一种体外批次培养模型用于评估干预方案对人类粪便菌群的影响

鉴于肠道微生物组在多种人类疾病中的新兴作用，多种肠道微生物组调节剂（如益生菌、益生元、饮食和药物）可能有助于改善与肠道微生物组相关的健康问题。然而，目前尚无快速且经济的筛选系统可用于预测这些肠道微生物组调节剂的效果，而本系统操作简便，能够预测特定干预措施对肠道微生物组的影响，进而评估其对宿主健康的作用。该实验方案简单、经济且实用，适用于研究肠道微生物组调节剂及其对微生物群和宿主健康影响的实验室。

保持无菌和厌氧条件对本实验至关重要。此外，粪便样本应在采集后立即新鲜使用。若需推迟实验，则样本应在采集后立即于-80℃保存，避免任何暴露于室温和空气中的情况。

在分装和移液操作过程中，操作的准确性对于保持实验的准确性和可重复性同样重要。白天操作耗时少于12小时。如果需要在24小时内获得样品，我们可以进行过夜培养。

然后进行短链脂肪酸和微生物组的测定。该过程将由我实验室的两名优秀大学生——Shokouh Ahmadi 和 Rabina Mainali 演示。在通风橱内准备发酵培养基时，于装有磁力搅拌子的试剂瓶中，混合溶液 A、溶液 B、微量元素溶液、水溶性维生素溶液、叶酸-生物素溶液、核黄素溶液、血红素溶液、短链脂肪酸混合物以及刃天青。

然后向瓶中加入酵母提取物、碳酸钠、盐酸半胱氨酸一水合物和胰蛋白胨。加入 296.1 毫升蒸馏水，用 1 N 盐酸或氢氧化钠调节 pH 值，使其约为 7.0。将烧杯转移至无菌工作站，使用孔径为 0.22 微米的真空滤器过滤培养基以达到灭菌目的。

制备1升厌氧稀释液时，将5克氯化钠、2克葡萄糖和0.3克盐酸半胱氨酸一水合物溶解于去离子水中。将带盖的试剂瓶在121.1°C条件下高压灭菌15分钟，并置于厌氧培养箱中保存。在发酵实验开始前，将实验所需的所有材料、溶液和工具提前至少48小时放入厌氧培养箱内，以确保残留的氧气被彻底清除。

在进行发酵实验前至少24小时，称取300毫克菊粉，转移至50毫升离心管中，并将该管放入厌氧室。向管中加入26毫升灭菌发酵培养基，涡旋混匀。使纤维充分水合约24小时。

进行发酵实验当天，准备粪便接种物。首先，在一个50毫升锥形管中称取5克新鲜粪便样品。加入厌氧稀释液至终体积为50毫升。

涡旋振荡15分钟，或直至完全均质。将接种后的试管置于厌氧舱内37摄氏度培养，每小时轻轻倒置一次，以重新悬浮纤维和接种物。在培养3小时、6小时、9小时或24小时后，取出适量发酵培养基，在4摄氏度条件下以14,000 × g离心10分钟。

立即将上清液和沉淀用液氮速冻，速冻后，将上清液于-80摄氏度保存用于短链脂肪酸分析，沉淀于-80摄氏度保存用于微生物组分析。本方案用于演示特定益生元的作用效果。健康人受试者在经菊粉处理后，其粪便pH值在9小时内相对稳定，但在24小时后显著下降。

与未经处理的粪便微生物群培养物相比，添加菊粉显著提高了经菊粉处理的粪便样本中短链脂肪酸和乳酸的水平。主坐标分析显示，在菊粉处理组与未处理组样本之间，基于加权和非加权UniFrac距离的β多样性指标反映出微生物群组成存在差异。α多样性指数与系统发育多样性（通过PD全树）、物种丰富度、可操作分类单元、物种均匀度，以及主要门和属的相对丰度等指标均表明，菊粉处理组与未处理组之间具有不同的肠道微生物群特征。

基于16S序列的线性判别效应大小分析得出的分类学系统发育树，表示不同样本组之间差异丰富的分类群。请仔细遵循所有步骤。最重要的是保持严格的无菌和厌氧条件。

实验所得上清液可用于处理因纤维发酵引起的短链脂肪酸水平变化。此外，沉淀物可用于分析肠道微生物组组成的变化。配制培养基所用的一些化学试剂可能具有潜在危害性。

请查阅 MSDS 说明书，并相应地采取预防措施。