多发性硬化症患者全面尸检项目

我们研究的目的是探讨多发性硬化症的发病机制。为实现这一目标，我们建立了一个快速尸检项目，以获取并研究多发性硬化症患者的大脑组织。我们的尸检项目有两个特殊之处：第一是快速性，我们会在患者死亡后六至八小时内采集大脑组织。

这使得能够开展前沿的分子学研究。第二个方面是，我们在移动大脑之前会进行原位 MRI 扫描。这使得能够将病理学改变与脑部影像学变化进行关联分析。

直观演示使观众能够理解我们如何组织空间和时间以获得最佳结果。快速且谨慎的组织处理可实现RNA分析、免疫染色、免疫印迹以及MRI相关性分析。新研究人员在处理组织完整性较差的样本时可能会遇到困难。

避免过长的死后固定时间非常重要，而MRI组织纹状表现的分析可能具有挑战性，因此与MRI分析专家进行咨询会非常有帮助。本次操作演示将由本实验室技术人员Emilie Christie和Christina Volsko进行。

原位磁共振成像后，称重并拍摄脑组织照片，将附着的硬脑膜置于盛有4%多聚甲醛（PFA）的容器中。分离小脑和脑干与大脑，拍摄大脑的照片。使用探针分离视神经、视交叉和视束，并用手术刀切除该结构。

纵向分离大脑半球，并分别对每个半球进行拍照。用墨水标记左半球的初级运动皮层（PMC），重新拍摄组织照片，然后将组织放入3.3升容器中进行长期固定。为切除右半球的初级运动皮层（PMC），需去除覆盖的脑膜，然后重新拍摄组织照片。

接下来使用手术刀切除PMC。然后将切除的PMC置于半球旁拍摄照片。将PMC切成六个大小相等的片段，并用墨水标记每个片段的头端部分。

然后将每隔一个的脑片放入盛有PFA的容器中进行短时间固定。其余脑片迅速冷冻，用密封冷冻袋储存于1号冷藏箱中。将右侧半球从前向后切成厚度为1厘米的冠状切片。

将每隔一个的脑片用PFA固定，其余脑片在1号冷藏箱中用密封冷冻袋进行速冻保存。将脑干与小脑分离，并将脑干置于盛有PFA的容器中进行短时间固定。将每侧小脑半球切成四个等分的矢状面脑片，拍摄其内侧面和外侧面的照片。

然后将左侧小脑半球切片放入PFA溶液中进行短时间固定。将右侧小脑半球切片迅速冷冻，并用密封冷冻袋保存于1号冷藏箱中。获取脊髓及神经根后，去除脊髓的硬脊膜，并将硬脊膜保存在PFA溶液中。

分离左侧和右侧的前根和后根神经，并将左侧的前根和后根神经从脊髓上切断，用于PFA短时间固定。将右侧的前根和后根神经从脊髓上切断，并迅速冷冻这些组织，随后密封于冷冻袋中，置于2号冷藏箱内保存。接着，拍摄脊髓最尾端20厘米部分的照片，并从尾端向头端方向每隔2厘米切取一段组织，分别用于PFA短时间固定和速冻保存。

然后拍摄脊髓剩余的头端部分。从脊髓尾端向头端方向切取两厘米长的转移节段，用于PFA短时间固定和速冻。从短时间或长时间固定的组织中切取感兴趣的节段。

将切片放入六孔板的各个孔中，每孔加入2毫升新鲜PBS，振荡洗涤三次，每次五分钟。进行抗原修复时，在玻璃烧杯中加入约30毫升10毫摩尔的柠檬酸缓冲液，将切片放入其中微波处理2至3分钟。当切片冷却至室温后，将样本转移至新的六孔板中，每孔加入含0.3% Triton X-100的PBS溶液2毫升，振荡洗涤三次，每次五分钟。

随后在室温下用含有3%过氧化氢和0.3%Triton X-100的2毫升PBS溶液封闭内源性过氧化物酶，孵育30分钟。孵育结束后，按所示方法，每次用含Triton X-100的2毫升PBS溶液洗涤3次，每次洗涤一次。接着在室温下用含有3%正常山羊血清、PBS和Triton X-100的2毫升溶液封闭1小时。

接着，将切片在4°C下与目标一抗共同孵育，时间从过夜至五天不等，随后用2毫升PBS洗涤三次，每次五分钟。室温下将切片置于亲和素-生物素复合物溶液（ABC复合物）中孵育一小时，之后再用PBS洗涤三次，每次五分钟。

每孔加入两毫升过滤后的二氨基联苯胺（DAB），并补充过氧化氢，孵育三至八分钟以标记切片。当颜色充分显色后，用 PBS 洗涤切片三次，并将每个切片单独转移至盛有 PBS 的容器中。将每个切片平放，置于各自的组织载片下。

轻轻将每张载玻片从 PBS 中取出，尽量保持组织切片平整。使用两把画笔轻轻压平并拉伸每份组织，再用纸巾轻拍除去多余水分。

然后使用适当的封片介质封片，并用透明指甲油密封每张盖玻片。通过显微镜观察组织切片中是否存在白质病变，并对所选区域进行免疫活性和脱髓鞘染色。在急性多发性硬化病变中，许多脱髓鞘的轴突表现为轴突回缩球，代表被横断轴突的近端。

在活动性病灶中，急性损伤区域每立方毫米内横断的轴突密度超过11000条，而邻近非病灶区的白质区域仅为15条。许多慢性多发性硬化（MS）病灶中也存在新生成的少突胶质细胞。这些细胞过程与脱髓鞘的轴突相关联，但并不对其形成髓鞘。

一项具有代表性的、无偏倚的研究对慢性多发性硬化症（MS）患者快速冷冻的运动皮层进行了神经元基因变化的筛查，发现23种细胞核编码的线粒体信使RNA显著减少。通过免疫细胞化学和原位杂交进行的验证研究表明，这些基因在皮层投射神经元中高度富集，且从投射轴突中分离出的线粒体表现出糖酵解能力下降。对髓鞘化与脱髓鞘海马组织中神经元基因表达的比较显示，包括参与记忆和学习相关蛋白在内的神经元信使RNA出现减少。此外，与对照组皮层相比，在一部分脊髓和大脑皮层发生脱髓鞘但脑白质未受累的MS患者亚群中，皮层神经元丢失更为显著。

在组织处理过程中，务必确保冠状切片在厚度和方向上保持一致，并且在固定液中漂浮或冷冻时能够保持平整。除了免疫组织化学分析外，冷冻组织样本还为我们提供了进行基因组和蛋白质组分析的机会。

这些技术有助于识别一组新的多发性硬化症患者，其磁共振成像（MRI）显示存在脑白质病变，但并无显著的白质脱髓鞘现象，此类患者被称为髓皮质型多发性硬化症（Myelocortical MS）。