需采用多脂质、多酶及多受体联合分析策略，以揭示不同神经系统疾病背景下的共性与特异性，并加速解析疾病发生与进展的机制。明确脂质在不同脑区中的特定作用，有助于推进与神经系统疾病相关的脂质分子表型及形态学特征的确定。
本文介绍了一种模块化实验方案，适用于分析与特定神经系统疾病和/或状态相关的离散脑区中提取的膜脂质、下游脂质信号分子，以及介导其功能的酶和介质的mRNA。为确保准确的比较性脂质组学分析，本方案对以下流程和操作标准进行了优化和标准化：i）脑组织取样及目标脑区的分离；ii）多种脂质信号分子与膜脂质的共提取；iii）脂质与mRNA的双相提取；iv）采用液相色谱-多反应监测（LC/MRM）进行定量分析；v）标准mRNA表达谱分析。该流程适用于通过功能离散脑亚区取样（如脑组织穿孔法）所获得的微量组织样本，从而避免因组织异质性或动物个体差异导致的多分子分析偏差。为揭示神经系统疾病的外周影响，并建立神经系统疾病状态的可转化分子读数，本文还开展并描述了外周器官的取样与处理、后续脂质组学分析以及血浆脂质组学分析。本方案以急性癫痫小鼠模型为例进行了演示。

可根据具体研究目的，以不同方式组合本文所述的实验方案，例如动物模型的选择、取样途径、提取方法及分析方法（图1）。
为了确定急性癫痫发作状态下脑内和外周组织中脂质水平随时间的变化，并揭示花生四烯酸乙醇胺（PEA）潜在的抗癫痫作用13及其对脑和外周脂质组变化的影响，本研究设置了三个实验动物组，分别给予溶剂对照、KA（诱导急性癫痫）以及PEA（作为候选抗癫痫药物）。PEA通过腹腔注射（i.p.）给药，于KA注射前给予（例如，急性治疗采用单次PEA注射，亚慢性治疗则给予两次PEA注射）。为满足治疗后5天进行多种分子分析和/或免疫组织化学染色的需要，动物实验根据需求重复进行（图2）。
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本文介绍了一种模块化方案，用于神经系统疾病小鼠模型中的组织脂质组学和转录组学以及血浆脂质组学研究，重点针对与炎症和神经元活动相关的脂质、膜脂质、下游信使分子，以及编码脂质功能相关酶/受体的mRNA。文中概述了样本采集、样品处理、提取及定量分析的操作流程。

脂质作为脑部损伤或诱发神经系统疾病的刺激因素的主要界面，同时也是合成具有……功能的脂质的储存库

该模块化方案使得能够在特定组织区域和血液中，以每份样本更高的定性和定量数据输出，研究由结构脂质、信号脂质和/或RNA所介导的多种分子事件。该方法适用于任何实验模型，也可用于人体组织样本和血液。演示本实验操作的人员包括：技术员Claudia Schwitter、研究生Julia Post，以及我课题组的博士后Raissa Lerner。首先，取先前分离的、完整的、冷冻的小鼠脑组织，这些小鼠患有急性期及预防性治疗的红藻氨酸诱导的癫痫。将脑组织安装至冷冻切片机的固定装置上。设置切片厚度为 50 µm，并在修片模式下对脑组织进行切片，接近目标区域。接近目标区域时，将切片厚度设为18至20微米。为定位目标亚区，使用甲苯胺蓝对脑切片进行染色。在显微镜下观察染色切片，识别需打孔的感兴趣区域，并参考小鼠脑图谱确定相应的大脑解剖区域。使用样品打孔器采集直径为 0.8 至 1.0 毫米的组织样本。将用于内源性大麻素和二十碳脂质联合提取的样本转移至预冷的 2 毫升棕色管中，每管加入七颗预冷的钢珠。对于磷脂和内源性大麻素联合提取，以及脂质与 RNA 联合提取，需将样本转移至含有陶瓷珠的 2 毫升无 RNase 的提取管中。在冷室中称量冷冻组织穿孔样本，并立即进行提取，或在 -80 °C 下冷冻保存。为从脑组织块、穿孔样本或组织粉末样本中进行内源性大麻素和二十碳衍生物的液-液脂质共提取，将含有组织样本和7个钢珠的提取管置于冰上。加入600 µL预冷的甲基叔丁基醚（MTBE）和50 µL含有内标物的冰冻乙腈-水溶液。加入 400 微升 0.1 摩尔的甲酸后，使用组织破碎仪匀浆 30 秒至 1 分钟。在 4 摄氏度下以 5,000 × g 离心 15 分钟。将样品置于 -80 摄氏度的冷冻机中冷冻 10 分钟，以冻结下层水相，从而便于上层有机相的转移。将上层有机相转移至新的1.5毫升棕色管中，在37摄氏度下用温和的氮气流吹干10分钟，然后用50微升乙腈-水溶液重新溶解，用于后续分析。将水相在-20或-80摄氏度下保存，用于后续蛋白质含量分析。为从血浆样本中共同提取内源性大麻素和二十碳衍生物，请将冷冻的血浆样本置于冰上，使其完全解冻。加入800微升甲基叔丁基醚（MTBE）和50微升含有内标物的乙腈水溶液，内标物浓度通过参考血浆样本优化确定。加入600微升0.1摩尔的甲酸溶液，在4摄氏度下涡旋振荡2分钟。在4摄氏度下以4,000 × g离心15分钟。将有机相转移至新的离心管中。在37摄氏度下用温和的氮气流吹干，然后用50 µL乙腈-水溶液重新溶解，用于液相色谱-多反应监测分析。为从脑区、打孔组织或其他组织粉末样品中共同提取磷脂和内源性大麻素，请将含有组织样品和陶瓷珠的提取管置于冰上。加入800微升甲基叔丁基醚和甲醇的混合液，以及含有内标物的10微升甲醇。然后，加入200微升含有25微摩尔四氢脂抑素/URB597和50微克/毫升BHT的0.1%甲酸溶液。使用组织匀浆器匀浆后，在4摄氏度下以5,000 × g离心15分钟。将上层有机相转移至新离心管中，在37摄氏度下用温和的氮气流吹干，然后用90微升甲醇重新溶解该脂质提取物。若立即进行后续操作，可取部分脂质提取物，加入10%的水，取10微升注入液相色谱-质谱仪（LC/MS）用于磷脂分析。如需进一步进行内源性大麻素分析，则继续进行下一步操作。取一份脂质提取物，蒸发至干燥，然后用乙腈-水重新溶解。为从组织样本中同时提取RNA和脂质，以及共提取磷脂和内源性大麻素，需在4摄氏度下解冻组织粉末等分试样或脑组织团块。将组织加入含有陶瓷珠的提取管中。然后加入600 µL RLT缓冲液和200 µL氯仿。进行磷脂和内源性大麻素共提取时，向样品中加入10 µL内标混合物，并高速匀浆20秒。将匀浆后的样品转移至新的离心管中，在4 °C条件下以最大速度离心5分钟，以实现相分离。将上层相转移至新离心管中，使用标准试剂盒进行RNA提取。用50微升无RNase的水洗脱提取的RNA，并在-80摄氏度下保存。对于脂质提取，向含有氯仿的下层相中加入800微升MTBE/甲醇溶液和200微升0.1%甲酸溶液。在4°C下涡旋振荡45分钟。将上层有机相转移至新离心管中。在37°C下用温和的氮气流吹干。如需进一步进行液相色谱/质谱（LC/MS）分析，请将样品重新溶解于90 µL甲醇中，并在20或80 °C下保存，或立即进行分析。如需进一步进行内源性大麻素分析，请执行下一步操作。取一份脂质提取物，蒸发至干燥，然后用乙腈-水重新溶解。然后，取20 µL样品注入液相色谱-质谱联用仪（LC/MS）进行内源性大麻素分析。海人酸诱导急性癫痫发作后，小鼠在注射后一小时达到最大 seizure 强度。对内源性大麻素和二十碳类脂质、以及磷脂和内源性大麻素进行脂质组学分析，结果显示在海人酸诱导的癫痫小鼠与对照组中，大脑皮层、纹状体、丘脑区域、海马、下丘脑、小脑以及心脏和肺组织中的脂质水平均发生改变。在对小鼠脑组织穿孔样本进行磷脂、内源性大麻素和RNA的双重提取以进行定量分析后，分析了下丘脑、基底外侧杏仁核以及腹侧和背侧海马体中脂质的定量分布。通过mRNA水平检测了参与脂质信号传导的内源性酶和受体的相对表达水平，以及在经历红藻氨酸诱导的癫痫发作小鼠与对照小鼠的不同脑区及亚区中脑活动的相关标志物。与注射生理盐水的对照小鼠相比，红藻氨酸诱导的癫痫导致海马体CA1、CA3和门区NeuN信号显著减少，并伴随caspase-3信号升高所提示的凋亡事件。经过亚慢性棕榈酰乙醇胺处理后，神经元核蛋白信号明显得以保留，而CASP3信号几乎无法检测到。脑组织取样及特定脑区的解剖操作较为困难，需要精细的技术以确保在多个队列中获得一致的样本。因此，强烈建议在测试器官上进行练习，并充分掌握脑部形态学知识。

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神经系统疾病中的脂质组学和转录组学

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本方案旨在介绍使用三重四极杆质谱仪对临床样本中的蛋白质进行多反应监测（MRM）的方法。我们提供了一套系统的工作流程，涵盖从样本制备到数据分析的各个环节，并列出了处理临床样本时所需采取的所有必要预防措施。...

基于多重反应监测技术检测人脑组织蛋白质的定量蛋白质组学工作流程

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快速脂质分析的样品制备 果蝇 利用基质辅助激光解吸/电离质谱成像技术研究大脑

DeepOmicsAE：利用蛋白质组学、代谢组学和临床数据的深度学习分析揭示阿尔茨海默病中的信号模块

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基于胶质细胞转录组谱的阿尔茨海默病性别特异性生物标志物鉴定

本文建立了一种利用少量新鲜冷冻脑组织切片的实验方案，结合常规高速离心法与尺寸排阻色谱技术，以获取小细胞外囊泡作为神经系统疾病微小RNA（miRNA）生物标志物的来源。...

利用新鲜冷冻人脑组织切片释放的小细胞外囊泡中的microRNA cargo

学习神经系统疾病脂质组学和转录组学联合分析方法，使用小鼠脑组织样本进行脂质与RNA共提取。该技术可同时检测炎症相关脂质和神经活动标志物，适用于癫痫等神经疾病模型研究。

神经疾病中的脂质组学与转录组学

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