细菌、酵母和人类细胞中瞬态形成的分子茶龙组件的原位监测

此方法捕获细菌和酵母等生物体以及不同细胞类型的瞬态蛋白质相互作用。在这里，我们监测暂时形成的特定伴郎复合物，涉及细胞蛋白转移。该技术的主要优点是能够生成关于原核细胞和真核细胞中蛋白质组件的动态和亚细胞定位的信息。

在细菌和酵母等单细胞生物体中，这种技术的适应使得研究人员能够用它作为研究与微生物感染有关的疾病的有力工具。这种技术有可能用于分析几乎所有生物体的蛋白质相互作用，只需改变协议样品制备阶段的条件即可。选择在免疫组织化学、免疫荧光、ELISA 或免疫沉淀中特异性和测试的优质抗体非常重要。

首先使用聚 L-Lysine 预处理 10 个井诊断幻灯片。将 100 微升无菌和过滤 0.0001%聚-L-莱辛添加到每一个井中，并在无菌层水流罩中孵育幻灯片 30 分钟。然后，用50微升无菌水清洗每一个井，以去除多余的聚L-莱辛。

根据细胞类型，每井加入约15，000个细胞，并在37摄氏度的无菌湿润培养箱中生长细胞，将5%的二氧化碳培养成60至80%的汇合。24小时后，将纸巾放在每井边缘，取出生长介质，用50微升PBS洗三次细胞。然后，将50微升新鲜准备好的4%甲醛在PBS中添加到每井中，并在室温下孵化10分钟，来修复细胞。

固定后，将幻灯片与 PBS 一起淹没在滑动染色罐中，将幻灯片冲洗三次。要渗透附着细胞的膜，将幻灯片淹没在PBS中0.5%Triton-X100的100毫升，并在室温下孵育细胞10分钟。然后用 TBS-T 洗三次幻灯片。

最后一次洗涤后，用纸巾取出多余的缓冲液。根据手稿指示生长和稀释S.cerevisiae细胞，然后将它们转移到50毫升的离心管中，以665倍g的离心进行造粒，三分钟。取出上一除素，用五毫升新鲜介质重新暂停细胞。

然后加入550微升37%甲醛的最终浓度为4%，并在室温下孵育培养物15分钟以修复细胞。孵育后，将细胞粒粒，取出上经剂，将颗粒重新在一毫升新鲜准备的4%甲醛洗涤缓冲液中。在室温下孵育细胞45分钟。

同时，通过在每个井中加入100微升0.0001%聚-L-Lysine溶液，并在室温下将幻灯片孵育30分钟，来准备诊断幻灯片。然后用超纯水洗去多余的聚L-莱辛，让滑梯风干。孵育步骤后，用一毫升的洗涤缓冲液通过离心洗涤细胞两次。

取出上流液，在洗涤缓冲液中重新填充细胞。上次洗涤后，将细胞切开，然后取出上清液，将细胞重新在含有1.2摩尔松醇的洗涤缓冲液中重新暂停。要消化细胞壁，再次对细胞进行颗粒化，并在250微升新鲜准备好的Lyticase溶液中重新给细胞重新下水。

在30摄氏度下用温和的震动孵育细胞15分钟。消化步骤后，在洗涤缓冲液中清洗细胞三次，并在含有1.2摩尔索比托的250微升洗涤缓冲液中重新填充细胞。在每个聚L-Lysine涂层的井中加入20微升再悬浮细胞，使固定和渗透细胞附着30分钟。

用50微升洗涤缓冲液洗三次，以去除非粘附细胞，并继续进行接近结扎测定。启动接近结扎测定，或PLA协议，在每一个井中加入一滴阻塞缓冲液，并在37摄氏度下在潮湿室中孵化滑梯30分钟。将一张纸巾放在每一个井的边缘，将细胞洗涤两次，在100毫升的洗涤缓冲液中清洗细胞。

取出初级抗体溶液，在洗涤缓冲液中洗涤两次，洗涤后，将四十微升的二次抗体溶液添加到每井中，并在潮湿室的37摄氏度下孵育幻灯片60分钟。然后取出溶液，在洗涤缓冲液中洗涤两次，然后将含有连接器寡核苷酸和DNA结扎的40微升加入每个井，并在37摄氏度的潮湿室中孵育30分钟的幻灯片。孵育后，去除结扎混合物，用洗涤缓冲液A.加入40微升DNA扩增混合物，其中含有DNA聚合酶和荧光标记的寡核苷酸，到每井中孵育100分钟，在37摄氏度的潮湿室中孵育。

去除放大混合物，在 100 毫升洗涤缓冲液 B 中清洗幻灯片 10 分钟。然后用100毫升的洗涤缓冲液B洗涤滑梯，在超纯水中稀释1至100。每孔添加 20 微升含 DAPI 安装介质。

用盖滑盖住滑轨的井，用指甲油密封。该协议已成功用于监测不同 J 域蛋白和 Hsp70 伴郎和 J 域蛋白之间形成的瞬态伴郎组件，这些蛋白在 HeLa、S.cerevisiae 和大肠杆菌细胞中形成。人类 A 类和 B 类 J 域蛋白以高度特异性原抗体为目标。

每个红色荧光双子表示在 HeLa 细胞中两种不同的 J 域蛋白之间形成的蛋白质复合物。类似的混合类J-域蛋白复合物也观察到在单细胞真核生物S.cerevisiae，或面包师的酵母。由于细胞尺寸小，从PLA生成的一些荧光蓬蒂更难作为个体的细胞解决。

在大肠杆菌细胞中未观察到 A 类和 B 类 J 域蛋白之间的复杂形成，这与使用纯化蛋白质进行的生化研究一致。但其他涉及J域蛋白和Hsp70伴郎的陪护组件是使用PLA协议捕获的。在原本完整的PLA反应中，缺乏对相互作用的J域蛋白或伴用的一种初级抗体的技术控制表明细胞中很少或没有荧光蓬蒂形成，表明缺乏假阳性信号放大。

要使用接近结扎测定获得可靠的结果，请事先验证所用抗体是否足够质量。此外，采取预防措施，避免含有细胞壁的细胞过度消化。