Name: 监测GPCR-β-阻丁1/2实时生命系统中的相互作用,加速药物发现 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 了解结构互补检测法在活细胞中实时监测GPCR-β-arrestin相互作用的技术。该方法适用于任何GPCR系统，可为药物发现和受体药理学研究提供准确信息，助力开发副作用最小的新型药物。

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本工作由韩国国家研究基金会（NRF）资助，资助项目为科学、信息通信技术及未来规划部支持的研究计划项目（NRF-2015M3A9E7029172）。

1. 引物设计策略
<ol>
	<li>设计引物，将目的基因插入 pBiT1.1-C [TK/LgBiT]、pBiT2.1-C [TK/SmBiT]、pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 和 pBiT2.1-N [TK/SmBiT] 载体中。</li>
	<li>从这三个位点中至少选择一个，作为定向克隆所需的两种独特限制性酶切位点之一，因为存在一个同框终止密码子，可将多克隆位点分割，如图所示。 图111.</li>
	<li>在引物中加入所示的核苷酸序列 表1 用于编码图中红色显示的连接区残基 表 211.</li>
	<li>对于 pBiT1.1-C [TK/LgBiT] 和 pBiT2.1-C [TK/SmBiT] 载体，确保 5 &#769; 引物包含一个ATG密码子和一个强效的Kozak共识序列（GCCGCCACC）。</li>
	<li>对于 pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 和 pBiT2.1-N [TK/SmBiT] 载体，确保 3 &#769; 引物包含一个终止密码子。 
	注意：每个载体均含有HSV-TK启动子，以最大限度减少非特异性结合并降低实验假象；此外，每个载体还包含一个用于细菌中氨苄青霉素抗性的表达盒。</li>
</ol>
2. PCR
<ol>
	<li>使用步骤1中设计的引物，建立并运行PCR反应以扩增目的基因的插入DNA片段。务必使用高保真DNA聚合酶，以最大限度减少突变。</li>
	<li>按照以下顺序配制50 µL的PCR反应体系：加入35.5 µL去离子水、5 µL 10x聚合酶缓冲液、5 µL dNTP混合物（每种2.5 mM）、1 µL质粒模板（200 ng/µL）、1.25 µL正向和反向引物（10 μM）以及1 µL高保真聚合酶（5 U/µL）。</li>
	<li>使用PCR仪设置以下DNA扩增程序。
	<ol>
		<li>95 °C 变性5分钟。</li>
		<li>重复25个循环：95 °C 30秒，60 °C 1分钟，72 °C 每扩增1 kbp延伸2分钟。</li>
		<li>72 °C 进行最终延伸10分钟。</li>
		<li>将样品在PCR仪中保持于4 °C。 
		注意：强烈建议使用高保真聚合酶，以最大限度减少点突变，尤其是在扩增长片段序列时。随着扩增片段长度增加，DNA复制的准确性会降低。在PCR反应中，退火温度应根据引物与DNA模板直接杂交区域的熔解温度来选择，而非依据整个引物序列的熔解温度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR产物纯化
	<ol>
		<li>使用任意厂家提供的试剂盒从PCR反应体系中分离PCR产物12。PCR产物现已可用于限制性酶切。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. DNA 消化
<ol>
	<li>进行PCR产物消化时，按如下步骤配制50 μL的消化反应体系。
	<ol>
		<li>使用1.5 mL离心管，加入12 μL去离子水。</li>
		<li>加入5 μL与两种限制性内切酶均具有良好兼容性的10x缓冲液。</li>
		<li>从步骤2.4中加入30 μL PCR产物。</li>
		<li>最后，每种限制性内切酶各加入1.5 μL。</li>
		<li>短暂涡旋混匀，于37.5 °C孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行受体质粒消化时，按如下步骤配制50 μL的消化反应体系：
	<ol>
		<li>使用1.5 mL离心管，加入23 μL去离子水。</li>
		<li>加入5 μL与两种限制性内切酶均具有良好兼容性的10x缓冲液。</li>
		<li>加入15 μL受体质粒（200 ng/μL）。</li>
		<li>每种限制性内切酶各加入1.5 μL。</li>
		<li>短暂涡旋混匀，于37.5 °C孵育过夜。 
		注意：为确保在DNA琼脂糖凝胶纯化后获得足够的材料，必须使用3 μg的受体质粒。同时，使用两种酶进行过夜消化对于获得高克隆效率也至关重要。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. DNA 琼脂糖凝胶纯化与克隆
<ol>
	<li>制备1%琼脂糖凝胶以电泳分离已消化的DNA质粒和插入片段，并切下相应的条带。在纯化相应的载体和插入片段条带后12，使用分光光度计测定DNA浓度。</li>
	<li>进行DNA连接，将插入片段与受体质粒连接。</li>
	<li>准备连接反应，总体积中包含约100 ng总DNA，其中质粒载体为50 ng。</li>
	<li>设置受体质粒与插入片段的比例约为1:3；可使用质粒-插入片段计算器进行计算13.</li>
	<li>并行设置阴性对照。例如，将不含任何插入片段的受体质粒DNA进行连接，可提供有关未消化或自连接的受体质粒背景水平的信息。</li>
</ol>
5. 克隆的转化
<ol>
	<li>从-80 °C冰箱中取出一管DH5α感受态细胞，立即置于冰上解冻20分钟。</li>
	<li>20分钟后，取55 µL DH5α感受态细胞，加入4 µL连接反应产物，通过轻弹管壁混匀，然后冰上静置45分钟。</li>
	<li>将离心管放入已预热至42 °C的水浴中，精确热激48秒，随后立即放回冰上冷却3分钟。</li>
	<li>加入600 µL预先加热至37.5 °C的LB（Luria Broth）培养基，于200 rpm振荡条件下培养1小时。</li>
	<li>取200 µL菌液转移至含100 μg/mL氨苄青霉素的琼脂平板上，轻轻旋转平板使液体均匀分布，待液体基本吸收。</li>
	<li>将平板过夜培养，次日观察菌落生长情况。插入片段转化板上的菌落数量应显著多于仅含受体质粒的对照板。</li>
</ol>
6. 纯化完成的质粒
<ol>
	<li>挑取3-10个单菌落，转移至1 mL含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB培养基中，37 °C振荡培养6小时。</li>
	<li>取200 µL菌液转移至5 mL含有与步骤6.1相同浓度氨苄青霉素的LB培养基中，37.5 °C、200 rpm振荡过夜培养。</li>
	<li>使用质粒小提试剂盒，按照生产商说明书，对过夜培养的5 mL LB菌液进行质粒DNA小量提取14。</li>
	<li>为鉴定连接成功的克隆，以步骤6.3获得的DNA为模板，使用第2节中的相同引物进行PCR扩增，反应体系设置与第2节相同。阳性克隆将扩增出相应大小的PCR产物。</li>
	<li>对阳性克隆进行大量质粒DNA提取后，取500 ng纯化DNA，用克隆时使用的限制性内切酶进行酶切鉴定，并将酶切产物在1%琼脂糖凝胶上电泳。应出现两条条带：一条为载体大小，另一条为插入片段大小。</li>
	<li>使用以下引物对构建体序列进行测序验证：正向引物5’- aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3’，反向引物5’-gcatttttttcactgcattctagtt-3’。 
	注意：PCR扩增DNA时，即使使用高保真DNA聚合酶，扩增过程中仍可能存在错误，因此对最终构建体进行测序验证至关重要。</li>
</ol>
7. 转染与蛋白表达
<ol>
	<li>在预先用多聚-L-赖氨酸包被的白色96孔板中，使用添加了10%胎牛血清、100 U/mL青霉素G和100 μg/mL链霉素的杜氏改良伊格尔培养基，以每孔2.5 × 104个细胞的密度进行细胞接种，接种时间在转染前一天。</li>
	<li>仅使用60个内圈孔，以尽量减少孔板内温度梯度以及边缘蒸发效应的影响。向36个外周孔中各加入200 μL无菌蒸馏水，并在孔间空隙处加入150 μL，随后在37.5 °C和5% CO2条件下孵育过夜。</li>
	<li>次日上午进行转染，每孔使用总量为100 ng的DNA（每种质粒各50 ng）。</li>
	<li>根据图2b设置四种不同的质粒组合（受体:β-阻遏蛋白）。</li>
	<li>每种质粒组合使用20 µL以HEPES缓冲的改良伊格尔最小必需培养基，并每孔加入0.3 µL脂质转染试剂。</li>
	<li>将20 μL脂质转染试剂-DNA混合物加入各孔中，然后以画圈方式混匀10秒。</li>
	<li>在37.5 °C和5% CO2条件下孵育6小时后更换新鲜培养基。</li>
	<li>将培养板在37.5 °C和5% CO2条件下继续孵育24小时。</li>
</ol>
8. 在 HEK293 细胞中监测受体-β-arrestin1/2 相互作用
<ol>
	<li>吸弃培养基，每孔加入 100 μL 用 HEPES 缓冲的改良伊格尔最低必需培养基，将培养板在室温下静置 10 分钟以使其稳定。</li>
	<li>通过将 1 份体积的 100 倍浓缩底物与 19 份体积的 LCS 稀释缓冲液混合（20 倍稀释），配制呋喃素底物，制备成 5 倍储存液，用于与细胞培养基混合11。</li>
	<li>每孔加入 25 μL 5 倍浓度的呋喃素底物，轻轻以环形方式混匀 10 秒。</li>
	<li>在室温下测量发光信号 10 分钟，以实现信号稳定。 
	注意：使用该基线信号对每孔的响应进行归一化，有助于减少因每孔接种细胞数量差异、转染效率不同等因素引起的变异性。计算后，对同一种药物处理的重复孔归一化响应取平均值。</li>
	<li>用 HEPES 缓冲的改良伊格尔最低必需培养基配制 13.5 倍浓度的配体溶液。</li>
	<li>在室温下进行实验时，加入 10 µL 13.5 倍浓度的配体，使用注射器或多通道移液器加样，并通过手动或轨道摇床（200 rpm 摇动 20 秒）混匀培养板。</li>
	<li>在 37.5 °C 下进行实验时，加入 10 µL 13.5 倍浓度的配体，使用仪器内置的注射器加样，并利用仪器自带的轨道摇床进行混匀。若不使用注射器，则需将培养板从发光检测仪中取出，加入配体后手动或使用轨道摇床混匀（200 rpm 摇动 20 秒）。 
	注意：建议使用仪器内置的注射器和摇床，以尽量减少因将培养板从发光检测仪中取出而导致的温度波动。本实验可使用常规台式发光检测仪，积分时间设置为 0.25–2 秒。</li>
</ol>

<ol><li>Sriram, K., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPCRs+as+targets+for+approved+drugs%3A+How+many+targets+and+how+many+drugs%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs?</a> Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).</li>
<li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+GPCR+drug+discovery%3A+new+agents%2C+targets+and+indications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li>
<li>Langmead, C. J., Summers, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pharmacology+of+GPCRs%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Molecular pharmacology of GPCRs.</a> British Journal of Pharmacology. 175 (21), 1754005-1754008 (2018).</li>
<li>Lohse, M. J., Hoffmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrestin+Interactions+with+G+Protein-Coupled+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Arrestin Interactions with G Protein-Coupled Receptors.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 219, 15-56 (2014).</li>
<li>Kang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+an+arrestin2-clathrin+complex+reveals+a+novel+clathrin+binding+domain+that+modulates+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure of an arrestin2-clathrin complex reveals a novel clathrin binding domain that modulates receptor trafficking.</a> Journal of Biological Chemistry. 284, 29860-29872 (2009).</li>
<li>Park, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+%CE%B2-Arrestin-Biased+Dopamine+D2+Receptor+Ligands+on+Schizophrenia-Like+Behavior+in+Hypoglutamatergic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Effects of β-Arrestin-Biased Dopamine D2 Receptor Ligands on Schizophrenia-Like Behavior in Hypoglutamatergic Mice.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (3), 704-715 (2016).</li>
<li>Zhu, L., Cui, Z., Zhu, Q., Zha, X., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Opioid+Receptor+Agonists+with+Reduced+Morphine-like+Side+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Mini-Reviews+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel Opioid Receptor Agonists with Reduced Morphine-like Side Effects.</a> Mini-Reviews in Medicinal Chemistry. 18 (19), 1603-1610 (2018).</li>
<li>Smith, J. S., Lefkowitz, R. J., Rajagopal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+signalling%3A+from+simple+switches+to+allosteric+microprocessors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Biased signalling: from simple switches to allosteric microprocessors.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (4), 243-260 (2018).</li>
<li>Dixon, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoLuc+Complementation+Reporter+Optimized+for+Accurate+Measurement+of+Protein+Interactions+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells.</a> ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).</li>
<li>Reyes-Alcaraz, A., Lee, Y. N., Yun, S., Hwang, J. I., Seong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+signatures+in+%CE%B2-arrestin2+reveal+natural+biased+agonism+at+a+G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Conformational signatures in β-arrestin2 reveal natural biased agonism at a G-protein-coupled receptor.</a> Communications Biology. 3, 1-128 (2018).</li>
<li>Promega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nanobit+Protein+Protein+Interaction+System+Protocol%22">Nanobit Protein Protein Interaction System Protocol</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/101/nanobit-protein-protein-interaction-system-protocol.pdf?la=en (2019).</li>
<li>Life Biomedical. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22HiYield+Gel%2FPCR+Fragments+Extraction+Kit%22">HiYield Gel/PCR Fragments Extraction Kit</a>. , https://www.lifebiomedical.com/uploads/2/4/7/2/24727678/gel_pcr_dna_fragments_extraction_kitydf_protocol_v3.0.pdf (2019).</li>
<li>New England BioLabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Ligation+Calculator%22">Ligation Calculator</a>. , https://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cosmo+Genetech%22">Cosmo Genetech</a>. , http://www.cosmogenetech.com/cosmo/productmngr/prm11.jsp?P_BR_CD=1&P_CTG_CD=1&P_PRODUCT_CD=1&P_N_PAGE=1&P_CAT_POS=
 (2019).</li>
<li>Baggio, L. L., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+incretins%3A+GLP-1+and+GIP%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Biology of incretins: GLP-1 and GIP.</a> Gastroenterology. 132, 2131-2157 (2007).</li>
<li>ProMega. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NanoGLO+Endurazine+and+Vivazine+Live+Cell+Substrates+Technical+Manual%22">NanoGLO Endurazine and Vivazine Live Cell Substrates Technical Manual</a>. , https://www.promega.com/-/media/files/resources/protocols/technical-manuals/500/nano-glo-endurazine-and-vivazine-live-cell-substrates-technical-manual.pdf?la=en (2019).</li>
<li>Ali, R., Ramadurai, S., Barry, F., Nasheuer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+fluorescent+protein+expression+for+quantitative+fluorescence+microscopy+and+spectroscopy+using+herpes+simplex+thymidine+kinase+promoter+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Bio%22%5BJournal%5D)">Optimizing fluorescent protein expression for quantitative fluorescence microscopy and spectroscopy using herpes simplex thymidine kinase promoter sequences.</a> FEBS Open Bio. 8 (6), 1043-1060 (2018).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

利用本文所述方法，可通过GPCR-β-阻遏蛋白结构互补检测法，在活体系统中实时监测任何GPCR与β-阻遏蛋白1/2之间的相互作用。在此方面，我们观察到GLP-1受体（一种典型的B类GPCR）对两种β-阻遏蛋白亚型的招募存在差异，并且在发光信号达到峰值数分钟后，还观察到受体-β-阻遏蛋白复合物的解离。
为了在结构互补实验体系中获得最佳的检测灵敏度，我们筛选了受体与每种β-抑制蛋白亚型之间的四种不同空间取向，选择其中发光信号最强的一种用于后续研究，例如剂量-反应刺激曲线（图4）。利用该方法，可对具有重要治疗价值的G蛋白偶联受体（GPCR）——如与内分泌疾病糖尿病15相关的受体——其与β-抑制蛋白的相互作用进行表征。同样，该策略可通过将感兴趣的GPCR在C末端标记LgBiT或SmBiT，并结合本文所述的β-抑制蛋白1/2构建体，轻松适配于任意GPCR研究，因而成为现有方法的一种强大替代方案，无需复杂的实验设置，避免了如BRET和FRET中常见的供体与受体间信号重叠所导致的技术障碍。...

G蛋白偶联受体（GPCR）是目前市场上近35%药物的作用靶点1,2，对其药理学特性的清晰理解在新型治疗药物的研发中至关重要3。在GPCR药物发现中，特别是在偏向性激动剂的开发过程中，一个关键环节是对新型配体在受体-β-阻遏蛋白相互作用方面的表征4，以及β-阻遏蛋白与其他胞质蛋白（如网格蛋白）之间的相互作用5。
已有文献记载，β-抑制蛋白依赖性信号转导在双相情感障碍、重度抑郁症和精神分裂症等神经系统疾病中发挥关键作用6，同时也与某些药物（如吗啡）的严重副作用相关7。
目前用于监测这些相互作用的方法通常无法真实反映研究中蛋白质的内源性生理水平，某些情况下信号较弱、存在光漂白现象，并且根据不同的G蛋白偶联受体（GPCR），实验建立可能在技术上具有挑战性8。这种新型的结构互补检测方法采用低表达启动子载体，以模拟内源性生理表达水平，并且与现有方法相比具有更高的灵敏度9。利用该方法，可轻松表征甘丙肽受体与β-抑制蛋白1/2以及β-抑制蛋白2与网格蛋白之间的相互作用10。该技术可广泛应用于任何特定的G蛋白偶联受体研究，尤其是在β-抑制蛋白发挥关键生理功能或其信号通路在某些疾病中具有重要意义的情况下。

<table><tbody><tr><td>抗生素 青霉素 链霉素</td><td>Welgene</td><td>LS202-02</td><td>Penicillin/Streptomycin</td></tr><tr><td>细菌培养箱</td><td>JEIO Tech</td><td>IB-05G</td><td>Incubator (Air-Jacket), Basic</td></tr><tr><td>细胞培养基</td><td>Welgene</td><td>LM 001-05</td><td>DMEM Cell culture medium</td></tr><tr><td>细胞转染培养基</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Optimem 1X cell culture medium</td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>NUAIRE</td><td>NU5720</td><td>Direct Heat CO2 Incubator</td></tr><tr><td>数字水浴锅</td><td>Lab Tech</td><td>LWB-122D</td><td>Digital water bath lab tech</td></tr><tr><td>DNA 聚合酶（校对功能）</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1011</td><td>PfU DNA polymerase</td></tr><tr><td>DNA 纯化试剂盒</td><td>Cosmogenetech</td><td>CMP0112</td><td>miniprepLaboPass Purificartion Kit Plasmid Mini</td></tr><tr><td>DNA Taq 聚合酶</td><td>Enzynomics</td><td>P750</td><td>nTaq DNA polymerase</td></tr><tr><td>限制性内切酶 BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>BglII</td></tr><tr><td>限制性内切酶缓冲液</td><td>New England Biolabs</td><td>B72045</td><td>CutSmart 10X Buffer</td></tr><tr><td>限制性内切酶 EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101L</td><td>EcoRI-HF</td></tr><tr><td>限制性内切酶 NheI</td><td>New England Biolabs</td><td>R01315</td><td>NheI</td></tr><tr><td>限制性内切酶 XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>XhoI</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco Canada</td><td>12483020</td><td>Fetal Bovine Serum</td></tr><tr><td>凝胶/PCR DNA 小量提取试剂盒</td><td>Real Biotech Corporation</td><td>KH23108</td><td>HiYield Gel/PCR DNA MiniKit</td></tr><tr><td>连接酶</td><td>ELPIS Biotech</td><td>EBT-1025</td><td>T4 DNA Ligase</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX53SF</td><td>CKX53 Microscope Olympus</td></tr><tr><td>脂质体转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Lipofectamine 2000</td></tr><tr><td>发光仪</td><td>Biotek/Fisher Scientific</td><td>12504386</td><td>Synergy 2 Multi-Mode Microplate Readers</td></tr><tr><td>NanoBiT 系统</td><td>Promega</td><td>N2014</td><td>NanoBiT PPI MCS Starter System</td></tr><tr><td>NanoLuc 荧光素酶底物</td><td>Promega</td><td>N2012</td><td>Nano-Glo Live Cell assay system</td></tr><tr><td>PCR 扩增仪</td><td>Eppendorf</td><td>6336000015</td><td>Master cycler Nexus SX1</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Poly-L-lysine solution</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Trysin EDTA 10X</td></tr><tr><td>白色细胞培养 96 孔板</td><td>Corning</td><td>3917</td><td>Assay Plate 96 well plate</td></tr></tbody></table>

实时监测活体系统中g蛋白偶联受体与β-阻遏蛋白1/2的相互作用以加速药物发现

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

G蛋白偶联受体（GPCR）与β-阻遏蛋白（β-arrestin）之间的相互作用是具有重要生理意义的关键过程。目前，在GPCR药物研发领域，尤其是在研究GPCR偏向性激动作用时，对新型药物与β-arrestin及其他胞质蛋白相互作用的表征具有极高价值。本文展示了应用一种新型结构互补检测方法，以在活体系统中实时精确监测受体与β-arrestin的相互作用。该方法简便、准确，可轻松扩展至任何感兴趣的GPCR，并且具有克服非特异性相互作用的优势，原因在于每个载体系统均含有低表达启动子。这种结构互补检测技术具备若干关键特性，能够实现对受体-β-arrestin相互作用的准确和精确监测，适用于研究任何GPCR系统的偏向性激动作用，以及由不同GPCR激酶（GRKs）所建立的GPCR羧基末端“磷酸化编码”，和影响受体-β-arrestin复合物稳定性或不稳定性的阻遏蛋白翻译后修饰。

使用本文所述方法，监测了原型G蛋白偶联受体（GPCR）与两种β-抑制蛋白（β-arrestin）亚型之间的相互作用。胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1r）构建体通过含有NheI和EcoRI酶切位点的引物制备，并克隆至pBiT1.1-C [TK/LgBiT] 和 pBiT2.1-C [TK/SmBiT] 载体中；而对于β-抑制蛋白，分别使用BgIII和EcoRI（β-arrestin2）以及NheI和XhoI（β-arrestin1）酶切位点，将其构建至另外两种载体pBiT1.1-N [TK/LgBiT] 和 pBiT2.1-N [TK/SmBiT] 中。使用50 ng GLP-1r-LgBiT/SmBiT质粒和50 ng在N端或C端标记有LgBiT或SmBiT的β-抑制蛋白质粒转染HEK293细胞。共筛选了四种不同的质粒组合（图3）并选择发光信号最强的一个进行后续实验（图4）。为了确定每种β-阻遏蛋白亚型招募的EC50值，采用剂量-反应曲线进行测定 10 μM, 1 μM，100 nM、10 nM 和 1 nM 的 G...

GPCR与β-阻遏蛋白相互作用是GPCR药物发现领域的一个新兴方向。为了在活体系统中监测此类相互作用，亟需准确、精确且易于建立的方法。本文展示了一种结构互补检测法，可用于实时监测活细胞中GPCR与β-阻遏蛋白的相互作用，并且该方法可拓展应用于任何GPCR。

实时监测活体系统中G蛋白偶联受体与β-阻遏蛋白1/2的相互作用以加速药物发现

G蛋白偶联受体（GPCRs）与β-arrestin之间的相互作用是具有重要生理意义的关键过程。...

该方案在药物发现与开发领域具有重要影响，尤其在开发副作用最小的新型首创药物方面。该技术的主要优势在于，可将其应用于任何G蛋白偶联受体（GPCR）系统，并用于实时获取活体系统中受体药理学的准确信息。该技术的应用前景与β-抑制蛋白（beta-arrestins）相关的新疗法密切相关。这些包括疼痛中的阿片受体和精神分裂症中的多巴胺受体。该方法在从神经学至心肺疾病的众多医学科研领域中均具有应用价值。我们方法的 PCR 演示至关重要，因为它能够详细展示方案中的关键步骤，而这是传统出版形式所无法实现的。首先设计引物，用于将目的基因引入 pBiT 载体。由于多克隆位点被一个同框的终止密码子分割，因此在进行定向克隆时，需从三个位点中至少选择一个作为两种独特的限制性内切酶之一。有关编码连接肽残基的核苷酸序列，请参考文献，并将其整合到引物中。对于 pBiT1.1-C 和 pBiT2.1-C，确保上游引物包含一个 ATG 密码子和一个强效的 Kozak 共识序列。对于 pBiT1.1-N 和 pBiT2.1-N，确保下游引物包含终止密码子。使用设计好的引物扩增目的基因的插入 DNA 片段。根据手稿说明混合PCR试剂，确保使用高保真DNA聚合酶以最大限度减少突变。设置好热循环仪并开始反应。完成PCR后，在50微升的体系中对产物进行消化反应。在1.5毫升离心管中，加入12微升蒸馏水、5微升相应的10倍限制性消化缓冲液和30微升PCR产物。然后加入每种限制性内切酶1.5微升。涡旋振荡反应混合物。在37.5摄氏度下孵育过夜。准备第二个反应以消化受体质粒。在1.5毫升离心管中，加入23微升水、5微升相应的10倍限制性消化缓冲液、15微升受体质粒，以及每种限制性内切酶各1.5微升。轻轻混匀离心管，并在37.5摄氏度下孵育过夜。在克隆与转化后的第二天，挑取3至10个单菌落，转移至含有氨苄青霉素的1毫升LB培养基中。将细胞孵育六小时。然后取200 µL细菌悬液转移至含氨苄青霉素的5 mL新鲜LB培养基中。在37.5 °C、200 rpm振荡条件下过夜培养。第二天，使用质粒小提DNA纯化试剂盒提取质粒。通过PCR筛选纯化后的质粒，以确认连接是否成功。转染前一天，将细胞接种于多聚-L-赖氨酸包被的96孔板中，培养基为添加了10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素G和100微克/毫升链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基。仅将细胞加入96孔板的60个内侧孔中，以尽量减少孔板上的温度梯度以及边缘蒸发效应。向36个外周孔中加入200微升无菌蒸馏水，并在孔与孔之间的空间加入150微升无菌蒸馏水。随后将孔板置于37.5摄氏度、5%二氧化碳条件下过夜培养。第二天，使用总共100纳克DNA进行转染。根据论文中的指示设置四种不同的质粒组合。每孔使用20微升以HEPES缓冲的改良Eagle培养基（MEM）和0.3微升脂质转染试剂。向每孔加入20微升脂质转染试剂与DNA混合物，将培养板以圆形方式混匀10秒。在37.5摄氏度及5%二氧化碳条件下孵育6小时。更换新鲜培养基。再孵育 24 小时。孵育结束后，吸去培养基，每孔加入 100 µL 用 HEPES 缓冲的改良 Eagle 最低必需培养基。将培养板在室温下静置 10 分钟以使其稳定。同时，通过将1份100倍浓度的呋喃唑酮底物与19份LCS稀释缓冲液混合，配制5倍浓度的底物储备液，用于与细胞培养基混合。当细胞准备就绪后，向每孔加入25微升该储备液，并轻轻混匀培养板10秒。随后在室温下测量发光信号10分钟，以确保信号稳定。对于添加配体的实验，使用 HEPES 缓冲的改良伊格尔最低必需培养基配制 13.5X 配体溶液，并使用多通道移液器每孔加入 10 微升。然后用手或轨道摇床混匀培养板。该方案已成功用于研究典型 G 蛋白偶联受体与两种 β-抑制蛋白亚型之间的相互作用。筛选了四种不同的质粒组合，并选择发光信号最强的一种用于后续实验。每种β-抑制蛋白亚型的EC50值通过剂量-反应曲线确定，该曲线来源于动力学研究中各浓度对应的最大反应值。设计PCR引物时必须格外注意。构建正确的载体对于这些检测的成功至关重要。通过采用此方法，您将能够监测受体与β-阻遏蛋白之间的相互作用，以及受体与其他胞质蛋白之间的相互作用。该方法将有助于通过研究配体结构的改变如何调节GPCR与β-阻遏蛋白的相互作用，来回答GPCR药理学领域的基本科学问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

监测GPCR-β-阻丁1/2实时生命系统中的相互作用,加速药物发现

本文所述的基于荧光的钙流测定法是一种中等通量的反向药理学筛选系统，用于鉴定孤儿G蛋白偶联受体（GPCRs）的功能性激活配体。...

基于荧光的钙离子动员检测法表征G蛋白偶联受体

受体转运可调节细胞对配体的信号转导及反应性，并且其自身也响应细胞内的各种条件，包括配体诱导的信号通路。本文中，我们介绍一种强大且灵活的技术，通过免疫标记和共定位分析，定量评估药物诱导的受体转运。...

通过共定位分析追踪药物诱导的受体内在化后转运变化

检测G蛋白偶联受体对G蛋白选择性激活的简便方法，目前仍是细胞信号转导领域尚未解决的挑战。本文通过将G蛋白偶联受体（GPCR）与G蛋白肽段成对锚定，构建了基于福斯特共振能量转移（FRET）的生物传感器，可在活细胞中以可控浓度探测构象变化。...

使用活细胞悬浮荧光计检测法通过FRET传感器测量G蛋白选择性G蛋白偶联受体构象

本文介绍了一种对表达绿色荧光蛋白标记的血管紧张素Ⅱ...

活细胞成像与三维分析转染人胚胎肾细胞中血管紧张素受体1a亚型的转运——基于共聚焦显微镜技术

所述细胞检测旨在鉴定能够抑制或刺激CXC趋化因子受体4（CXCR4）相互作用的试剂，这些试剂可通过竞争性或变构方式抑制或激活由CXCR4激活引发的细胞内Ca2+...

一种基于动力学荧光的 Ca2+ 流动检测方法，用于鉴定 G 蛋白偶联受体激动剂、拮抗剂及别构调节剂

本文介绍了一种简便的荧光检测方法，用于评估氨基酰-tRNA合成酶/tRNA配对在哺乳动物细胞表达蛋白中掺入非经典氨基酸（ncAAs）的效率。文中还描述了将非经典氨基酸应用于G蛋白偶联受体（GPCRs）研究的实例，包括结合位点的光交联定位以及在活细胞中对GPCR进行生物正交标记。...

优化化学探针在G蛋白偶联受体中的遗传编码，用于活体哺乳动物细胞中的光交联定位与生物正交化学研究

鉴于G蛋白偶联受体（GPCRs）是极具潜力的药物靶点，因此GPCR配体筛选对于发现先导化合物以及开展孤儿受体去孤儿化研究至关重要。为此，我们介绍了PRESTO-Tango，这是一个开源资源平台，利用基于TEV的报告基因检测方法，可同时对近300种GPCR上β-阻遏蛋白2（β-arrestin2）的瞬时招募进行分析。...

使用PRESTO-Tango检测技术在全GPCR范围内并行检测β-阻遏蛋白2招募以进行配体筛选

S1P 通过鞘氨醇-1-磷酸受体（S1PRs）亚家族发挥其多种生理作用。本文描述了一种用于阐明 S1PRs...

研究鞘氨醇-1-磷酸受体结构与信号通路的实验流程

本研究描述了一种用于384孔板的高通量细胞内钙荧光检测方法，可用于在重组G蛋白偶联受体（GPCRs）上筛选小分子文库。该检测以牛蜱Rhipicephalus...

一种用于高通量筛选重组G蛋白偶联受体的“双加样”钙荧光检测法

本研究中介绍的实验方案展示了cAMP差异检测器In...

利用荧光cAMP差异检测器原位监测活细胞中cAMP的实时动态变化

本方案描述了基于BRET的生物传感器在G蛋白偶联受体配体刺激下，对活体HEK293细胞中G蛋白活化进行实时检测的应用。本文以β2-肾上腺素能受体和1型大麻素受体为例，展示了该传感器在多种G蛋白亚型及不同G蛋白偶联受体中的检测效率。...

基于BRET的G蛋白生物传感器用于活细胞中G蛋白偶联受体活性的检测

了解结构互补检测法在活细胞中实时监测GPCR-β-arrestin相互作用的技术。该方法适用于任何GPCR系统，可为药物发现和受体药理学研究提供准确信息，助力开发副作用最小的新型药物。

实时监测活体系统中G蛋白偶联受体与β-阻遏蛋白1/2的相互作用以加速药物发现

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