神经疾病中的脂质组学与转录组学

该模块化方案使得能够在特定组织区域和血液中，以每份样本更高的定性和定量数据输出，研究由结构脂质、信号脂质和/或RNA所介导的多种分子事件。该方法适用于任何实验模型，也可用于人体组织样本和血液。演示本实验操作的人员包括：技术员Claudia Schwitter、研究生Julia Post，以及我课题组的博士后Raissa Lerner。

首先，取先前分离的、完整的、冷冻的小鼠脑组织，这些小鼠患有急性期及预防性治疗的红藻氨酸诱导的癫痫。将脑组织安装至冷冻切片机的固定装置上。设置切片厚度为 50 µm，并在修片模式下对脑组织进行切片，接近目标区域。

接近目标区域时，将切片厚度设为18至20微米。为定位目标亚区，使用甲苯胺蓝对脑切片进行染色。在显微镜下观察染色切片，识别需打孔的感兴趣区域，并参考小鼠脑图谱确定相应的大脑解剖区域。

使用样品打孔器采集直径为 0.8 至 1.0 毫米的组织样本。将用于内源性大麻素和二十碳脂质联合提取的样本转移至预冷的 2 毫升棕色管中，每管加入七颗预冷的钢珠。对于磷脂和内源性大麻素联合提取，以及脂质与 RNA 联合提取，需将样本转移至含有陶瓷珠的 2 毫升无 RNase 的提取管中。

在冷室中称量冷冻组织穿孔样本，并立即进行提取，或在 -80 °C 下冷冻保存。为从脑组织块、穿孔样本或组织粉末样本中进行内源性大麻素和二十碳衍生物的液-液脂质共提取，将含有组织样本和7个钢珠的提取管置于冰上。加入600 µL预冷的甲基叔丁基醚（MTBE）和50 µL含有内标物的冰冻乙腈-水溶液。

加入 400 微升 0.1 摩尔的甲酸后，使用组织破碎仪匀浆 30 秒至 1 分钟。在 4 摄氏度下以 5,000 × g 离心 15 分钟。将样品置于 -80 摄氏度的冷冻机中冷冻 10 分钟，以冻结下层水相，从而便于上层有机相的转移。

将上层有机相转移至新的1.5毫升棕色管中，在37摄氏度下用温和的氮气流吹干10分钟，然后用50微升乙腈-水溶液重新溶解，用于后续分析。将水相在-20或-80摄氏度下保存，用于后续蛋白质含量分析。为从血浆样本中共同提取内源性大麻素和二十碳衍生物，请将冷冻的血浆样本置于冰上，使其完全解冻。

加入800微升甲基叔丁基醚（MTBE）和50微升含有内标物的乙腈水溶液，内标物浓度通过参考血浆样本优化确定。加入600微升0.1摩尔的甲酸溶液，在4摄氏度下涡旋振荡2分钟。在4摄氏度下以4,000 × g离心15分钟。

将有机相转移至新的离心管中。在37摄氏度下用温和的氮气流吹干，然后用50 µL乙腈-水溶液重新溶解，用于液相色谱-多反应监测分析。为从脑区、打孔组织或其他组织粉末样品中共同提取磷脂和内源性大麻素，请将含有组织样品和陶瓷珠的提取管置于冰上。

加入800微升甲基叔丁基醚和甲醇的混合液，以及含有内标物的10微升甲醇。然后，加入200微升含有25微摩尔四氢脂抑素/URB597和50微克/毫升BHT的0.1%甲酸溶液。使用组织匀浆器匀浆后，在4摄氏度下以5,000 × g离心15分钟。

将上层有机相转移至新离心管中，在37摄氏度下用温和的氮气流吹干，然后用90微升甲醇重新溶解该脂质提取物。若立即进行后续操作，可取部分脂质提取物，加入10%的水，取10微升注入液相色谱-质谱仪（LC/MS）用于磷脂分析。如需进一步进行内源性大麻素分析，则继续进行下一步操作。

取一份脂质提取物，蒸发至干燥，然后用乙腈-水重新溶解。为从组织样本中同时提取RNA和脂质，以及共提取磷脂和内源性大麻素，需在4摄氏度下解冻组织粉末等分试样或脑组织团块。将组织加入含有陶瓷珠的提取管中。

然后加入600 µL RLT缓冲液和200 µL氯仿。进行磷脂和内源性大麻素共提取时，向样品中加入10 µL内标混合物，并高速匀浆20秒。将匀浆后的样品转移至新的离心管中，在4 °C条件下以最大速度离心5分钟，以实现相分离。

将上层相转移至新离心管中，使用标准试剂盒进行RNA提取。用50微升无RNase的水洗脱提取的RNA，并在-80摄氏度下保存。对于脂质提取，向含有氯仿的下层相中加入800微升MTBE/甲醇溶液和200微升0.1%甲酸溶液。

在4°C下涡旋振荡45分钟。将上层有机相转移至新离心管中。在37°C下用温和的氮气流吹干。

如需进一步进行液相色谱/质谱（LC/MS）分析，请将样品重新溶解于90 µL甲醇中，并在20或80 °C下保存，或立即进行分析。如需进一步进行内源性大麻素分析，请执行下一步操作。取一份脂质提取物，蒸发至干燥，然后用乙腈-水重新溶解。

然后，取20 µL样品注入液相色谱-质谱联用仪（LC/MS）进行内源性大麻素分析。海人酸诱导急性癫痫发作后，小鼠在注射后一小时达到最大 seizure 强度。对内源性大麻素和二十碳类脂质、以及磷脂和内源性大麻素进行脂质组学分析，结果显示在海人酸诱导的癫痫小鼠与对照组中，大脑皮层、纹状体、丘脑区域、海马、下丘脑、小脑以及心脏和肺组织中的脂质水平均发生改变。

在对小鼠脑组织穿孔样本进行磷脂、内源性大麻素和RNA的双重提取以进行定量分析后，分析了下丘脑、基底外侧杏仁核以及腹侧和背侧海马体中脂质的定量分布。通过mRNA水平检测了参与脂质信号传导的内源性酶和受体的相对表达水平，以及在经历红藻氨酸诱导的癫痫发作小鼠与对照小鼠的不同脑区及亚区中脑活动的相关标志物。与注射生理盐水的对照小鼠相比，红藻氨酸诱导的癫痫导致海马体CA1、CA3和门区NeuN信号显著减少，并伴随caspase-3信号升高所提示的凋亡事件。

经过亚慢性棕榈酰乙醇胺处理后，神经元核蛋白信号明显得以保留，而CASP3信号几乎无法检测到。脑组织取样及特定脑区的解剖操作较为困难，需要精细的技术以确保在多个队列中获得一致的样本。因此，强烈建议在测试器官上进行练习，并充分掌握脑部形态学知识。