Name: 流细胞测定方法测量造血干细胞和T细胞的线粒体质量及膜电位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学习使用流式细胞术测量造血干细胞和T细胞的线粒体质量及膜电位的方法。该技术适用于稀有细胞群体分析，可结合功能实验评估细胞代谢状态，为骨髓移植研究提供关键支持。

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我们感谢洛桑大学流式细胞术核心设施的支持，特别是感谢Romain Bedel博士。本工作获得了Kristian Gerhard Jebsen基金会向N.V.和O.N.提供的资助。

本文所述所有实验均遵循本机构的指导原则，并依照瑞士动物实验法规（许可编号：VD3194）以及涉及人类样本研究的法规（方案编号：235/14；CER-VD 2017-00490）进行。
1. 造血干细胞提取
<ol>
	<li>购买野生型 C57BL6/J 小鼠，并将其在动物房中饲养至少一周，以减少运输带来的应激反应。</li>
	<li>实验当天，使用 CO2 窒息法处死小鼠。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒小鼠体表以消毒毛发，使用标准手术器械（如解剖剪和镊子）从腹部切开，分离后肢的股骨和胫骨。</li>
	<li>用软纸巾去除附着在股骨、胫骨和骨盆上的肌肉组织，将清理干净的骨骼放入含有 PBS 加 1 mM EDTA（缓冲液）的 50 mL 离心管中，并置于冰上。</li>
	<li>用 70% 乙醇喷洒研钵和研杵，将其放入细胞培养超净台中，用紫外灯灭菌 30 分钟。灭菌后，用缓冲液冲洗研钵和研杵，以去除残留的乙醇。</li>
	<li>将清洁的骨骼连同部分缓冲液（约 10 mL）放入研钵中，轻轻研磨以释放骨髓细胞至悬浮液中。随后收集细胞悬液，通过 70 µm 细胞滤网过滤至 50 mL 离心管中，获得单细胞悬液。</li>
	<li>重复步骤 1.6，直至所有骨髓被完全提取，且骨碎片变为白色。</li>
	<li>将含有骨髓单细胞悬液的 50 mL 离心管置于离心机中，在 4 °C 条件下以 300 xg 离心 10 分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>同时，在灭菌蒸馏水中配制 10 mL 的 1x 红细胞裂解缓冲液，并通过 0.22 µm 滤器过滤。</li>
	<li>从离心机中取出样品管，弃去上清液。向细胞沉淀中加入 1x 红细胞裂解缓冲液（材料表），用移液器反复吹打数次以充分悬浮细胞，形成均一溶液。室温静置 1–2 分钟以完成红细胞裂解。随后用缓冲液加满离心管以终止裂解反应。</li>
	<li>将离心管置于离心机中，在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟。取出离心管并弃去上清液。加入 10 mL 缓冲液重悬细胞沉淀，并通过 70 µm 细胞滤网过滤至新的 50 mL 离心管中，以去除红细胞裂解产生的碎片。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟。取出离心管并弃去上清液，用 500 µL 缓冲液重悬细胞沉淀。</li>
	<li>取出 100 µL 分装样本，保存于另一支 1.5 mL 离心管中。向剩余的 450 µL 细胞悬液中加入 50 µL 来自前体细胞富集试剂盒的生物素标记谱系耗竭抗体混合物（材料表），在 4 °C 条件下于摇床上孵育 15 分钟。</li>
	<li>加入 15 mL 缓冲液，在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟。取出离心管并弃去上清液，用 460 µL 缓冲液重悬细胞沉淀。取出 10 µL 分装样本，保存于另一支 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>向剩余的 450 µL 细胞悬液中加入 50 µL 来自前体细胞富集试剂盒的链霉亲和素磁珠（材料表），在 4 °C 条件下于摇床上孵育 15 分钟。</li>
	<li>加入 15 mL 缓冲液，在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟。取出离心管并弃去上清液，用 5 mL 缓冲液重悬细胞沉淀，并将溶液转移至 15 mL 离心管中。</li>
	<li>将离心管送至自动细胞分选仪（材料表）。运行清洗程序以冲洗并预润分选仪管路。将样品管和两个收集管放置于管架上，使用&#34;耗竭&#34;程序进行分选。运行结束后，收集自动细胞分选仪输出的阳性组分和阴性组分。 
	注意： 若无自动细胞分选仪，用户可依据说明书使用手动磁性柱及相应磁铁。需注意手动分选过程较自动方式更慢，且磁性柱更易堵塞。因此建议用户稀释样品，并缓慢加样至柱中。</li>
	<li>弃去阳性组分。向阴性组分管中加满缓冲液，在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟。</li>
	<li>同时，按照材料表和表 1所述，配制终体积为 1 mL 的抗体混合液，以及终体积为 200 µL 的单色对照样本。 
	注意： 若需将 TMRM 与绿色荧光线粒体染料联合用于干细胞标志物染色，则应将 CD150-PE 替换为 CD150-PEcy5，将 Streptavidin-Tx red 替换为 Streptavidin-Pac Orange。</li>
	<li>从离心机中取出样品管，弃去上清液，用 1 mL 抗体混合液重悬细胞沉淀。取 10 µL 细胞（来自步骤 1.13）加入各单色对照管中（谱系对照除外）。取 10 µL 细胞（来自步骤 1.14）加入谱系单色对照管中。</li>
	<li>将样品管和单色对照管在 4 °C 条件下于摇床上孵育 45 分钟。用盖子或铝箔覆盖冰桶，避光保存。</li>
	<li>向所有离心管中加满缓冲液，在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，将样品用 1 mL 缓冲液重悬，单色对照用 200 µL 缓冲液重悬。</li>
	<li>将样品和单色对照转移至带有滤网帽的 5 mL FACS 管中。</li>
	<li>将 FACS 管送至分选仪器，根据图 1A中的设门策略分选造血干细胞（HSC）群体，并收集至含有 400 µL 干细胞扩增培养基的 1.5 mL 离心管中。</li>
</ol>
2. 造血干细胞的离体培养
<ol>
	<li>收集含有分选细胞的离心管（参见第1节中的细胞提取步骤）。在4 °C条件下，以300 × g 离心5分钟。轻柔地去除大部分上清液，避免扰动细胞沉淀，保留50–80 µL上清液覆盖在细胞沉淀上。此操作可最大限度减少细胞损失。</li>
	<li>用干细胞扩增培养基重悬细胞沉淀，最终体积根据待测条件的数量而定（按每孔/每种培养条件100 µL计）。</li>
	<li>配制2倍浓度的培养基，包含干细胞扩增培养基、干细胞因子（200 ng/mL）、FLT3配体（4 ng/mL）以及青霉素-链霉素抗生素（1%）（2倍基础培养基；材料表）。</li>
	<li>取一个无菌的经组织培养处理的96孔U型底培养板（材料表），确定用于培养细胞的孔位（培养板设计见图1B）。 
	注意：建议避免使用边缘孔，因其更易发生蒸发。</li>
	<li>在上述各孔中加入100 µL步骤2.3中预先配制的2倍基础培养基。在标记为NR的孔中加入2 µL 100倍浓度的NR溶液（材料表）。每24小时补充一次NR。 
	注意：补充操作仅针对NR。其他代谢调节剂可能需要或不需要补充。</li>
	<li>将步骤2.2中制备的100 µL细胞悬液接种至含有2倍基础培养基的各孔中。本实验中，每孔接种的造血干细胞（HSC）数量为800–1,000个细胞。</li>
	<li>额外准备五个含有2倍基础培养基的孔。在每个孔中加入100,000个完整的骨髓细胞（来自步骤1.13），用100 µL干细胞扩增培养基重悬，作为培养后流式细胞术分析的染色对照。 
	注意：若用户希望在培养后分析中联合使用干细胞标记物和线粒体标记物，建议额外分选前体细胞群（如Ckit+细胞或LKSCD150-细胞）。将这些分选后的前体细胞接种至染色对照孔中，用于培养后流式细胞术分析。每种单一染色颜色准备一个孔。</li>
	<li>在所有周围孔中加入200 µL经高压灭菌的水，以减少含细胞孔的蒸发。将培养板静置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养指定时间（72小时）。每24小时取出培养板补充NR，之后放回培养箱继续培养。</li>
</ol>
3. 线粒体数量与膜电位的测定
<ol>
	<li>培养期结束时，在干细胞扩增培养基中配制100倍浓度的TMRM（20 µM）和Mitotracker green（10 µM）（绿色荧光染料）溶液（材料表）。</li>
	<li>在每个检测孔中加入2 µL的100倍TMRM溶液和2 µL的100倍绿色荧光染料溶液。在TMRM对照孔中加入2 µL的100倍TMRM溶液。在Mitotracker对照孔中加入2 µL的100倍绿色荧光染料溶液。将培养板放回37 °C、5% CO2的培养箱中孵育45分钟，并用铝箔覆盖板的顶部。 
	注意：若需检测ABC泵介导的染料外排，可额外设置一个维拉帕米（ABC泵抑制剂）对照。为此，在染色前1小时，向其中一个检测孔中加入50 µM维拉帕米。</li>
	<li>从培养箱中取出培养板，以300 × g离心5分钟。将板倒置以去除上清液。每孔加入200 µL标准FACS缓冲液（PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS），再次以300 × g离心5分钟，去除上清液。重复此洗涤步骤3次。操作过程中必须始终用铝箔覆盖培养板，以尽量减少直接光照。 
	注意：若需将线粒体染色与干细胞表面标志物染色结合，样本需在4 °C下与包含所有干细胞标志物的抗体混合物共同孵育30–45分钟，且单色对照需分别单独与各抗体染色。 
	注意：所有操作步骤中均需用铝箔覆盖培养板。请注意，额外的染色步骤及后续洗涤可能导致细胞损失增加。</li>
	<li>将细胞重悬于200 µL FACS缓冲液中，并转移至FACS流式管中。</li>
	<li>在流式细胞仪上检测样本（参见图1）。含WBM的单色对照管包括：（1）未染色对照；（2）DAPI；（3）TMRM（PE）；（4）绿色荧光染料（FITC）；（5）全染（PE和FITC）。</li>
	<li>首先采集单色对照数据以进行仪器设置。使用仪器运行软件计算补偿值。完成补偿设置后，采集HSC样本数据，并尽可能记录更多事件。 
	注意：若同时检测干细胞和线粒体标志物，需特别注意TMRM（PE）、CD150（PE-Cy5）和Sca-1（APC）之间的补偿调节。此外，样本应在染色后立即上机检测。</li>
	<li>从流式细胞仪导出FACS数据文件，并使用分析软件进行数据分析（材料表）。
	<ol>
		<li>进行数据分析时，在分析软件中打开数据文件。通过FSC-A和SSC-A设门确定细胞群体。在后续设门中识别单细胞群体，然后绘制DAPI阴性细胞群（活细胞）。在活细胞门内，分别在TMRM和绿色荧光染料通道中绘制等高线图，以测量线粒体膜电位（ΔΨm）和线粒体质量（图2A）。导出活细胞门中这两个通道的平均荧光强度（MFI）。</li>
		<li>TMRM低表达门的设定依据TMRM通道中肩部细胞群的位置。可利用TMRM单色对照识别该肩部细胞群以确定设门位置。导出对照组和实验组样本中TMRM低表达门内活细胞的比例，用于后续作图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li>
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<li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li>
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<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+oxidative+stress+by+ATM+is+required+for+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li>
<li>Tothova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxOs+are+critical+mediators+of+hematopoietic+stem+cell+resistance+to+physiologic+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress.</a> Cell. 128 (2), 325-339 (2007).</li>
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<li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405(2019).</li>
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<li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li>
<li>Aranda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trial+Watch%3A+Adoptive+cell+transfer+for+anticancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy.</a> Oncoimmunology. 3, 28344(2014).</li>
<li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell exhaustion.</a> Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).</li>
<li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li>
<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li>
<li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li>
<li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li>
<li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li>
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<li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8%2B+T+cell+memory+and+antitumor+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li>
</ol>

本工作的部分内容已作为申请号P1828EP00提交至欧洲专利局。

对造血干细胞（HSC）功能的严格调控对于维持机体一生中稳定的造血功能至关重要。与体内多种其他细胞类型类似，细胞代谢是调控HSC功能的关键因素之一。我们实验室此前的研究9以及其他研究团队的工作2,3均表明，线粒体在维持HSC特有代谢状态中具有重要作用。由于从小鼠骨髓中分离得到的HSC数量极低，难以通过常规代谢检测方法（例如SeaHorse氧耗检测）对其进行分析。基于我们先前的研究，我们建立了一种简便的流式细胞术检测方法，可在少量细胞（即HSC）中可靠地测定线粒体质量及膜电位（作为线粒体活性的间接读数）。该检测可在活细胞上进行，且不损害细胞活力9，从而确保细胞可用于后续任何功能实验（如集落形成单位实验或骨髓移植实验），供使用者进一步分析。我们预计该检测方法可用于筛选实验，快速评估来自不同遗传背景或基因敲除模型的HSC的线粒体特征。重要的是，本检测方法可与CFSE染色联合使用，同时读取HSC增殖情况及其线粒体特征<sup class...

造血干细胞（HSCs）是一类存在于骨髓中的稀有细胞群体，负责在整个生物体生命周期中维持血液的生成与稳态。HSCs 通过产生祖细胞来介导这一过程，祖细胞再经过多轮细胞分裂和精确调控的分化步骤，最终生成终末分化的成熟血细胞谱系1。重要的是，HSCs 主要通过无氧糖酵解产生能量；相比之下，分化方向更明确且活跃的造血祖细胞则将其代谢方式转向线粒体代谢2,3,4。这种独特的代谢状态被认为可保护 HSCs 免受活性线粒体产生的活性氧（ROS）所造成的细胞损伤，从而维持其长期的体内功能5,6,7,8。由于 HSCs 数量有限，直接检测其代谢状态具有挑战性，且通量通常较低。本文中，我们描述了一种基于流式细胞术的检测方法，利用四甲基罗丹明甲酯（TMRM）荧光检测 HSCs 的线粒体膜电位（ΔΨm），并利用绿色荧光线粒体染料（Mitotracker Green）检测线粒体质量。我们先前已证实，低 ΔΨm 是高度纯化的 HSCs 的可靠功能标志物9，而能够降低 ΔΨm 的代谢调节剂可增强 HSCs 的功能9,10。本文提出将该方法应用于 HSCs 的线粒体特征分析，作为一种策略，用于发现能够提升 HSCs 长期血液重建潜能的新型分子。
例如，我们证明该检测方法可可靠地测量造血干细胞在线粒体膜电势（ΔΨm）暴露于维生素B3类似物烟酰胺核糖（NR）后发生的降低。因此，在我们近期发表的研究中，我们证明NR通过直接改善造血干细胞和祖细胞功能，在小鼠和人源化小鼠体系中均显著促进移植后的血液系统恢复10。考虑到移植后患者因血液和免疫系统恢复延迟导致的死亡率高达25%，这类代谢调节剂具有重要的临床价值11,12。
此外，我们提供了证据表明，该方法可用于表征人类T细胞的代谢谱和功能。近年来，利用自体肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的过继性细胞治疗（ACT）已成为治疗某些预后极差的晚期癌症最有效的方法（例如转移性黑色素瘤，其中&#62;50%的患者对治疗有反应，高达24%的患者出现完全缓解）13。然而，生成具有足够抗肿瘤活性的TILs仍存在困难14。TILs在体外扩增过程中经历广泛的增殖和刺激，导致T细胞耗竭和衰老，从而严重损害其抗肿瘤反应能力15。重要的是，TILs的抗肿瘤能力与其代谢状态密切相关16,17，而通过抑制PI3K/Akt通路来调节代谢的策略已取得令人鼓舞的结果18,19。基于此，我们比较了来自外周血单个核细胞（PBMCs）的T细胞与患者来源TILs的线粒体膜电位（ΔΨm），并发现相较于终末分化的TILs，分化程度较低的PBMC来源T细胞具有更低的ΔΨm和线粒体质量。
我们设想该检测方法可用于鉴定通过调节ΔΨm来改善造血干细胞和T细胞功能的新型代谢调节剂。

<table><tbody><tr><td>5 mL FACS 管</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>样品制备</td></tr><tr><td>96 孔 U 型底板</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>AutoMACS pro 分离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>自动细胞分离</td></tr><tr><td>BD FACS AriaIII</td><td>Becton and Dickinson</td><td></td><td>细胞分选</td></tr><tr><td>BD IMag 小鼠造血祖细胞富集试剂盒</td><td>BD</td><td>558451</td><td>谱系耗竭</td></tr><tr><td>BD LSRII</td><td>Becton and Dickinson</td><td></td><td>FACS 数据采集仪器</td></tr><tr><td>BD-DIVA</td><td>Becton and Dickinson</td><td></td><td>数据采集软件</td></tr><tr><td>CD150 PE</td><td>Biolegend</td><td>115904</td><td>抗体染色混合液</td></tr><tr><td>CD150 PE-Cy5</td><td>Biolegend</td><td>115912</td><td>抗体染色混合液</td></tr><tr><td>CD48 PB</td><td>Biolegend</td><td>103418</td><td>抗体染色混合液</td></tr><tr><td>离心机-5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>离心</td></tr><tr><td>Ckit PeCy7</td><td>Biolegend</td><td>105814</td><td>抗体染色混合液</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>FACS 分析软件</td></tr><tr><td>GraphPad-Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>数据绘图</td></tr><tr><td>MitoTracker Green</td><td>Invitrogen</td><td>M7514</td><td>绿色荧光线粒体染料，用于检测线粒体质量；工作浓度 = 100 nM；储存浓度 = 1 mM</td></tr><tr><td>烟酰胺核糖（NR）</td><td>实验室自行定制合成</td><td></td><td>代谢调节剂；工作浓度 = 500 &amp;micro;M；储存浓度 = 50 mM</td></tr><tr><td>PBS</td><td>CHUV</td><td>1000324</td><td>缓冲液配制；工作浓度 = 1x；储存浓度 = 1x</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（P/S）</td><td>Life technologies</td><td>15140122</td><td>体外培养；工作浓度 = 1x；储存浓度 = 1x</td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td>裂解红细胞；工作浓度 = 1x；储存浓度 = 10x</td></tr><tr><td>重组小鼠 Flt-3 配体（FLT3）</td><td>RnD</td><td>427-FL-005/CF</td><td>体外培养；工作浓度 = 2 ng/mL；储存浓度 = 10 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>重组小鼠干细胞因子（SCF）</td><td>RnD</td><td>455-MC-010/CF</td><td>体外培养；工作浓度 = 100 ng/mL；储存浓度 = 50 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Sca1 APC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17-5981-82</td><td>抗体染色混合液</td></tr><tr><td>StemlineII 造血干细胞扩增培养基</td><td>SIGMA</td><td>S0192</td><td>体外培养</td></tr><tr><td>链霉亲和素 Pac orange</td><td>Life Technologies</td><td>S32365</td><td>抗体染色混合液</td></tr><tr><td>链霉亲和素 Tx red</td><td>Life Technologies</td><td>S872</td><td>抗体染色混合液</td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T668</td><td>线粒体膜电位染色；工作浓度 = 200 nM；储存浓度 = 10 mM</td></tr><tr><td>超纯 EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>缓冲液配制；工作浓度 = 0.5 M；储存浓度 = 1 mM</td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术测定造血干细胞和t细胞中的线粒体质量与膜电位

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

静息、自我更新与分化之间的精细平衡对于维持造血干细胞（HSC）库以及终生生成所有成熟血细胞至关重要。近年来，细胞代谢被发现是调控HSC功能与命运的关键因素。我们先前已证明，线粒体代谢的调节可影响HSC的命运。具体而言，通过化学解偶联电子传递链，我们能够在通常会迅速诱导分化的培养条件下维持HSC的功能。然而，HSC数量有限，常常限制了标准检测方法在测量HSC代谢以预测其功能方面的应用。本文中，我们报道了一种简单的流式细胞术检测方法，可在HSC等稀有细胞中可靠地测量线粒体膜电位和线粒体质量。我们讨论了从小鼠骨髓中分离HSC，以及在体外培养后对线粒体质量与膜电位的测定。作为示例，我们展示了通过代谢调节剂处理对HSC中这些参数的调控。此外，我们将该方法拓展应用于人外周血来源的T细胞及人肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），发现其线粒体特征存在显著差异，可能反映了不同T细胞的功能状态。我们认为，该检测方法可用于在不同背景下筛选多种细胞类型中线粒体代谢的调节因子。

在 图1 我们展示了从小鼠骨髓中分离造血干细胞的设门策略及其体外培养的孔板布局。 图1A 在SSC-A/FSC-A图中显示了淋巴细胞组分的鉴定。通过单细胞门控去除双联体后，根据无DAPI信号鉴定活细胞。LKS群体由lineage- Sca1定义+cKit+，被鉴定出来。该细胞群体已知含有干细胞和祖细胞。HSC约占LKS细胞群体的5–10%，通过CD150分选而鉴定+CD48- 群体 图1B 代表96孔板用于体外培养的布局。分选后的HSC被接种于不同的培养条件下：本例中为对照组和NR补充培养组。根据方案所述，全骨髓细胞也被接种作为单色对照。为防止含细胞孔中培养基蒸发，所有周围孔中均需加水。此外，如前所述，由于边缘孔更易发生蒸发，因此避免用于细胞培养。
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本文介绍了一种在体外培养的造血干细胞和T细胞中可靠测定线粒体质量与膜电位的方法。

通过流式细胞术测定造血干细胞和T细胞中的线粒体质量与膜电位

静息、自我更新与分化之间的精细平衡对于维持造血干细胞（HSC）库及终身血液细胞生成至关重要……

本方案是一种基于流式细胞术的简单检测方法，可用于测量活细胞中的线粒体膜电位和线粒体数量。在处理稀有细胞群体（如造血干细胞）时，常规的代谢检测方法往往难以奏效。本方法使研究人员能够在细胞数量较少的情况下进行线粒体膜电位分析，并鉴定出调控细胞（如造血干细胞）代谢的新调节因子。此外，您可以将该技术与下游功能检测方法（如骨髓移植或集落形成实验）相结合，以评估细胞在培养后的功能状态。我们的技术可用于鉴定能够改善造血干细胞在骨髓移植过程中以及清髓性治疗后造血免疫重建功能的新型分子。如本方案所述，该方法也可用于评估免疫T细胞的代谢活性。染色后，细胞应尽量避免光照。此外，为评估泵出作用的贡献，必须加入泵抑制剂维拉帕米。然而，使用者需注意，维拉帕米会严重干扰离子平衡，因此不能用于评估代谢调节剂对线粒体膜电位的影响。该方法的可视化演示极为重要，因为在处理少量细胞时，有一些关键步骤必须牢记，而这些步骤在用户于PubMed阅读的常规论文中往往被遗漏。对于FAC分选，通过系谱标记阴性、Sca1阳性、cKit阳性来定义LKS细胞群。通过圈选CD150阳性、CD48阴性的细胞亚群，可鉴定出约占LKS细胞群5%至10%的造血干细胞，该亚群标记为HSCs。造血干细胞分选后，在4摄氏度条件下以300 × g离心5分钟。轻轻移除大部分上清液，避免扰动沉淀物，并在细胞沉淀上方保留50至80微升液体。将细胞沉淀重悬于干细胞扩增培养基中，最终体积为200微升。准备一个无菌的、经组织培养处理的96孔U型底培养板，并确定用于培养细胞的孔位。向这些孔中加入100微升预先配制好的2倍基础培养基。在标记为NR的孔中，加入2微升100倍浓度的烟酰胺核糖溶液。向用于染色对照的孔中加入100微升2倍基础培养基。将100微升已制备的造血干细胞接种至含有2倍基础培养基的孔中。将100微升全骨髓细胞接种至标记为染色对照的孔中。在所有周围孔中加入 200 微升灭菌水，以减少含细胞孔中的蒸发。将培养板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中静置培养 72 小时。每 24 小时取出培养板补充烟酰胺核糖，然后放回培养箱中。在培养结束时，向每个检测孔中加入2 µL的100倍浓度TMRM溶液和2 µL的100倍浓度绿色荧光染料溶液。向TMRM染色对照孔中加入2 µL的100倍浓度TMRM溶液。向MitoTracker染色对照孔中加入2 µL的100倍浓度绿色荧光染料溶液。用铝箔覆盖培养板的顶部，并将培养板放回37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育45分钟。从培养箱中取出培养板，于300 × g 离心5分钟。倒置培养板以去除上清液，加入200 µL标准FACS缓冲液重悬细胞。用铝箔覆盖培养板。以300 ×g离心5分钟。重复此洗涤步骤三次。将细胞重悬于 200 µL FACS 缓冲液中，并转移至 FACS 管。上机检测前，先将单色对照依次加载到流式细胞仪中，并对每一样本至少记录 5,000 个事件。在软件中，按下采集按钮，然后在控制面板上点击记录，以获取并记录单色对照。按下补偿设置，然后点击计算补偿以完成补偿计算。补偿应用后，获取造血干细胞样本，并尽可能记录更多事件。从流式细胞仪导出 FACS 文件，并在分析软件中打开该文件。在 FlowJo 中，使用前向散射光和侧向散射光设门以识别细胞群体。在后续设门中识别单细胞，然后绘制代表活细胞的 DAPI 阴性细胞比例。在活细胞门控中，分别对TMRM和绿色荧光染料通道绘制轮廓图，以测量线粒体膜电位和线粒体质量。导出活细胞门控中这两个通道的平均荧光强度。然后，导出所有样本中TMRM低信号门控内细胞所占的比例。烟酰胺核糖处理显示出TMRM低信号细胞群体的明显增加。同时显著提高了TMRM低信号门控中的细胞比例，并显著降低了TMRM荧光强度。在线粒体补充烟酰胺核糖后，线粒体质量未发生改变。此外，干细胞标志物染色与线粒体染色在培养后联合进行。通过鉴定造血干细胞的设门策略，发现经烟酰胺核糖处理后，TMRM低信号细胞群显著增加，且设门后的HSCs中TMRM荧光强度显著降低。在两种条件下，绿色荧光线粒体染料的绿色信号保持不变。用铝箔覆盖染色板非常重要，以尽量减少光照对染色样本的影响。该方法可与下游实验（如骨髓移植和集落形成实验）结合使用，以评估干细胞的功能。因此，该技术为鉴定造血干细胞新型代谢调节剂提供了一种简便的筛选方法。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

流细胞测定方法测量造血干细胞和T细胞的线粒体质量及膜电位

本视频展示了使用抗体对神经元细胞的线粒体呼吸链复合物、线粒体DNA相关蛋白以及线粒体外膜蛋白进行标记，随后通过流式细胞术定量其表达水平。...

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本文介绍了一种通过免疫标记从啮齿类动物组织中分离的线粒体，并结合流式细胞术分析来检测和定量线粒体外膜蛋白的方法。该方法可进一步扩展用于评估线粒体亚群的功能特性。...

通过分离线粒体的流式细胞术对外膜蛋白进行免疫检测

本文介绍了一种利用JC-1染料检测细胞在缺氧/复氧处理（无论是否添加保护剂）后线粒体膜电位的实验方案。...

一种基于流式细胞术的检测方法，用于测量缺氧/复氧后心肌细胞线粒体膜电位

本文介绍了一种用于定量活细胞中线粒体或溶酶体的强大方法。通过将特异性针对溶酶体或线粒体的荧光染料与荧光标记的表面标志物抗体相结合，利用多色流式细胞术，可在混合细胞群体（例如从组织样本中分离的原代细胞）中实现对这些细胞器的定量分析。...

基于多色流式细胞术的T细胞线粒体与溶酶体定量分析

我们描述了一种利用多参数流式细胞术检测小鼠健康造血干细胞和祖细胞（HSPCs）以及由MLL-AF9驱动的急性髓系白血病（AML）小鼠模型中白血病细胞线粒体活性氧（ROS）的方法。...

小鼠造血干细胞与祖细胞及MLL-AF9驱动型白血病中线粒体活性氧的流式细胞术分析

异源物质外排泵在造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中具有高度活性，会导致线粒体膜电位荧光染料TMRM被排出。本文介绍了一种在维拉帕米（一种外排泵抑制剂）存在的情况下，使用TMRM准确测定HSPCs中线粒体膜电位的实验方案。...

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细胞因子分化的原代人T细胞中线粒体呼吸的实时监测

本研究报道了一种基于流式细胞术和两种荧光报告分子或抗体双重染色的新型方法，用于测量多种线粒体功能参数，以检测线粒体体积、线粒体膜电位、活性氧水平、线粒体呼吸链组成以及线粒体DNA的变化。...

人类诱导多能干细胞及其神经和胶质分化衍生物中多种线粒体参数的流式细胞术分析

在生理相关底物浓度下研究免疫细胞线粒体生物能量学的方法有限。本文提供了一种详细方案，利用高分辨率荧光测氧法，检测人T细胞、单核细胞和外周血单个核细胞中线粒体膜电位对能量需求变化的响应。...

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通过流式细胞术测定造血干细胞和T细胞中的线粒体质量与膜电位

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