细胞和组织中辅酶A的定量

该方法描述了来自培养细胞和动物组织的样品制备，在样品中提取和衍生辅酶A，然后高压液相色谱用于纯化和定量衍生辅酶A吸光或荧光检测。

酶A，称为CoA，是细胞代谢的重要辅助因子。定量测量揭示了动物模型中营养和荷尔蒙状态的变化。此方法以简单可靠的方法量化细胞CoA的总量，包括CoA衍生物和自由CoA。

脑铁积累的几种类型的神经退化与CoA生物合成途径基因的突变有关。这种方法可以应用于任何生物系统，因为所有生物体都需要CoA才能生存、生长和功能。首次研究者可能难以完成样品制备的第一步，其中重要的是保持样品绝对冷，然后迅速将它们转移到氢氧化钾。

在转移到氢氧化钾之前，限制批次中样品的数量，并在使用实验样品之前练习转移。许多研究人员在准备生物样品以进行后期生化分析时，并不熟悉固相提取。首先，同时孵育三联培养皿，两个用于生化分析，一个用于确定可行的细胞数。

例如，当培养接近后期亚氟密度时，人类 HepG2/C3A 细胞的密度为 6 到 8 倍 10 到 6 或 HEK 293T 细胞的密度约为 1.3 倍 10 至 7/100 毫米的培养皿，收获培养中的粘附细胞。然后，在同一文化菜中加入一毫升冰水。将细胞刮入盘中的冷水中，将细胞悬浮液转移到含有400微升的0.25-摩尔氢氧化钾和1.5毫升水的玻璃试管中，使pH值高于12。

通过高旋转 10 秒，大力混合悬架。然后用石蜡膜紧紧覆盖，在55摄氏度下孵育一小时，在水浴中不摇晃。然后，加入160微升的一摩尔三氧化氢溶液和10微升100毫摩尔mBBr。

通过高涡旋10秒混合。这使 pH 到大约 8，以支持带免费 CoA 的 mBBr 反应。用石蜡膜盖住管子，在室温下孵育样品两小时，使mBBr与CoA的硫醇发生反应。

两小时后，加入100微升醋酸，通过涡流混合10秒钟，停止反应。管子中形成降水。接下来，以2000次g离心15分钟。

要清除沉淀的细胞碎屑，请将上清液转移到玻璃试管中，用于固相提取柱清理。在开始分析之前，在玻璃试管中加入两毫升一毫升氢氧化钾，用于插入探针，用转子定子均质器进行组织破坏。将管子放在冰上直到使用。

快速称量冷冻组织片，并记录每个样品的湿重。将组织转移到玻璃管中，使组织均质30秒。避免组织完全解冻。

加入500微升0.25-摩尔氢氧化钾。漩涡在高10秒，并保持在冰上。这使高于 12 的样品的 pH 水解使 CoA 硫化剂产生总 CoA。

用石蜡膜盖住管子。培养细胞的制备和组织是这个过程中最关键的步骤。必须快速添加高氢氧化钾，以防止CoA降解。

在55摄氏度下在水浴中孵育样品两小时，不摇晃支持水解。然后，添加150微升的一摩尔三氧化氮和10微升100毫摩尔mBBr，使pH到约8，支持mBBr反应与免费的CoA。高涡高10秒。

用石蜡膜盖住管子，在黑暗中在室温下孵育样品两小时，以确保所有CoA都用mBBr衍生。之后，加入100微升醋酸，并在高涡10秒内停止反应。在2000次g下离心15分钟，将沉淀的细胞碎屑颗粒，然后将上清液转移到玻璃试管中，用于固相提取柱清理。

在室温下，用一毫升洗涤缓冲液平衡每一毫升一次性2-2-乙基乙基凝胶柱，以确保丙基功能组被质子化，并将作为阴安交换器发挥作用。然后，将样品上流水放在柱子上，然后收集水液。用一毫升的洗涤缓冲液清洗柱子两次，用一毫升水清洗一次，以清除任何未处理的物种。

接下来，放入单独的玻璃试管中，用一毫升洗脱缓冲液清洗柱子两次，以收集CoA-bimane。在氮气下干燥管中的CoA-bimane样品。密封，完全覆盖管子，并储存在零下20摄氏度。

准备好进行 HPLC 分析时，将样品重新在 300 微升水中重新暂停，然后通过高涡旋 10 秒进行大力混合。将重新沉淀的样品转移到离心管过滤器中，以5000次g离心10分钟，清除任何沉淀物。然后，将过滤过的样品转移到适合 HPLC 注射的玻璃瓶中。

在这项研究中，一个具有代表性的 HPLC 配置文件显示了 C18 HPLC 列上 CoA-bimane 标准的保留时间。增加的CoA-bimane标准被单独注入，在CoA-bimane色谱的峰下的区域被绘制为输入CoA-bimane的函数。标准曲线反映了CoA-bimane在波长为393纳米时吸收的幅度。

CoA-bimane的荧光也反映在393纳米的激发波长和470纳米的发射波长上。随后的 HPLC 分离和小鼠肝脏或人类培养的 C3A 细胞的典型检测配置文件在此以红色峰值表示，使用洗脱程序保留时间在 11 到 12 分钟之间。如果 mBBr 的反应不能产生可检测的结果，可能需要调整 Trizma-HCl 的量，以降低 pH 到大约 8。

有可能检测更多的细胞分子，其中包含硫化物或硫酯的内饰作为双曼衍生物。例如，可以使用 HPLC 方法检测谷胱甘肽。这项技术将允许其他研究人员研究与代谢失衡相关的CoA功能障碍的潜在作用，如2型糖尿病的动物模型。

研究人员在使用用于固相萃取的有机溶剂时，应使用个人防护设备。