通过流式细胞术测定造血干细胞和T细胞中的线粒体质量与膜电位

本方案是一种基于流式细胞术的简单检测方法，可用于测量活细胞中的线粒体膜电位和线粒体数量。在处理稀有细胞群体（如造血干细胞）时，常规的代谢检测方法往往难以奏效。本方法使研究人员能够在细胞数量较少的情况下进行线粒体膜电位分析，并鉴定出调控细胞（如造血干细胞）代谢的新调节因子。

此外，您可以将该技术与下游功能检测方法（如骨髓移植或集落形成实验）相结合，以评估细胞在培养后的功能状态。我们的技术可用于鉴定能够改善造血干细胞在骨髓移植过程中以及清髓性治疗后造血免疫重建功能的新型分子。如本方案所述，该方法也可用于评估免疫T细胞的代谢活性。

染色后，细胞应尽量避免光照。此外，为评估泵出作用的贡献，必须加入泵抑制剂维拉帕米。然而，使用者需注意，维拉帕米会严重干扰离子平衡，因此不能用于评估代谢调节剂对线粒体膜电位的影响。

该方法的可视化演示极为重要，因为在处理少量细胞时，有一些关键步骤必须牢记，而这些步骤在用户于PubMed阅读的常规论文中往往被遗漏。对于FAC分选，通过系谱标记阴性、Sca1阳性、cKit阳性来定义LKS细胞群。通过圈选CD150阳性、CD48阴性的细胞亚群，可鉴定出约占LKS细胞群5%至10%的造血干细胞，该亚群标记为HSCs。

造血干细胞分选后，在4摄氏度条件下以300 × g离心5分钟。轻轻移除大部分上清液，避免扰动沉淀物，并在细胞沉淀上方保留50至80微升液体。将细胞沉淀重悬于干细胞扩增培养基中，最终体积为200微升。

准备一个无菌的、经组织培养处理的96孔U型底培养板，并确定用于培养细胞的孔位。向这些孔中加入100微升预先配制好的2倍基础培养基。在标记为NR的孔中，加入2微升100倍浓度的烟酰胺核糖溶液。

向用于染色对照的孔中加入100微升2倍基础培养基。将100微升已制备的造血干细胞接种至含有2倍基础培养基的孔中。将100微升全骨髓细胞接种至标记为染色对照的孔中。

在所有周围孔中加入 200 微升灭菌水，以减少含细胞孔中的蒸发。将培养板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中静置培养 72 小时。每 24 小时取出培养板补充烟酰胺核糖，然后放回培养箱中。

在培养结束时，向每个检测孔中加入2 µL的100倍浓度TMRM溶液和2 µL的100倍浓度绿色荧光染料溶液。向TMRM染色对照孔中加入2 µL的100倍浓度TMRM溶液。向MitoTracker染色对照孔中加入2 µL的100倍浓度绿色荧光染料溶液。

用铝箔覆盖培养板的顶部，并将培养板放回37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育45分钟。从培养箱中取出培养板，于300 × g 离心5分钟。

倒置培养板以去除上清液，加入200 µL标准FACS缓冲液重悬细胞。用铝箔覆盖培养板。以300 ×g离心5分钟。

重复此洗涤步骤三次。将细胞重悬于 200 µL FACS 缓冲液中，并转移至 FACS 管。上机检测前，先将单色对照依次加载到流式细胞仪中，并对每一样本至少记录 5,000 个事件。

在软件中，按下采集按钮，然后在控制面板上点击记录，以获取并记录单色对照。按下补偿设置，然后点击计算补偿以完成补偿计算。补偿应用后，获取造血干细胞样本，并尽可能记录更多事件。

从流式细胞仪导出 FACS 文件，并在分析软件中打开该文件。在 FlowJo 中，使用前向散射光和侧向散射光设门以识别细胞群体。在后续设门中识别单细胞，然后绘制代表活细胞的 DAPI 阴性细胞比例。

在活细胞门控中，分别对TMRM和绿色荧光染料通道绘制轮廓图，以测量线粒体膜电位和线粒体质量。导出活细胞门控中这两个通道的平均荧光强度。然后，导出所有样本中TMRM低信号门控内细胞所占的比例。

烟酰胺核糖处理显示出TMRM低信号细胞群体的明显增加。同时显著提高了TMRM低信号门控中的细胞比例，并显著降低了TMRM荧光强度。在线粒体补充烟酰胺核糖后，线粒体质量未发生改变。

此外，干细胞标志物染色与线粒体染色在培养后联合进行。通过鉴定造血干细胞的设门策略，发现经烟酰胺核糖处理后，TMRM低信号细胞群显著增加，且设门后的HSCs中TMRM荧光强度显著降低。在两种条件下，绿色荧光线粒体染料的绿色信号保持不变。

用铝箔覆盖染色板非常重要，以尽量减少光照对染色样本的影响。该方法可与下游实验（如骨髓移植和集落形成实验）结合使用，以评估干细胞的功能。因此，该技术为鉴定造血干细胞新型代谢调节剂提供了一种简便的筛选方法。