多发性硬化患者综合解剖计划
July 19th, 2019
多发性硬化症是一种炎症性脱骨髓疾病,没有治愈的方法。脑组织分析为了解疾病的发病机制提供了重要线索。在这里,我们讨论在克利夫兰诊所运行中通过独特的快速解剖程序收集的MS脑组织的方法和下游分析。
我们研究的目标是研究多发性硬化症的发病机制。为了实现这个目标，我们建立了一个快速的验尸计划，从MS个体获得和研究大脑。我们的验尸方案有两个特殊方面，第一是快速。我们收集大脑在六到八个小时的死亡。
这允许最先进的分子研究。第二个方面是，我们在移动大脑之前做一个原位MRI。这使我们能够将病理变化与脑成像变化关联。
视觉演示使观众能够了解我们如何组织我们的空间和时间，以实现最佳效果。组织处理，发生迅速和仔细允许RNA分析，免疫污染，免疫印迹和MRI相关性。新的研究人员可能难以加工组织完整性差的组织。
避免长时间的验尸后固定时间很重要，MRI组织脐带条纹可能具有挑战性，因此与MRI分析专家的咨询可能非常有用。演示程序将是埃米莉·克里斯蒂和克里斯蒂娜·沃尔斯科。我们实验室的技术人员
原位磁共振成像后，称重并拍摄大脑，将任何附着的杜拉放在4%的甲醛或PFA容器中。将小脑和脑干从脑中分离，并拍摄大脑。使用探针分离视神经、气动和区域，并使用手术刀对结构进行校正。
纵向分离脑半球，并单独拍摄每个半球。墨水左半球的初级运动皮层或PMC，重新照片化组织，并放置组织在一个3.3升容器长固定。要切除右半球的 PMC，请取出覆盖的脑皮并重新对组织进行照片测量。
接下来，使用手术刀重新检测 PMC。然后在半球旁边拍摄被降级的 PMC。将 PMC 切成六个大小相等的部分，并墨迹每个部分的轮面。
然后将所有其他部分放入 PFA 填充容器中，进行短固定。并捕捉冻结剩余的部分，储存在密封的冰柜袋，在冷却器的头号。将右半球前到后半球切成一厘米厚的日冕部分。
修复 PFA 中的所有其他部分，并捕捉冻结剩余部分，以储存在密封的冰柜袋中，在较酷的第一节中。将脑干与小脑分离，将脑干放在PFA填充容器中，进行短固定。将每个小球切成四个同样固定的下垂部分，并拍摄中观和横向视图。
然后将左小脑半球切片放在PFA容器中进行短固定。并捕捉冻结右小脑半球片，储存在密封的冰柜袋中，在较酷的头号。获得脊髓与神经根后，删除脊髓杜拉母体和存储在PFA的杜拉。
分离左前和右前神经根和后神经根，从脊髓上切开左前和后神经根，在PFA中短暂固定。从脊髓和弦上切开右前脑和后神经根部，并捕捉冷冻这些组织，储存在密封的冷冻袋中，在较酷的二号。然后拍摄脊髓最 20 厘米的乳胶，并切割两厘米的转移部分从孔德尔到脊髓的旋转方向，用于 PFA 短固定和捕捉冻结。
然后拍摄脊髓的剩余脊椎部分。并切割两厘米的传输部分从孔道到旋转方向的线PFA短固定和捕捉冻结。从短或长固定组织中剪切部分感兴趣内容。
将部分放入六孔板的单个孔中，用三个五分钟洗涤组织，每次洗涤两毫升新鲜 PBS，并摇动。对于抗原检索，在装有约30毫升10毫摩尔柠檬酸盐缓冲液的玻璃烧杯中微波两到三分钟。当部分冷却到室温后，将样品转移到新的六井板中，进行三次五分钟洗涤和两毫升 PBS，外加每井0.3%Triton X-100。每洗一次。
其次是内源性过氧化物酶阻断两毫升3%过氧化氢加0.3%Triton X-100在PBS，在室温下30分钟。孵育结束时，每次洗涤用两毫升 PBS 加 Triton X-100 洗三次。随后在两毫升的3%正常山羊血清和PBS加上Triton X-100的阻尼在室温下一小时。
接下来，在4摄氏度的原抗体中，从夜间到五天，每次洗涤两毫升PBS中孵育三个五分钟。在室温下孵育阿维丁-生物素复合溶液或ABC复合物中的各部分一小时。跟进此，在 PBS 中进行三次五分钟的洗涤。
用两毫升过滤的Diaminobenzidine加注两毫升的Diaminobenzidine，每井加注过氧化氢，贴三到八分钟。当颜色充分发展后，在 PBS 中清洗部分三次，然后将每个部分单独转移到 PBS 填充容器中。将每个部分平放在单独的组织幻灯片下。
轻轻地将每个幻灯片从 PBS 中提起，使部分尽可能平坦。使用两个画笔轻轻压平并拉伸每个组织。用纸巾擦去多余的水。
然后用适当的安装介质安装部分，然后用清晰的指甲油密封每个盖滑。组织部分检查是否存在白物质病变，所选区域被染色以进行免疫活动和脱叶。在急性多丝骨病变中，许多这些脱髓轴子充当轴向缩回灯泡，反映横切轴子的近端。
急性病变中转角轴的密度超过活性病变每立方毫米11000，而相邻的非病变白质区只有15个。在许多慢性MS病变中也存在新生成的橄榄细胞。这些过程与骨髓性脱髓轴子关联，但不包括骨髓。
一个代表性的，公正地搜索从慢性MS患者获得快速冻结的运动皮层神经元基因变化，发现23个核和编码线粒体信使RNA的凭据研究使用免疫细胞化学和原位杂交表明，这些基因是高度丰富的皮质投影神经元和线粒体从投影轴分离显示减少糖解。对骨髓和脱髓海马中的神经诺德基因表达进行比较，可以发现神经元信使RNA的减少，包括参与记忆和学习的蛋白质。此外，与控制皮质相比，皮质神经元损失在脊髓和大脑皮层的MS患者的亚群体中显著增加，但大脑白质的皮质没有。
在组织处理过程中，确保切入日冕部分时，它们在厚度和方向方面一致地切割。当漂浮在固定物中或冰冻时，它们平躺在。除了免疫组织化学分析外，冷冻组织集合还为我们提供了进行遗传和蛋白质组分析的机会。
这些技术有助于在MRI上识别一批新的MS脑白物质病变患者，但没有任何重大的白物质脱叶。术语 Myelocortical 女士。
概述
本研究通过独特的快速尸检项目，在死亡后数小时内收集脑组织，探讨多发性硬化症（MS）的发病机制。该方法包括原位MRI，用于将病理变化与脑部影像相关联，促进先进的分子研究和MS脑组织分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经免疫学
- 病理学
背景
- 多发性硬化症是一种慢性炎症性脱髓鞘疾病。
- 由于脑组织分析不足，目前对其发病机制的理解有限。
- 快速尸检项目允许及时收集脑部样本用于研究。
- 病理和影像发现的相关性增强了对疾病机制的理解。
研究目的
- 阐明多发性硬化症的发病机制。
- 利用快速尸检脑组织进行全面的分子分析。
- 建立一种克服组织完整性和处理挑战的方法。
使用的方法
- 快速尸检项目在死后六至八小时内收集脑组织。
- 在取出大脑之前进行原位MRI，以将脑影像变化与病理观察相关联。
- 处理允许进行RNA分析、免疫染色和免疫印迹。
- 关键步骤包括拍照、切片、固定和适当存储脑组织。
主要结果
- 研究展示了有效的组织处理和分析技术，保持了组织完整性。
- 通过特定的染色方法观察到免疫活动和脱髓鞘的见解。
- 轴突收缩泡的识别突出了急性MS病变中的损伤机制。
- 详细的方法为进一步研究MS病理学提供了基础。
结论
- 本研究通过实时组织分析使对MS有了更好的理解。
- 及时收集和先进的方法允许对疾病机制进行全面的洞察。
- 研究结果对开发潜在的MS治疗策略具有意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
The rapid autopsy program enables high-fidelity postmortem tissue collection for mechanistic studies of multiple sclerosis, supporting target validation through direct correlation of imaging and pathology. This approach de-risks translational efforts by providing disease-relevant human tissue for biomarker discovery and preclinical model alignment. The program’s speed and standardization enhance reproducibility in neuroimmunology research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses via direct analysis of demyelination and axonal injury in human MS lesions.
- Operational Value: Provides well-characterized tissue with correlated MRI-pathology data for target engagement studies.
- Predictive Value: Supports biomarker identification through molecular profiling of rapidly frozen tissue for transcriptomic and proteomic analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated histological and molecular readouts from standardized tissue sections for assay benchmarking.
- Operational Value: Ensures tissue consistency through rapid processing and fixed/frozen parallel processing workflows.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple analytes including immunostaining, in situ hybridization, and RNA scope.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates correlation of clinical disability profiles with neuropathological findings in well-characterized donor cohorts.
- Mechanistic De-risking: Identifies molecular subtypes such as myelocortical MS to refine patient stratification in preclinical models.
- Predictive Confidence: Enables validation of imaging biomarkers via postmortem MRI-pathology co-registration.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports early discovery through lead identification by supplying disease-relevant human tissue for target validation and mechanistic screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via analysis of immune activity, demyelination, and axonal transection in acute and chronic lesions.
- Screening: Enables assay readiness through standardized 1 cm-thick brain and 2 cm spinal cord sections with fixed and frozen counterparts.
- Analytics: Provides quantitative outputs including lesion load, axonal density (>11,000/mm³ in active lesions), and molecular profiles from RNA and protein analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work via MRI-pathology correlation and identification of MS subtypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue processing pipeline for longitudinal neuroimmunology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct human tissue analysis of MS pathology mechanisms.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via rapid (<6 h postmortem) tissue procurement and parallel processing.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neuroimmunology target selection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through biomarker-aligned tissue subsets and imaging-pathology correlation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, neuropathology, and rapid tissue handling protocols.
- Depends on 3 T MRI infrastructure and coordination with autopsy and imaging suites for in situ scanning.
- Necessitates standardized SOPs for tissue sectioning, fixation, freezing, and storage across research teams.
- Involves adaptation considerations for applying protocols to other neurodegenerative disease models.
- Includes practical limitations such as dependency on donor consent, neurological characterization, and 24/7 on-call staffing.
