神经系统疾病中的脂质组学和转录组学

本文提出了一种模块化方案，用于神经系统疾病小鼠模型中的组织脂质组学和转录组学以及血浆脂质组学，靶向炎症和神经元活性下的脂质，膜脂质，下游信使以及脂质功能下的mRNA编码酶/受体。概述了采样，样品处理，提取和定量程序。

这种模块化方案使得探索由结构和信号传导脂质和/或RNA在谨慎的组织区域和血液中呈现的多种分子事件成为可能，并改善了每个样品标本的定量和定性数据输出。该方法适用于任何实验模型，也可以应用于人体组织标本和血液。演示该程序的将是技术员Claudia Schwitter，研究生Julia Post和我小组的博士后Raissa Lerner。

首先，取先前分离的，完整的，冷冻的小鼠的大脑，急性和预防性治疗的Kainic酸诱导的癫痫。将大脑安装到低温恒温器的安装系统上。将厚度设置为50微米，并在靠近感兴趣区域的修剪模式下切割大脑。

接近感兴趣区域时，将厚度设置为 18 到 20 微米。为了定位感兴趣的子区域，请使用甲苯胺蓝染色脑切片。使用显微镜检查染色切片以确定要打孔的感兴趣区域，并使用小鼠图谱作为参考以找到适当的大脑解剖区域。

使用取样取芯机取 0.8 至 1.0 毫米直径的冲头。将内源性大麻素和二十烷酸共萃取的冲头转移到预冷却的2毫升琥珀管中，每个管有7个预冷却的钢球。对于磷脂和内源性大麻素共萃取，双脂质和RNA共萃取，将冲头转移到带有陶瓷珠的2毫升无RNase提取管中。

在冷室中称量冷冻的冲头，并立即进行提取或在80摄氏度下冷冻。要从脑片，冲头或组织粉末样品中进行内源性大麻素和二十烷酸的液液脂质共萃取，请将含有组织样品和七个钢球的提取管放在冰上。加入600微升冰冷的MTBE和50微升含有内标的乙腈水。

加入400微升0.1摩尔甲酸后，使用组织裂解器匀浆30秒至1分钟。将该匀浆在4摄氏度下以5， 000 g离心15分钟。将其置于冰箱中，在80摄氏度下放置10分钟，以冷冻水性下相，这将缓解上层有机相的转移。

将上层有机相转移到新的1.5毫升琥珀管中，在37摄氏度的温和氮气流下蒸发10分钟，然后在50微升乙腈水中重建以进行进一步分析。将水相储存在20或80摄氏度，以进行进一步的蛋白质含量分析。为了从血浆样品中共排出内源性大麻素和二十烷酸，将冷冻的血浆样品放在冰上并使其完全解冻。

加入800微升MTBE和50微升乙腈水，其中含有使用参考血浆样品优化的内标。加入600微升0.1摩尔甲酸，在4摄氏度下涡旋2分钟。将样品在4，000克下在4摄氏度下离心15分钟。

将有机相转移到新管中。在37摄氏度的温和氮气流下蒸发，然后用50微升乙腈水将其重组，用于液相色谱多反应监测分析。要从大脑区域，冲头或其他组织粉末样品中共取磷脂和内源性大麻素，请将含有组织样品和陶瓷珠的提取管放在冰上。

加入800微升甲基叔丁基醚和甲醇混合物以及10微升含内标的甲醇。然后，加入200微升含有25微摩尔四氢列普他汀/ URB597和每毫升BHT50微克的0.1%甲酸。用组织均质器均质后，在5， 000次g和4摄氏度下离心15分钟。

将上层有机相转移到新的管中，在37摄氏度的温和氮气流下蒸发，然后用90微升甲醇重建该脂质提取物。如果立即进行，将10%的水加入脂质提取物等分试样中，并在LC / MS中注射10微升用于磷脂分析。要进行进一步的内源性大麻素分析，请继续进行下一步。

取脂质提取物的等分试样，蒸发至干，然后在乙腈水中重建。为了进行RNA和脂质的双重提取以及从组织样品中共提取磷脂和内源性大麻素，请在4摄氏度下解冻组织粉末等分试样或脑束。将组织加入带有陶瓷珠的提取管中。

然后加入600微升RLT缓冲液和200微升氯仿。对于磷脂和内源性大麻素共萃取，用10微升内标混合物刺入样品，并高速匀浆20秒。将匀浆样品转移到新的离心管中，以全速和4摄氏度离心5分钟，以实现相分离。

使用标准试剂盒将上相转移到新鲜管中以进行RNA提取。洗脱在总体积为50微升的无RNase水中提取RNA并将其储存在80摄氏度。对于脂质提取，将800微升MTBE /甲醇和200微升0.1%甲酸加入含氯仿的低相中。

在4摄氏度下涡旋45分钟。将上层有机相转移到新管中。在37摄氏度的温和氮气流下蒸发。

对于进一步的LC / MS分析，将样品在90微升甲醇中重建并将其储存在20或80摄氏度下，或立即进行分析。要进行进一步的内源性大麻素分析，请继续进行下一步。取脂质提取物的等分试样，蒸发至干，然后在乙腈水中重建。

然后，在LC / MS中注入20微升用于内源性大麻素分析。急性癫痫发作的凯尼克酸诱导导致注射后一小时的最大癫痫发作强度。内源性大麻素和类二十烷酸以及磷脂和内源性大麻素的脂质组学分析显示，凯宁酸诱导的癫痫小鼠和对照组的大脑皮层、纹状体、丘脑区、海马体、下丘脑、小脑以及心肺组织中的脂质水平变化。

对磷脂、内源性大麻素和RNA进行双重提取，对小鼠脑冲量进行定量剖析，分析了脂质在下丘脑、基底外侧杏仁核、腹侧和背海马体中的定量分布。参与脂质信号传导的内源性酶和受体的相对表达水平，以及在mRNA水平上研究了不同大脑区域和次区域中来自凯尼克酸诱导的癫痫发作和对照组小鼠的大脑活动标志物。与对照盐水注射小鼠相比，Kainic酸诱导的癫痫导致NeuN信号的大量丢失，主要在海马体的CA1，CA3和hilus区域，伴有半胱天冬酶-3信号指示的凋亡事件。

用亚染色棕榈酰乙醇酰胺处理后，神经元核蛋白信号明显保留，CASP3信号几乎检测不到。脑部打孔和剖析谨慎的大脑区域非常具有挑战性，需要精细的技能才能在多个队列中获得一致的采样。因此，强烈建议在测试器官上练习并了解良好的大脑形态学。