Name: 细菌、酵母和人类细胞中瞬态形成的分子茶龙组件的原位监测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: 学习原位邻近连接测定法监测细菌、酵母和人类细胞中瞬态形成的分子伴侣复合物，揭示J结构域蛋白与Hsp70的相互作用动态及亚细胞定位，为研究蛋白质稳态和微生物感染相关疾病提供重要工具。

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NBN 得到了维多利亚州政府和澳大利亚政府资助的莫纳什大学医学、护理与健康科学学院特别招聘基金的支持。我们感谢 Bernd Bukau（德国海德堡大学 ZMBH）和 Harm H. Kampinga（细胞生物医学科学系） &amp;#38; 系统，荷兰格罗宁根大学）提供的宝贵支持与试剂共享，感谢Holger Lorenz（德国海德堡大学ZMBH成像中心）在共聚焦显微镜与图像处理方面的支持，感谢Claire Hirst（澳大利亚莫纳什大学再生医学研究所）对稿件的审阅。

1. HeLa 细胞准备
<ol>
	<li>准备以下材料：PBS（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4)，pH 7.4；含10% FCS和1%青霉素-链霉素的DMEM；PBS中含4%多聚甲醛；PBS中含0.5% Triton-X100；TBS-T（150 mM NaCl，20 mM Tris，0.05% Tween），pH 7.4；0.0001%无菌聚-L-赖氨酸溶液；10孔诊断用载玻片；湿盒；滤纸；以及Coplin染色缸。 
	注意： 为确保最佳固定效率，每次实验前应新鲜配制多聚甲醛溶液。</li>
	<li>用湿纸巾铺满密闭盒子的底部，制备一个湿化室。实验开始前将湿化室置于37 °C环境中，以确保酶促反应孵育期间湿化室温度保持在37 °C。</li>
	<li>在T25培养瓶中培养HeLa细胞，加入5 mL DMEM（高糖、含谷氨酰胺和丙酮酸钠）培养基，添加10% FCS和1%青霉素-链霉素，置于37 °C CO₂培养箱中培养。2 含5% CO₂的培养箱2使用0.05%胰蛋白酶-EDTA消化贴壁细胞。细胞解离后加入新鲜DMEM，用细胞计数板计数细胞，并接种于湿盒内的诊断玻片上进行培养。</li>
	<li>在无菌细胞培养罩中通过紫外线照射对诊断载玻片进行30分钟灭菌处理。</li>
	<li>向实验所需的每个孔中加入 100 µL 无菌滤过的 0.0001% 聚-L-赖氨酸。孵育 30 分钟。用 50 µL 超纯水洗涤每孔 3 次，以去除多余的聚-L-赖氨酸&#160;水</li>
	<li>用胰蛋白酶消化HeLa细胞，并向每孔加入约15,000个细胞。如有必要，将细胞稀释至每孔至少30–50 µL的DMEM培养基。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养细胞2 在培养箱中孵育约24小时。开始进行PLA实验前，细胞汇合度应达到60%–80%。 
	注意： 过高的细胞汇合度会降低试剂的吸收，从而导致实验方案结束时获得的信号减弱。</li>
	<li>用纸巾从孔的边缘吸去培养基。用 50 µL PBS 洗涤孔 3 次。 
	注意： 当液体被剧烈加入时，细胞可能发生脱落。为防止此现象，应在加入新液体前避免孔内完全干燥，并将新液体轻柔地沿孔壁加入。</li>
	<li>向每孔中加入50 µL新配制的4%多聚甲醛PBS溶液固定细胞，在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>将载玻片在 PBS 中洗涤 3 次。使用含有 100 mL PBS 的 Coplin 染色缸进行洗涤。每次洗涤于室温孵育 5 分钟，不振荡。</li>
	<li>将载玻片浸入盛有100 mL PBS中含0.5% Triton-X100的考普林染色缸中，以通透细胞膜。室温下孵育10分钟，不振荡。</li>
	<li>将载玻片在TBS-T中洗涤3次。洗涤在含有100 mL TBS-T的科柏林染色缸中进行。每次洗涤于室温孵育5分钟，不摇动。</li>
	<li>最后一次洗涤后，用滤纸吸去多余的缓冲液。此时细胞已准备好，可进行第4节中将要讨论的邻近连接实验（Proximity Ligation Assay）操作。</li>
</ol>
2. S. cerevisiae 细胞制备
<ol>
	<li>准备以下材料：100 mM KPO4，pH 6.5，称为洗涤缓冲液；37%甲醛；含4%多聚甲醛的100 mM KPO4，pH 6.5；含1.2 M山梨醇的100 mM KPO4，pH 6.5；裂解酶溶液（500 µg/mL裂解酶，20 mM β-巯基乙醇，100 mM KPO4，pH 6.5）；0.0001%聚-L-赖氨酸溶液；含1% Triton-X100的100 mM KPO4，pH 6.5；10孔诊断载玻片；湿盒（按步骤1.2方法制备）；滤纸；以及Coplin染色缸。 
	注意： 为确保最佳固定效率，多聚甲醛溶液应在每次实验前新鲜配制。</li>
	<li>在非选择性酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基中，于30 °C振荡培养过夜。 
	注意： 根据实验需求，可改用完全合成（SC）培养基或选择性最小合成（SM）培养基培养 S. cerevisiae 细胞。</li>
	<li>将静止期培养物用20 mL培养基稀释至OD600为0.1。于30 °C振荡培养，直至OD600达到0.5。</li>
	<li>将20 mL培养物转移至50 mL离心管中，在665 × g 条件下离心3分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于5 mL新鲜培养基中。</li>
	<li>向培养物中加入550 µL 37%甲醛以固定细胞。室温孵育15分钟。</li>
	<li>在665 × g 条件下离心3分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL新配制的含4%多聚甲醛的洗涤缓冲液中。室温孵育45分钟。</li>
	<li>在孵育期间，通过向每个孔中加入100 µL 0.01%聚-L-赖氨酸溶液来处理诊断载玻片。室温孵育30分钟。</li>
	<li>30分钟后，用超纯水洗去多余的聚-L-赖氨酸，并让载玻片自然晾干。干燥后的载玻片即可使用。</li>
	<li>用1 mL洗涤缓冲液洗涤细胞两次。每次洗涤均在665 × g 条件下离心3分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于洗涤缓冲液中。</li>
	<li>在665 × g 条件下离心3分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞重悬于1 mL含1.2 M山梨醇的洗涤缓冲液中。</li>
	<li>在665 × g 条件下离心3分钟收集细胞。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于250 µL新配制的裂解酶溶液中，以消化细胞壁。于30 °C振荡孵育15分钟。</li>
	<li>消化完成后，以665 × g 离心3分钟，洗涤细胞3次，每次均弃去上清液。将细胞重悬于250 µL含1.2 M山梨醇的洗涤缓冲液中。 
	注意： 由于细胞壁消化后细胞较为脆弱，重悬时应格外小心，避免损伤细胞。</li>
	<li>取20 µL重悬的细胞加入已涂有聚-L-赖氨酸的载玻片孔中。静置30分钟使细胞贴附。用50 µL洗涤缓冲液洗涤孔内3次，洗去未贴附的细胞。</li>
	<li>用50 µL含1% Triton-X的洗涤缓冲液洗涤3次，以通透细胞膜。 
	注意： 此时细胞已准备好，可进行第4节中将讨论的邻近连接实验（proximity ligation assay）方案。</li>
</ol>
3. E. coli 细胞制备
<ol>
	<li>准备以下材料：PBS-T（140 mM NaCl，2 mM KCl，8 mM K2HPO4，1.5 mM KH2PO4，0.05% Tween-20），pH 7.4；溶菌酶溶液（2 mg/mL 溶菌酶，25 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM 葡萄糖，10 mM EDTA）；0.0001% 多聚-L-赖氨酸溶液；99% 冰甲醇；99% 室温甲醇；99% 丙酮；10孔诊断载玻片；湿盒（按步骤1.1.1方法制备）；滤纸；以及Coplin染色缸。</li>
	<li>在LB（Luria-Bertani）培养基中于30 °C振荡培养过夜菌液。</li>
	<li>将静止期菌液用新鲜LB培养基稀释至OD600为0.02，于30 °C振荡培养至OD600达到0.4，获得对数生长期细胞。</li>
	<li>在细胞接近OD600为0.4前约15分钟，通过向每个孔中加入100 µL 0.0001% 多聚-L-赖氨酸溶液制备多聚-L-赖氨酸包被的载玻片，室温孵育30分钟。</li>
	<li>孵育30分钟后，用超纯水洗去多余的多聚-L-赖氨酸，让载玻片自然晾干。干燥后的载玻片即可使用。</li>
	<li>当细胞OD600达到0.4时，取1 mL菌液转移至无菌微量离心管中，在2,650 x g条件下离心2分钟以收集细胞沉淀。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于50 µL LB培养基中。</li>
	<li>加入1 mL冰冻的99%甲醇固定细胞，手动轻轻混匀，于-20 °C孵育30分钟。</li>
	<li>固定完成后，取20 µL细胞悬液加至多聚-L-赖氨酸包被的载玻片各孔中，室温晾干30分钟。</li>
	<li>向每个孔中加入50 µL新鲜配制的溶菌酶溶液以消化细胞壁，在湿盒中25 °C孵育30分钟。</li>
	<li>用滤纸接触孔边缘吸除溶菌酶溶液，随后用100 mL PBS-T在Coplin染色缸中洗涤载玻片3次，每次30秒，不振荡。</li>
	<li>将载玻片在滤纸上轻拍以去除残留洗涤液。</li>
	<li>向每个孔中加入50 µL 99%甲醇以通透细胞膜，室温孵育1分钟。</li>
	<li>用滤纸接触孔边缘吸除甲醇。</li>
	<li>向每个孔中加入50 µL 99%丙酮，孵育1分钟。</li>
	<li>用滤纸接触孔边缘吸除多余丙酮，让载玻片自然晾干。至此，细胞已准备好用于第4节中将讨论的邻近连接实验方案。</li>
</ol>
4. 邻近连接实验
<ol>
	<li>准备以下材料：封闭缓冲液；抗体稀释缓冲液；洗涤缓冲液 A（10 mM Tris，150 mM NaCl，0.05% Tween-20），pH 7.4；洗涤缓冲液 B（200 mM Tris，100 mM NaCl），pH 7.4；抗兔二抗 PLUS；抗小鼠二抗 MINUS；5×连接缓冲液；连接酶；5×扩增缓冲液（橙色：λex&#160;554&#160;nm；λem&#160;576&#160;纳米）；聚合酶；超纯水；含DAPI的封片剂。 
	注意：PLA 检测试剂也有绿色（λex 495 nm；λem 527 nm），红色（λex 594 nm；λem 624 nm），远红光（λex 644 nm；λem 669 nm）或明场（辣根过氧化物酶（HRP）偶联）</li>
	<li>在每个孔中加入一滴封闭缓冲液以封闭细胞。在湿盒中37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>用抗体稀释缓冲液稀释储存抗体，配制抗体溶液。每孔需要40 µL抗体溶液。</li>
	<li>用纸巾从孔的边缘吸去封闭缓冲液。每孔加入40 µL用抗体稀释缓冲液稀释的一抗。在37 °C湿盒中孵育60分钟，或在4 °C孵育过夜。</li>
	<li>用纸巾从孔的边缘吸去抗体溶液。在Coplin染色缸中，用100 mL洗涤缓冲液‘A’清洗载玻片2次，每次5分钟，不摇动。</li>
	<li>在洗涤步骤期间，将5倍稀释的二抗探针anti-rabbit PLUS稀释 &amp;#38; 抗小鼠 MINUS（探针的种属特异性取决于所用的一抗），使用抗体稀释缓冲液配制。每孔准备 40 µL 抗体溶液。</li>
	<li>每孔加入 40 µL 二抗溶液，在 37 °C 湿润环境中孵育 60 分钟。</li>
	<li>用纸巾从孔的边缘吸去二抗溶液。将载玻片置于盛有100 mL洗涤缓冲液A的考普林染色缸中，不摇动，5分钟洗2次。</li>
	<li>在洗涤过程中，每孔配制 40 µL 连接反应混合液，其中包含 8 µL 5x 连接缓冲液、31 µL 超纯水和 1 µL 连接酶。</li>
	<li>向每个孔中加入40 µL连接反应混合物。在湿盒中37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>用纸巾从孔的边缘吸去连接反应混合物。将载玻片置于盛有100 mL洗涤缓冲液A的考普林染色缸中，不振荡，清洗2次，每次2分钟。</li>
	<li>在洗涤过程中，每孔配制40 µL扩增混合液，其中包含8 µL 5倍扩增溶液、31.5 µL超纯水和0.5 µL聚合酶。 
	注意： 5倍扩增液含有荧光探针。请将此混合液避光保存。在后续每一步骤中，均需对载玻片进行避光处理。若使用半透明的科平染色缸或湿盒，请用铝箔包裹。</li>
	<li>每孔加入 40 µL 扩增混合液。在湿盒中 37 °C 孵育 100 分钟。</li>
	<li>从孔中移除扩增混合物。在Coplin染色缸中，用100 mL洗涤缓冲液B洗涤载玻片2次，每次10分钟，期间不摇动。</li>
	<li>在 Coplin 染色缸中，用 100 mL 超纯水按 1:100 稀释的洗涤缓冲液 ‘B’ 清洗载玻片，持续 30 秒。</li>
	<li>每孔加入 20 µL 含 DAPI 的封片剂，盖上盖玻片并用指甲油密封。</li>
	<li>若进行成像，立即加入含DAPI的封片液，避光孵育10–15分钟；若不进行成像，将载玻片置于-20 °C避光保存，最多可保存1周。</li>
</ol>
5. 检测
<ol>
	<li>使用共聚焦显微镜分别采用20x/0.8 NA、63x/1.4 NA和100x/1.4 NA的Plan Apochromat物镜获取HeLa、S. cerevisiae和E. coli细胞的图像。使用405 nm脉冲二极管激光器激发DAPI染色的DNA。对于本研究中的PLA信号，使用561 nm固体激光器进行激发。</li>
</ol>

<ol><li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Weibrecht, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+ligation+assays%3A+a+recent+addition+to+the+proteomics+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox.</a> Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).</li>
<li>Mayer, M. P., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+structural+and+mechanistic+aspects+of+Hsp70+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).</li>
<li>Kampinga, H. H., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HSP70+chaperone+machinery%3A+J+proteins+as+drivers+of+functional+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).</li>
<li>Nillegoda, N. B., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metazoan+Hsp70-based+protein+disaggregases%3A+emergence+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li>
<li>Bracher, A., Verghese, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+exchange+factors+of+Hsp70+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).</li>
<li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+HSP70+co-chaperone+complex+unlocks+metazoan+protein+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation.</a> Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).</li>
<li>Nillegoda, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+an+intricate+J-protein+network+driving+protein+disaggregation+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Kirstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+properties+of+the+disaggregase+function+of+J-proteins+and+Hsc70+in+Caenorhabditis+elegans+stress+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging.</a> Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).</li>
<li>Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Disaggregation+in+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Protein Disaggregation in multicellular organisms.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

基于免疫共沉淀和共定位的方法长期以来被用于表征蛋白质复合物。然而，利用这些传统方法检测瞬时形成的特异性分子伴侣复合物仍面临重大挑战，因此以往的研究结果在很大程度上局限于定性分析。&#160; 解释。基于细胞裂解的免疫共沉淀技术通常需要交联以稳定蛋白质-蛋白质相互作用。&#160;细胞裂解会增加破坏瞬时形成的分子伴侣复合物的风险，而交联可能引入非天然的相互作用，尤其是由于大多数分子伴侣本身具有“黏性”所致。在利用共免疫沉淀分析Hsp70分子伴侣系统时，可能出现的假象包括&#160;源于（a）分子伴侣的高表达水平和（b）&#160;溶解度&#160;与膜或蛋白质聚集体相关的问题&#160;结合的分子伴侣复合物。此外，基于免疫共沉淀的技术无法提供被捕获蛋白质复合物的细胞定位信息，而这些信息对于阐明其相关功能可能至关重要。使用免疫共沉淀技术的缺点在基于共定位的方法中有所减少，后者能够保持&#160;蛋白质定位信息。然而，两种或多种蛋白质的共定位可能表明蛋白质之间存在直接相互作用，也可能仅反映这些蛋白质被分配到细胞中的同一微区。因此，共定位分析在预测蛋白质相互作用方面最多仅具有推测性，且无法提供任何接近程度的量化信息。由于该技术对靶标蛋白质的检测...

由于我们对细胞相互作用组的理解尚不完整，大量基因组信息仍无法解读。传统的蛋白质-蛋白质相互作用检测方法，如蛋白质共免疫沉淀（无论是否结合化学交联）以及蛋白质共定位，尽管被广泛使用，但仍存在一系列缺点。其中一些主要缺点包括对相互作用的定量能力较差，以及可能引入非天然的结合事件。&#160;&#160;相比之下，新兴的基于邻近性的技术为捕获细胞内蛋白质相互作用提供了另一种强大而有效的途径。邻近连接实验（proximity ligation assay, PLA）1目前已作为专有试剂盒提供，其利用&#160;抗体特异性地识别相互作用亚基之间空间邻近的蛋白质复合物。
PLA 由以下步骤启动：&#160; 由初级和次级抗体与小段DNA标签（PLA探针）在靶向蛋白质复合物表面形成的支架结构（图1，步骤1-3）。接下来，根据DNA标签的邻近性，通过与连接寡核苷酸杂交生成环状DNA分子（图1，步骤4）。环状DNA的形成通过DNA连接步骤完成。新形成的环状DNA片段可作为后续反应的模板&#160;基于与抗体支架相连的共价结合寡核苷酸标签引物的滚环扩增（rolling circle amplification, RCA）聚合酶链式反应（PCR），生成一条通过抗体支架与蛋白质复合物相连的单链串联重复DNA分子图1，步骤6）。使用荧光标记的寡核苷酸对扩增DNA上分散的多个独特序列进行杂交，以可视化串联重复的DNA分子&#160;(图1，步骤 7）2产生的PLA信号呈现为荧光点（图1，步骤7）对应于目标蛋白质复合物在细胞内的位置。因此，该检测方法能够以高空间精度检测蛋白质复合物。该技术不仅限于捕获蛋白质相互作用，还可用于高灵敏度地检测单个分子或蛋白质上的蛋白质修饰1,2.
Hsp70 形成一个高度多功能的分子伴侣系统，在通过参与多种&#160;日常维持和应激相关功能来维持细胞内蛋白质稳态方面具有根本性的重要作用。Hsp70 分子伴侣系统的日常功能包括&#160;从头蛋白质折叠、蛋白质跨细胞膜转运、蛋白质复合物的组装与解离、蛋白质活性的调控，以及连接不同的蛋白质折叠/质量控制机制3。同一分子伴侣系统还能重新折叠错误折叠或未折叠的蛋白质，防止蛋白质聚集，促进蛋白质去聚集，并与细胞蛋白酶协同作用，降解终末错误折叠或受损的蛋白质，从而促进细胞在蛋白毒性应激后的修复4,5。为实现这种功能多样性，Hsp70 分子伴侣依赖于 JDP 家族的共伴侣蛋白和核苷酸交换因子（NEFs），这些因子可精细调节 Hsp70 依赖 ATP 的变构调控，从而控制底物的结合与释放3,6。此外，JDP 共伴侣蛋白在&#160;选择&#160;该多功能分子伴侣系统的&#160;底物方面发挥着关键作用。&#160;该家族成员根据其与原型 JDP（即 E. coli DnaJ）的结构同源性，分为三类（A、B 和 C）。A 类 JDP 包含一个 N 端 J 结构域（与 Hsp70 相互作用）、一个富含甘氨酸-苯丙氨酸的区域、一个由锌指样区域（ZFLR）和两个 β-桶状结构域组成的底物结合区，以及一个 C 端二聚化结构域。具有 N 端 J 结构域和富含甘氨酸-苯丙氨酸区域但缺乏 ZFLR 的 JDP 归为 B 类。通常，这两类成员均&#160;参与分子伴侣功能。属于统括性 C 类的成员仅共享 J 结构域4，它们招募 Hsp70 执行多种非分子伴侣功能。JDP 作为 Hsp70 系统中可互换的底物识别“适配器”的重要作用体现在该家族成员在进化过程中的扩展。例如，人类拥有超过 42 个不同的 JDP 成员4。这些 JDP 以单体、同源二聚体和/或同源/异源寡聚体形式发挥作用4,5。最近有研究报道，A 类（如 H. sapiens&#160;DNAJA2；S. cerevisiae Ydj1）与 B 类（如 H. sapiens DNAJB1；S. cerevisiae Sis1）真核 JDP 之间可通过瞬时复合物的形成实现功能协作，从而在体外促进对无定形蛋白质聚集体的有效识别7,8。这些混合类别的 JDP 复合物可能在聚集蛋白表面组装，以促进基于 Hsp70 以及 Hsp70 与 Hsp100 联合的蛋白质去聚集酶的形成7,8,9,10。支持这些瞬时形成的混合类别 JDP 复合物在真核细胞中存在的关键证据来自 PLA 技术8。
邻位连接技术（PLA）正越来越多地用于评估后生动物（尤其是哺乳动物细胞）中的蛋白质相互作用。本文中，我们报告了该&#160;技术成功拓展应用于监测真核和原核单细胞生物（如出芽酵母 S. cerevisiae 和大肠杆菌 E. coli）中瞬时形成的分子伴侣复合物。&#160;尤为重要的是，这一拓展突显了PLA在检测和分析感染人类及动物细胞的微生物方面的潜在应用价值。

<table><tbody><tr><td>37% 甲醛</td><td>Merck</td><td>103999</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>抗 DNAJA2 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab157216</td><td></td></tr><tr><td>抗 DNAJB1 抗体</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ADI-SPA-450</td><td></td></tr><tr><td>抗 DnaK 抗体</td><td>本实验室制备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 mCherry 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab125096</td><td></td></tr><tr><td>抗 Sis1 抗体</td><td>Cosmo Bio Corp</td><td>COP-080051</td><td></td></tr><tr><td>抗 Ydj1 抗体</td><td>StressMarq Biosciences</td><td>&amp;nbsp;SMC-150,</td><td></td></tr><tr><td>抗 YFP 抗体</td><td>本实验室制备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coplin 染色缸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5516</td><td></td></tr><tr><td>诊断用载玻片</td><td>Marienfeld</td><td>1216530</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Thermo-Fischer</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink 原位检测试剂（橙色）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92007</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink 原位封片介质 + DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink 原位 PLA 探针 抗小鼠 MINUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink 原位 PLA 探针 抗兔 PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td></td></tr><tr><td>DuoLink 原位洗涤缓冲液（荧光用）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermo-Fischer</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo-Fischer</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P47-07</td><td></td></tr><tr><td>山梨醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7547</td><td></td></tr><tr><td>吐温-X100</td><td>Merck</td><td>108643</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Thermo-Fischer</td><td>25300096</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Zymolase 100T / / 溶壁酶</td><td>United States Biological</td><td>Z1004</td><td></td></tr></tbody></table>

原位监测细菌、酵母和人类细胞中瞬时形成的分子伴侣复合物

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J结构域蛋白（JDP）是真核细胞中最大且最多样化的一类共伴侣蛋白家族。最近的研究发现，JDP家族中的特定成员可在真核生物中形成瞬时异源复合物，从而精细调控70 kDa热休克蛋白（Hsp70）伴侣介导的蛋白去聚集酶对底物的选择。这些JDP复合物可靶向急性或慢性应激诱导形成的蛋白聚集体，并可能通过招募多个Hsp70至蛋白聚集体表面，协助去聚集酶的组装。然而，这些物理相互作用的JDP所形成的蛋白质质量控制（PQC）网络在体内的范围仍 largely未被表征。本文中，我们描述了一种基于显微镜的原位蛋白质相互作用检测方法，称为邻近连接检测法（proximity ligation assay, PLA），该方法能够稳健地捕获在真核细胞不同亚细胞区域中瞬时形成的伴侣蛋白复合物。&#160;我们的研究将PLA的应用范围从人类细胞拓展至酵母（Saccharomyces cerevisiae）和细菌（Escherichia coli），从而提供了一种重要的工具，用于监测原核和真核细胞中瞬时形成的蛋白质组装体的动态变化。

我们先前利用纯化蛋白进行的体外研究表明，一部分人类A类和B类JDP能够形成瞬时的混合型JDP复合物，从而高效靶向多种聚集蛋白，并可能促进基于Hsp70的蛋白去聚集酶的组装7。我们采用邻近连接实验（PLA）检测混合型（A+B）JDP复合物是否存在于人宫颈癌细胞（HeLa）中。针对人类JDP蛋白DNAJA2（A类）和DNAJB1（B类），使用了高度特异性的初级抗体及相应的PLA次级探针（图2A-C）。红色荧光点的出现表明，在HeLa细胞中存在DNAJA2与DNAJB1组成的混合型复合物（图2C），该结果验证了我们此前的生化研究发现7。每个荧光点代表HeLa细胞胞质/细胞核中发生的一次独立蛋白质相互作用事件。
先前通过荧光共振能量转移（FRET）获得的生化结果表明，由于FRET可通过检测连接于一种蛋白质的激发态供体荧光团向连接于第二种蛋白质的...

同源J结构域蛋白与Hsp70分子伴侣协同作用，参与从蛋白质折叠到降解等多种生物学过程。本文介绍了一种原位邻近连接实验方法，可用于在细菌、酵母和人类细胞中监测这些短暂形成的分子伴侣复合物。

J-结构域蛋白（JDPs）是真核细胞中最大且最具多样性的共伴侣蛋白家族。最新研究发现，该家族中的特定成员……

该方法可用于捕获细菌、酵母及不同细胞类型中瞬时的蛋白质相互作用。本文中，我们监测了参与细胞蛋白质稳态的瞬时形成的特异性分子伴侣复合物。该技术的主要优势在于能够获取原核细胞和真核细胞中蛋白质复合物的动力学行为及其亚细胞定位信息。在细菌和酵母等单细胞生物中对该技术进行的改进，使研究人员能够将其作为一种强大工具用于研究与微生物感染相关的疾病。通过简单改变实验方案中样品制备阶段的条件，该技术有望被用于分析几乎所有生物体中的蛋白质相互作用。选择高质量、具有特异性且已在免疫组织化学、免疫荧光、ELISA 或免疫沉淀中验证过的抗体至关重要。首先用多聚-L-赖氨酸预处理10孔诊断载玻片。向每个孔中加入100微升无菌过滤的0.0001%多聚-L-赖氨酸溶液，在无菌超净工作台中孵育30分钟。随后，用50微升无菌水洗涤每个孔，以去除多余的多聚-L-赖氨酸。根据细胞类型，每孔加入约 15,000 个细胞，并将细胞置于 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的无菌湿化培养箱中培养至 60% 至 80% 汇合度。24 小时后，通过在每孔边缘放置一张纸巾去除培养基，并用 50 µL PBS 洗涤细胞三次。然后向每孔加入 50 µL 新鲜配制的含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，固定细胞，并将玻片在室温下孵育 10 分钟。固定后，将玻片浸入盛有 PBS 的玻片染色缸中，清洗三次。为了通透已贴附细胞的膜结构，将玻片浸入含有 0.5% Triton-X100 的 100 毫升 PBS 溶液中，在室温下孵育 10 分钟。然后用 TBS-T 再清洗玻片三次。最后一次洗涤后，用纸巾吸去多余的缓冲液。根据文稿说明培养并稀释酿酒酵母（S.cerevisiae）细胞，然后将其转移至50毫升离心管中，在665 ×g下离心3分钟以收集菌体。弃去上清液，并将细胞重悬于5毫升新鲜培养基中。然后加入550微升37%甲醛，使终浓度为4%，将培养物在室温下孵育15分钟以固定细胞。孵育结束后，离心收集细胞，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1毫升新配制的含4%多聚甲醛的洗涤缓冲液中。将细胞在室温下孵育45分钟。同时，通过向每个孔中加入100微升0.0001%的多聚-L-赖氨酸溶液，并在室温下孵育30分钟，来制备诊断用载玻片。然后用超纯水洗去多余的多聚-L-赖氨酸，并让载玻片自然晾干。孵育步骤结束后，用一毫升洗涤缓冲液通过离心洗涤细胞两次。吸去上清液，将细胞重悬于洗涤缓冲液中。最后一次洗涤后离心收集细胞，吸去上清液，再将细胞重悬于1毫升含1.2摩尔山梨醇的洗涤缓冲液中。为消化细胞壁，再次离心收集细胞，并将细胞重悬于250微升新鲜配制的溶壁酶溶液中。将细胞在30摄氏度下轻轻振荡孵育15分钟。消化步骤完成后，用洗涤缓冲液洗涤细胞三次，并将细胞重悬于含有1.2摩尔山梨醇的250微升洗涤缓冲液中。向每个经多聚-L-赖氨酸包被的孔中加入20微

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

细菌、酵母和人类细胞中瞬态形成的分子茶龙组件的原位监测

本方案描述了一种用于测量热激后细胞内蛋白质重折叠的方法。该方法可用于研究分子伴侣及其辅助因子，或能够影响其活性的化合物等折叠酶类。通过检测萤火虫荧光素酶的活性作为报告信号，以衡量分子伴侣的重折叠活性。...

细胞内复性实验

来源： Dahl, J. 等 pH依赖性活性的检测 大肠杆菌 分子伴侣 HdeB 体外 和 在体 内. 视频实验杂志...

通过模型蛋白的热变性评估细菌分子伴侣活性

细胞存活能力依赖于对蛋白质错误折叠的及时且高效管理。本文介绍一种用于观察错误折叠蛋白质不同命运的方法：重折叠、降解或在包涵体中被隔离。我们展示了利用折叠传感器Ubc9ts，结合4D显微镜技术，在活细胞中监测蛋白质稳态及聚集质量控制的过程。...

活细胞中蛋白质聚集的4D成像

本文描述了利用萤火虫荧光素酶-GFP融合蛋白进行研究的方法 体内 蛋白质折叠在...

监测蛋白质复性过程的偶联检测方法 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

本文介绍了脉冲-追踪放射性标记与位点特异性光交联技术相结合的方法，用于监测目标蛋白与大肠杆菌（E.

利用位点特异性交联监测分泌型细菌毒力因子的组装

本研究描述了用于表征分子伴侣活性的生物物理、生物化学和分子技术 大肠杆菌...

pH依赖性活性的检测 大肠杆菌 分子伴侣 HdeB 体外 和 体内

我们介绍一种可保持细胞完整性和蛋白质稳态的耗竭-挽救实验方法。腺病毒转染技术能够在单细胞水平上，对依赖精细调控的肌动蛋白动态的生物学过程（如有丝分裂和肌细胞生成）中的蛋白质进行功能分析。...

腺病毒转染：通过耗竭-拯救实验研究分子伴侣在细胞形态动力学中作用的方法

生物体在其生命周期中面临的最具挑战性的应激条件之一是氧化剂的积累。在氧化应激过程中，细胞高度依赖分子伴侣。本文介绍了用于研究氧化还原调控的抗聚集活性的方法，以及利用氢氘交换质谱（HDX-MS）监测调控伴侣功能的结构变化的方法。...

利用氢氘交换质谱法定义Hsp33的氧化还原调控型分子伴侣活性并绘制其构象变化

动力学交联与cDNA分析是一种能够在活细胞中以高时间分辨率研究蛋白质-RNA相互作用动态过程的方法。本文详细描述了该实验方案，包括酵母细胞培养、紫外交联、细胞收集、蛋白质纯化以及下一代测序文库制备等步骤。...

使用&#967;CRAC技术在活体内以高时间分辨率监测蛋白质-RNA相互作用动态

为了研究分子伴侣与分子伴侣之间以及分子伴侣与底物之间的相互作用，我们在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

利用 Caenorhabditis elegans 筛选组织特异性分子伴侣相互作用

本方案介绍了一种利用与谷胱甘肽偶联的供体微珠和GST融合的TPR基序共伴侣蛋白，以及与Hsp90来源肽段偶联的受体微珠来检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术。我们已应用该技术筛选可破坏Hsp90-FKBP51或Hsp90-FKBP52相互作用的小分子化合物，并鉴定出高效且选择性的Hsp90-FKBP51相互作用抑制剂。...

使用均相珠基检测法研究分子伴侣-共伴侣相互作用

学习原位邻近连接测定法监测细菌、酵母和人类细胞中瞬态形成的分子伴侣复合物，揭示J结构域蛋白与Hsp70的相互作用动态及亚细胞定位，为研究蛋白质稳态和微生物感染相关疾病提供重要工具。

原位监测细菌、酵母和人类细胞中瞬时形成的分子伴侣复合物

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