Name: 微血管中场流的空间时间分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学习使用STAFF软件对微血管血流进行连续定量分析，通过生成彩色编码空间图实现可视化。该方法显著缩短测量时间，帮助研究人员高效获取全视野血流速度数据。

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本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH U01 GM111243 和 NIH NIDDK P30 DK079312）的资助。活体显微成像研究在印第安纳大学生物显微中心完成。&#173;我们感谢Malgorzata Kamocka博士在显微镜技术方面的协助。

所有动物实验均经印第安纳大学机构动物护理和使用委员会批准，并按照其指南进行，同时遵循美国国家研究委员会（NRC）关于动物护理和使用的指南。
1. 活体显微镜检查的手术准备
注意：本操作不属于存活手术。一旦开始第1节&#34;活体显微成像的手术准备”，则必须持续进行，直至完成第2节&#34;活体显微成像”为止，期间不得中断。
<ol>
	<li>将9至10周龄的雄性C57BL/6小鼠适应环境至少4天，并在实验前禁食16小时。</li>
	<li>称量动物体重，使用5%异氟烷进行镇静，并将其置于加热垫上以维持体温。氧气流速保持在1–2 L/min，维持麻醉时使用1–2%异氟烷。通过夹趾法检查反射反应。使用直肠温度计监测体温，并通过视觉观察监测心率和呼吸频率。</li>
	<li>当麻醉状态稳定后，剃除颈静脉插管部位的毛发，同时剃除肋缘下方区域以暴露肝脏。</li>
	<li>进行颈静脉插管时，在小鼠下颌下方1–2 cm处做一长约1 cm的左侧腹侧切口。清除颈静脉周围的所有脂肪和筋膜组织。使用06号缝合线结扎颈静脉前端，以防出血。
	<ol>
		<li>在颈静脉上做一个微小切口，将导管（30 G × ½ 英寸针头）、针持器和聚乙烯管（0.011 × 0.024 英寸2&#160;，连接至鲁尔短接头并充满0.9%生理盐水）插入约1 cm，然后使用0-6号缝合线在颈静脉后端固定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过颈静脉导管注射70 kDa荧光素葡聚糖（以9 mg/mL生理盐水溶液注射0.1 mL，剂量为30 mg/kg）。</li>
	<li>在肋骨中段下方1–2 cm处沿躯干横向做一4–6 cm切口，暴露肝脏用于成像。</li>
	<li>将一块湿润（浸泡于0.9%生理盐水中）的2 × 2 英寸2&#160;纱布垫置于左外侧肝叶下方。在40 mm盖玻片底培养皿的玻璃窗边缘贴上胶带，并在胶带上涂抹氰基丙烯酸酯粘合剂。将玻璃板轻压至肝脏表面，再用棉签将纱布压入胶带上的胶水中，以最大限度减少显微成像过程中的组织移动。</li>
	<li>将动物转移至显微镜载物台。向盖玻片底培养皿中加入无菌0.9%生理盐水，以保持肝脏在整个成像过程中的湿润状态。通过载物台内置加热垫、覆盖动物的加热垫以及物镜加热装置，将温度维持在36–37 °C。</li>
</ol>
2. 活体显微成像
<ol>
	<li>在配备能够高速图像采集的摄像机的倒置落射荧光显微镜上进行活体显微成像。 
	注意：本实验中使用了氙弧灯、荧光素特异性激发滤光片（480–500 nm）和发射滤光片（507–543 nm）、Plan Fluor 20x，数值孔径0.75的水浸物镜，以及高速sCMOS相机。</li>
	<li>使用最低限度的照明选择用于毛细血管血流分析的兴趣区域。</li>
	<li>设置足够短的曝光时间，使相机能够以100 fps的速度采集图像。调节照明强度，以清晰显示红细胞阴影和血管结构，同时避免荧光探针的光毒性和光漂白。</li>
	<li>以100 fps的速率采集图像。将相机像素分辨率设置在约0.65至约1.3 µm/像素之间。帧尺寸设置为512 x 512至1024 x 1024像素之间。位深度设置为8至16位之间。在系统仍能维持100 fps图像采集的前提下，使用尽可能高的分辨率、帧尺寸和位深度。</li>
	<li>将时间序列文件保存为一系列TIF文件，或保存为相机/显微镜的原生格式文件（如果FIJI中的Bio-Formats14能够打开该原生格式）。</li>
	<li>随时间对多个区域进行成像。将小鼠保留在显微镜载物台上最长可达2小时。成像结束后对小鼠实施安乐死。 
	注意：时间序列的持续时间应根据成像时间间隔的需求与组织活性之间的平衡来确定。时间序列的长度也可能受文件大小限制的影响；以100 fps采集的1分钟1024 x 1024像素、16位图像时间序列将生成约12 GB大小的文件。文件大小的考虑也可能决定所采用的帧尺寸和位深度。STAFF软件本身对文件大小无明确限制。</li>
</ol>
3. 使用 FIJI 中的 TrakEM2 定义血管网络
注意： 在第 3 节的任意步骤中保存工作后，均可暂停本方案。
<ol>
	<li>从 https://imagej.net/Fiji/Downloads 下载并安装 FIJI。 
	注意： 本项目使用了 Fiji 的 1.51n 版本，可从 https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip 下载。请注意，在 Windows 系统中，FIJI 应安装在用户空间，而非 Program Files 目录下。</li>
	<li>使用 FIJI 打开视频文件 文件 &#62; 开放 或使用 文件 &#62; 导入 &#62; 图像 序列在呼吸间期的稳定图像中选择一幅血管网络拓扑结构清晰可见的单幅图像。选择 图像 &#62; 重复 复制所选的单张图像（而非图像栈），并将图像保存至新文件夹中。文件名和文件夹名中不得包含空格。</li>
	<li>通过选择创建一个新的空白 TrakEM2 项目 文件 &#62; 新 &#62; TrakEM2 （空白）选择包含来自视频的单张图像的新文件夹作为项目文件夹。TrakEM2 窗口将打开。</li>
	<li>在主工作区中右键单击并选择 导入 &#62; 导入 图像. 导航至步骤 3.3 中保存的单张图像并选中它。</li>
	<li>在主工作区再次右键单击并选择 显示 &#62; 自动调整大小 画布/图层 设置在主工作窗口中单击左键，图像将填充工作区域。</li>
	<li>为了选择图像中包含血管网络的区域，在 TrakEM2 中设置区域列表选择。在较小的 TrakEM2 窗口（Template、Project Objects、Layers）中，右键单击 &#34;• 任何事物选择 添加新的子项 &#62; 区域列表.</li>
	<li>在较小的 TrakEM2 窗口中，拖动 &#34;模板 &#62; 任何事物&#34; 到……上 &#34;项目目标 &#62; 项目&#34;然后拖动 &#34;模板 &#62; 任何事物 &#62; • 区域列表&#34; 到……上 &#34;项目目标 &#62; 项目 &#62; 任何事物&#34;. 在……之下 &#34;项目目标 &#62; 项目 &#62; 任何事物&#34;, • 区域列表 将存在于其中。</li>
	<li>在主 TrakEM2 窗口下方的 Z 轴空间选项卡，创建了一个标有“area list”的标签栏。单击以选中它。在主 TrakEM2 窗口中也进行选择 画笔工具. 按压 移位 滚动鼠标滚轮以选择合适的画笔大小，例如，小于血管直径。要保存 TrakEM2 设置，请按 Control + S 键</li>
	<li>使用以下方法绘制血管网络 画笔工具. 要清除，请按住 替代 使用画笔工具时，不要包含失焦区域。经常保存 Control + S.</li>
	<li>当血管网络标记完成后，在 TrakEM2 主窗口中单击右键，然后选择 导出 &#62; 区域列表 作为标签 (tif)。在弹出窗口中选择 100% 比例尺 和 导出所有区域列表关闭 TrakEM2 窗口并选择 是 用于 保存项目.</li>
	<li>AreaLists 的图像将打开，可能显示为一张空白的黑色图像。在 FIJI 主菜单中选择 图像 &#62; 调节 &#62; 亮度/对比度. 在 B&amp;#38;C 窗口中按压 自动按钮 区域列表将变得可见。在主 FIJI 菜单中选择 图像 &#62; 查找 表格 &#62; 倒置 LUT保存此黑白背景上的黑色标签图像，并关闭该图像。</li>
	<li>在 FIJI 中打开标签文件。选择 插件 &#62; 骨骼 &#62; 骨架化将骨架化图像保存为 tif 格式。使用 skeleton.tif 文件作为运行 STAFF 流程分析所需的输入文件之一。保存文件时，文件名中不得包含空格。</li>
	<li>根据需要手动编辑骨架文件，通过插入间隙（使用 绘图工具）在线条图中，例如在血管分支因超出图像平面而未被捕捉到的区域。</li>
</ol>
4. 为 STAFF 分析准备电影序列
<ol>
	<li>在 FIJI 中使用 文件 &#62; 打开 或 文件 &#62; 导入 &#62; 图像序列 打开视频文件。选择图像序列中组织位置随时间保持稳定（呼吸期间除外）的一段时间用于流动分析（时间范围可为数秒至数分钟，帧数可为数百至数万帧）。</li>
	<li>选择 图像 &#62; 复制，通过输入起始和结束帧的编号来复制序列的选定部分。在 图像 &#62; 属性 下检查图像的空间和时间校准，并在必要时进行修正。将图像文件保存为 TIF 格式（或无压缩 AVI 格式）。该 movie.tif 文件将作为运行 STAFF 分析的输入文件。文件名中不得包含空格。</li>
</ol>
5. 将 STAFF 宏安装到 FIJI 中
注意：（重要）FIJI 文件夹的子目录中存在多个文件夹名称相似，部分名称大小写不同。安装 STAFF 时，务必确认选择了正确的文件夹。
<ol>
	<li>从 https://github.com/icbm-iupui/STAFF 下载 STAFF 宏。</li>
	<li>安装时，首先打开 FIJI 文件夹。
	<ol>
		<li>在 Windows 系统中，找到用户空间中安装 FIJI 的文件夹，通常位于桌面。在 MacOS 系统中，找到应用程序文件夹中的 FIJI 图标，右键单击并选择 打开。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 FIJI 文件夹中，打开 plugins 文件夹。进入 plugins 文件夹后，打开 Macros 文件夹。将 STAFF.ijm 复制到此 Macros 文件夹中：Fiji\plugins\Macros\STAFF.ijm。</li>
	<li>在 FIJI 文件夹中，打开 plugins 文件夹。将 STAFF_Dir.jar 复制到此 plugins 文件夹中：Fiji\plugins\STAFF_Dir.jar。</li>
	<li>在 FIJI 文件夹中，打开 macros 文件夹。在此 macros 文件夹中，打开 AutoRun 文件夹。将 STAFF_Loader.ijm 复制到此 AutoRun 文件夹中：Fiji\macros\AutoRun\STAFF_Loader.ijm。</li>
	<li>启动 FIJI 并验证宏的安装。为验证安装是否成功，请选择 插件 &#62; 宏。若安装正确，下拉菜单中将包含以下选项：打开-创建项目、分析骨架、编辑时间间隔、分析流动和生成空间图。</li>
	<li>如果这些命令未出现在宏菜单中，请选择 插件 &#62; 宏 &#62; 安装，打开 Fiji\plugins\Macros 文件夹，选择 STAFF.ijm 文件，然后点击 确定 按钮。此时这些命令应出现在 插件 &#62; 宏 菜单中。</li>
</ol>
6. 使用 STAFF 量化血管血流
<ol>
	<li>创建一个新项目。
	<ol>
		<li>选择 Plugins &#62; Macros &#62; Open-Create Project，并按照提示创建或更新配置文件。</li>
		<li>在 Open-Create Project 菜单中，导航并选择项目目录、输入文件夹以及输入文件 Movie.tif 和 Skeleton.tif。如有必要，编辑自动生成的输出文件名。</li>
		<li>输入最短片段长度（20 µm）、最大测量速度（2,000 µm/s）和最大映射速度（1,000 µm/s）的数值。 
		注意：最短片段长度与每秒帧数的乘积决定了理论上可测量的最大流动速度。文献中报道的毛细血管最高流速约为 2,000 µm/s15。在肝脏中，我们观察到毛细血管流速平均约为 300 µm/s，极少超过 1,000 µm/s。</li>
		<li>输入图像序列的像素尺寸和帧率（来自图像元数据或实验记录）。这些值需由用户手动输入。如果图像存在周期性背景强度闪烁，请勾选 Flicker Correction 选项。</li>
		<li>选择最佳数据可视化参数。选择最大映射速度时，应覆盖约 95% 的数据，以便将数据完整映射到颜色标尺的全范围内。STAFF 会将高速异常值映射至颜色标尺的高速端。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析骨架图像。
	<ol>
		<li>选择 Plugins &#62; Macros &#62; Analyze Skeleton。skeleton.tif 文件将被打开，同时区域兴趣（ROI）管理器将自动启动并运行。 
		注意：Analyze Skeleton 会根据每个像素的邻接像素数量，将其分类为端点、连接点或片段内部。对于每个片段，系统会记录其标识编号（ID 编号）、校准后的分支长度以及分支端点的空间坐标。</li>
		<li>等待片段 ID 显示在骨架图像上，片段列表出现在 ROI 管理器中，并弹出提示窗口表明骨架的 ROI 管理器文件已保存。点击 OK。</li>
		<li>确认在呼吸运动之间，骨架仍位于红细胞流经毛细血管的位置（例如，不在边缘，也不在毛细血管外）。通过打开 movie 文件，然后将 ROI 压缩文件拖放到打开的 movie 上，以叠加方式显示已标记的片段。播放叠加了片段的 movie 进行验证。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择时间区间。
	<ol>
		<li>选择 Plugins &#62; Macros &#62; Select Time Intervals。等待宏程序从 movie 的整个时间段内生成单一片段的显微轨迹图（kymograph）。用户将基于此图选择用于分析的时间区间。如有需要，可使用 Control + + 键放大显微轨迹图。</li>
		<li>矩形选择工具将自动激活。围绕每个时间区间绘制矩形。时间区间长度的一个良好起点是呼吸之间的 1–2 秒间隔，这些间隔在显微轨迹图中表现为水平模糊区域。</li>
		<li>点击 T 键或 ROI 管理器中的 Add 按钮，以记录时间区间选择。根据需要重复此操作以选择多个时间区间。请按从上到下（或从左到右）的顺序依次进行选择。</li>
		<li>通过选择少量时间区间（3 至 4 个）并仅对这些区间完成分析，来评估参数选择（来自 Open-Create Project 步骤）的合理性，因为下一步“Analyze Flow”在处理大型数据集时可能耗时数小时。</li>
		<li>完成选择后，点击每个时间区间窗口中的 Make an ROI 对话框中的 OK。当所选区间已保存至 Project Folder 时，将弹出提示窗口。点击 OK。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分析流动。
	<ol>
		<li>选择 Plugins &#62; Macros &#62; Analyze Flow，此时将打开 Analyze Flow Parameters 对话框，并显示在 Open-Create Project 步骤中输入的数值。如有需要可进行修改，然后点击 OK。</li>
		<li>Output File Names 对话框将打开，并显示在 Open-Create Project 步骤中输入的文件名。如有需要可进行修改，然后点击 OK。</li>
		<li>将弹出一个对话框，询问用户是否准备开始分析。点击 OK 后分析将开始。请等待弹出提示框，以确认流动分析已完成。 
		注意：所需时间取决于处理器速度和数据集大小。</li>
		<li>确认结果文件已作为 .csv 格式的电子表格文件存储在项目文件夹中。 
		注意：输出文件包括：segment_velocities.csv 包含具有正负值的速度数据，用以表示流动方向。代表长度小于最小阈值的片段的单元格中将显示文本 SHORT。速度值超过最大测量速度的单元格中将显示文本 OUT（表示异常值）。kym_ang.csv 包含 FIJI 中 Directionality 插件测量的显微轨迹图角度。good_fit.csv 包含对每个显微轨迹图测得的角度分布拟合曲线的拟合优度。拟合优度较差（&#60; 0.8）可能表明片段中存在隐藏的分支点、时间区间内速度发生变化，或存在光源或室内灯光闪烁。</li>
		<li>检查确认 segment_velocities.csv 中包含的 OUT 值较少。如果存在大量 OUT 值，请首先确认待分析的最短片段长度不小于 15–20 µm，然后重新运行 Analyze Flow。如果新的 segment_velocities.csv 仍包含大量 OUT 值，则勾选 flicker correction 选项，然后重新运行 Analyze Flow。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成空间图谱。
	<ol>
		<li>选择 Plugins &#62; Macros &#62; Produce Spatial Map，此时将打开 Spatial Map Parameters 窗口，显示在 Open-Create Project 步骤中输入的数值。如有需要可进行修改，或直接点击 OK 继续。</li>
		<li>观察随时间生成的流动速度空间图谱序列，其中颜色表示流速。输出为一个 .tif 图像堆栈，每个时间区间对应一幅图像。滚动浏览该 .tif 堆栈，以可视化流动的空间和时间变化。将堆栈保存为 AVI 文件（建议使用无压缩格式以确保最大兼容性），以便作为视频共享。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 使用 STAFF 输出进行定量分析
<ol>
	<li>在电子表格或统计分析程序中打开 segment_velocities.csv 文件。这些数值的正负号表示血流方向相对于该血管段起始/终止点的方向（记录在 Segment ROI 文件中）。</li>
	<li>新建一个电子表格页面，包含所有流速值的绝对值。使用这些值计算总体平均流速、所有血管段随时间变化的平均流速、每个血管段随时间变化的流速，并绘制流速分布的直方图。</li>
	<li>通过在标记的骨架中首先找到与特定形态区域或其他感兴趣区域相关的具体血管段，然后对这些选定的血管段进行分析，以计算特定区域周围的数值。</li>
</ol>

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<li>Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+particle+velocity+from+space-time+images+using+the+Radon+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+computational+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform.</a> Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li>
<li>Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Microscopy+Imaging+of+the+Liver+following+Leishmania+Infection%3A+An+Assessment+of+Hepatic+Hemodynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303(2015).</li>
<li>Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoshikawa%2C+R+%22Microcirculation%22">Microcirculation</a>. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).</li>
<li>Sironi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+flow+mapping+in+complex+vessel+networks+by+single+image+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation.</a> Scientific reports. 4 (1), 7341(2014).</li>
<li>Kamoun, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+RBC+velocity%2C+flux%2C+hematocrit+and+shear+rate+in+vascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks.</a> Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本方案中有多个关键步骤。首先，在进行肝脏活体成像时，尽量减少运动对于生成可用于STAFF分析毛细血管血流的视频至关重要。由于靠近膈肌，呼吸会引起短暂的运动，但固定后的肝脏会在每次呼吸后回到初始位置。通过纱布将手术暴露的肝脏固定在盖玻片底部的培养皿上，并使用倒置显微镜从下方进行成像，可在呼吸间期实现器官的稳定16,17,18,19。其次，强烈建议图像采集速度达到100 fps，因为可测量的血流速度取决于图像采集速度以及血流测量段的最小长度11。第三，生成高质量的骨架图——即血管网络的线条化表示——是利用STAFF获取毛细血管血流速度的下一个关键步骤。骨架线段应位于分析时间段内呼吸间期血管结构的中点附近，并需识别出偏离成像平面的血管分支。这些隐藏分支在血管段上的位置可通过观看视频、检查时空图（kymograph）或观察该血管段随时间变化的流...

微血管系统在生理学中起着关键作用，能够在不断变化的条件下确保组织的有效灌注。微血管功能障碍与多种疾病相关，包括长期的心血管发病率和死亡率、痴呆的发生，以及肝肾疾病，因此成为广泛生物医学研究中的一个重要关注因素1,2,3,4,5。尽管已有多种技术用于评估组织灌注，但只有活体显微镜技术能够以足够的时间和空间分辨率进行数据采集，从而在单个毛细血管水平上表征血流情况。
微血管血流可通过荧光显微镜观察，其方法包括观察荧光微球的运动，或观察在细胞膜不通透性荧光标记物（如荧光标记的葡聚糖或白蛋白）背景下的红细胞运动6，7。微血管血流可在浅层细胞层中通过宽场显微镜成像，也可通过共聚焦或多光子显微镜在深层组织中实现成像。然而，毛细血管的血流速度较快，通常需要高于每秒60帧的速度才能捕捉到红细胞的通过过程。由于大多数激光扫描共聚焦和多光子显微镜需要1–5秒才能完成一幅完整图像的扫描，因此通常只能通过限制视场范围来实现足够高的成像速度，有时甚至需缩小至单条扫描线8。将测量局限于特定毛细血管节段的做法存在两个问题：（1）可能引入选择偏倚；（2）无法捕捉毛细血管血流速率在空间和时间上的异质性。相比之下，配备科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机的宽场数字显微镜可实现超过100帧/秒的成像速度9，10。这类成本较低的系统在典型的生物医学实验室中较为常见，使得对整个二维微血管网络的连续动态成像成为可能。此时，关键问题转化为如何找到一种分析方法，能够从高速视频显微镜产生的大量且复杂的图像数据中提取出有意义的定量信息。
为了实现对全场流动数据的分析，我们开发了STAFF，这是一种新型图像分析软件，能够对高速采集的整个显微镜视野图像序列中的微血管血流进行连续测量11。该方法适用于多种不同的实验系统和成像模式，STAFF图像分析软件以宏工具集的形式集成于ImageJ的FIJI实现平台中12。本研究所采用的可视化微血管血流的基本原理是：首先需要提供一定的对比度，以便能够成像毛细血管内的红细胞。在我们的研究中，这种对比度由一种被红细胞排除的体相荧光探针提供。随后，通过高速采集活体动物体内荧光标记血浆中呈负染形态的红细胞的位移，即可量化血流速度8。接着，我们利用STAFF生成每段毛细血管在多个时间间隔内沿距离变化的图谱，即动态图（kymograph），检测动态图中存在的斜率13，并根据这些斜率计算微血管血流速率。该方法可应用于任何可进行成像观察的毛细血管床所采集的图像。本文中，我们描述了将活体显微成像（IVM）与STAFF联合应用于肝脏血流研究的具体方法。

<table><tbody><tr><td>#5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Dumont #5 Inox 镊子</td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠</td><td>Jackson Labs</td><td></td><td>雄性，9–12 周龄</td></tr><tr><td>套管</td><td>Instech</td><td>BTPE-10</td><td>聚乙烯导管 0.011 × 0.024 英寸</td></tr><tr><td>CMOS 相机</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-42U30</td><td>4.0LT 科学级 CMOS 相机</td></tr><tr><td>盖玻片底培养皿</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td>WillCo Dish 玻璃底 GWST5040</td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji ImageJ 图像分析软件</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip</td></tr><tr><td>荧光素葡聚糖</td><td>Thermo Fisher, Invitrogen</td><td>D1822</td><td>葡聚糖，荧光素标记，分子量 70,000，阴离子型，赖氨酸可固定</td></tr><tr><td>纱布海绵</td><td>Fisher</td><td>22-415-504</td><td>2×2 英寸 Dukal 无菌纱布海绵</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Reptitherm</td><td>RH-4</td><td>置于小鼠与载物台之间</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Sunbeam</td><td>000732-500-000U</td><td>覆盖于小鼠上方</td></tr><tr><td>倒置落射荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon TiE 倒置显微镜</td></tr><tr><td>Isis 啮齿类电动剃毛器</td><td>Braun Aesculap</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Abbott GmbH</td><td>PZN4831850</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔接头适配器</td><td>Fisher</td><td>14-826-19E</td><td>导管适配器</td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>Castro Viejo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td>Plan Fluor 20×，数值孔径 0.75，水浸物镜</td></tr><tr><td>针头</td><td>Fisher</td><td></td><td>30 G × 1/2&quot;</td></tr><tr><td>持针器</td><td>Olsen-Hegar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>物镜加热器</td><td>BioScience Tools</td><td>MTC-HLS-025</td><td>带物镜加热器的温度控制器</td></tr><tr><td>直肠温度计</td><td>Braintree Scientific, INC</td><td>TH-5A</td><td>小鼠体温监测</td></tr><tr><td>STAFF 宏程序</td><td></td><td></td><td>https://github.com/icbm-iupui/STAFF</td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Harvard Bioscience</td><td>723288</td><td>黑色丝线缝合线，6-0 规格，线轴装</td></tr></tbody></table>

微血管内全场流动的时空分析

Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow in Microvasculature

血流速度和分布的变化对于维持组织和器官的灌注以应对细胞需求的变化至关重要。此外，微循环中出现的异常往往是多种病理状态发展的首要指标。光学成像技术的进步使得活体显微成像（intravital microscopy, IVM）成为一种实用方法，能够在活体动物中以高速、长时间地实现细胞和亚细胞水平的成像。然而，尽管维持充分的组织灌注极为重要，毛细血管血流在空间和时间上的变异性却很少被系统记录。在传统方法中，通常仅选择少量毛细血管段在有限的时间内进行成像。为了以无偏倚的方式全面量化毛细血管血流，我们开发了全场血流时空分析法（Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow, STAFF），这是一种用于FIJI开源图像处理平台的宏程序&#160;图像分析软件。利用毛细血管内血流全场的高速图像序列，STAFF 可生成&#160;代表每个时间间隔内每条血管段随时间变化的运动图像，称为线状图（kymographs）。通过线状图，STAFF 根据红细胞在单位时间内移动的距离计算流速，并将速度数据输出为一系列彩色编码的空间图以供可视化，同时提供表格形式的定量分析数据。在正常小鼠肝脏中，STAFF 分析量化了肝小叶内中央周围区与门管周围区之间血流速度的显著差异。更为意外的是，不同肝窦状隙之间的血流速度也存在明显差异。&#160;并排存在且在数秒内单个血管节段内可见的波动。STAFF 是一种强大的新工具，能够通过测量毛细血管血流复杂的时空动态，提供全新的研究见解。

STAFF 分析可在数秒至数分钟的时间范围内，对整个显微镜视野内的微血管流速进行全面统计。代表性结果如图1、图2、图3和图4所示。图1展示了一个小鼠肝脏微血管网络的时间序列示例、用于定义微血管流动轴线的骨架化图像的生成过程，以及由 STAFF 生成的用于定量分析的各个血管段分布图。STAFF 随后利用骨架化图像将微血管网络分解为独立的血管段，并为每一段生成相应的时空图（kymograph）图像。这些图像连同用于确定时空图分析时间区间的工具一并提供给用户（图2）。接着，STAFF 利用骨架结构和用户提供的时间区间，将每一段的时空图进一步划分为独立的血管段-时间区间。随后，STAFF 识别出每个血管段-时间区间时空图中的主要角度，并以 .csv 数据文件的形式提供流速测量结果（<stro...

为了从高速毛细血管血流图像序列中量化微血管血流，我们开发了STAFF（全场时空血流分析）软件。该软件可对整个图像视野内随时间变化的血流速度进行评估，并生成一系列彩色编码的空间图谱用于可视化，同时提供表格化输出以进行定量分析。

血流速度和分布的变化对于维持组织和器官的灌注至关重要，能够响应细胞需求的变化。此外，……

由于微血管血流在不同毛细血管之间存在差异，并且在数秒的时间尺度上动态变化，因此需要一种能够对整个视野内血流进行连续定量的方法。Staff 可在数小时内实现对整个显微镜视野范围内血流速度的近乎连续测量，而手动完成相同测量则需数月时间。尽管这些操作流程较为简单，但通过可视化演示将显著帮助初次使用者顺利掌握 Staff 的使用方法。使用 TrakEM2 定义血管网络时，首先选择“文件”、“新建”和“TrakEM2 空白”以创建一个新的空白 TrakEM2 项目，并选择包含来自视频的单张图像的新文件夹作为项目文件夹。TrakEM2 窗口将打开。在主工作区域中右键单击，然后选择“导入”和“导入图像”。导航至单个已保存的图像并选择该图像。再次在主工作区域右键单击，然后选择“显示”和“自动调整画布/图层集大小”。接着，在主工作窗口内左键单击。图像将填充工作区域。要在图像中选择包含血管网络的区域，请在较小的 TrakEM2 窗口中，右键单击模板“Anything”，然后选择“Add New Child”和“Area List”。在较小的 TrakEM2 窗口中，将模板“Anything”拖动到“Project Objects”下的未命名项目上。然后将模板“Anything, area list”拖动到“Project Objects”下的“untitled projects”中的“Anything”上。在“Project Objects”下的“untitled project”中，现在将出现“Anything”区域列表。在主 TrakEM2 窗口的“Z Space”选项卡下，将创建一个标有“Area List”的工具栏。单击以选择列表。在 TrakEM2 主窗口中，选择画笔工具，并在滚动鼠标滚轮的同时按住 Shift 键，以选择小于目标血管直径的画笔尺寸。按 Ctrl+S 保存项目。使用画笔工具标记血管网络，排除任何失焦区域。标记完成后，在 TrakEM2 主窗口中右键单击，选择“导出”和“将区域列表导出为标签”。在弹出窗口中，选择“比例”，设置为 100%，并导出所有区域列表。关闭 TrakEM2 窗口，并选择“是”以保存项目。Area List 的图像将会打开，可能显示为一张空白的黑色图像。在 Fiji 主菜单中，依次选择“图像”、“调整”、“亮度/对比度”。在“亮度与对比度”窗口中，点击“自动”，区域列表将变得可见。在 Fiji 主菜单中，选择“图像”、“查找表”和“反转查找表”。将此白色背景上的黑色标签图像保存为 t-i-f 文件，然后关闭该图像。在 Fiji 中打开 Labels 文件，选择 Plugins（插件）、Skeleton（骨架）和 Skeleton Eyes（骨架眼）。然后将 Skeleton Eyes 图像保存为 t-i-f 文件。要创建新的 staff 项目，请选择 Plugins（插件）、Macros（宏）和 Open/Create Project（打开/创建项目），并按照提示创建或更新配置文件。在“打开/创建项目”菜单中，导航并选择项目目录的输入文件夹，以及输入的视频和骨架文件。输入最大测量速度、最大映射速度、最小片段长度、像素尺寸和帧率的数值。如果图像存在周期性背景强度闪烁，请勾选闪烁校正框，然后点击“确定”。调整参数以实现数据的最佳可视化效果。将最大速度映射设置为包含约95%的数据，以便数据能够覆盖整个颜色标尺的范围。要分析骨架结构，请选择插件、宏和骨架分析。骨架文件将打开，同时区域兴趣管理器将打开并运行。在“兴趣区域管理器”中，单击“显示全部”和“标签”，然后单击“确定”。要选择时间区间，请依次选择“插件”、“宏”和“编辑时间区间”，并等待宏从视频的整个时长中基于单个片段生成一条线扫图。根据需要使用 Ctrl 键配合加号或减号来调整线扫图的显示尺寸，并使用矩形选择工具在每个时间区间周围绘制矩形。按下 T 键或单击“添加”按钮以记录一个时间区间选择，根据需要重复操作以选择多个时间区间。为评估参数选择，选取三到四个时间间隔，并仅对这些间隔完成分析。完成时间间隔选择后，点击“确定”。当所选间隔已保存至项目文件夹时，将弹出一个窗口。单击“确定”。要分析流式数据，请选择“插件”、“宏”和“分析流式”。将打开“分析流式参数”对话框，并显示在“打开/创建项目”步骤中输入的值。如有必要，请编辑这些值，然后单击“确定”。“输出文件名”对话框将打开，并显示在“打开/创建项目”步骤中输入的文件名。根据需要编辑这些名称，然后点击“确定”以开始流体分析。当弹出对话框提示流体已分析完毕时，点击“确定”将分析结果保存为 CSV 电子表格文件。要生成空间图谱，请选择“插件”、“宏”和“生成空间图谱”。“空间图参数”窗口将打开，显示在“打开/创建项目”步骤中输入的数值。根据需要编辑这些数值，然后点击“确定”。系统将生成一系列流动速度的空间图，每种颜色代表不同的流速。通过滚动每个时间间隔生成的一幅图像，可直观查看流动在空间和时间上的变化情况，并将该图像序列保存为 avi 文件，以便作为视频共享。Staff 分析可生成显微镜视野内完整微血管流速的普查数据，观测时间可从数秒至数分钟不等。例如，在小鼠肝脏微血管网络的时间序列图像中，利用其中单幅图像生成的骨架化图像来定义微血管流动的轴线，从而识别 Staff 生成的各个血管节段图谱，用于后续的血流定量分析。基于骨架化图像生成的各个血管节段，可进一步生成随时间变化的沿线段方向光强分布的时空图（kymograph）。可通过骨架和用户提供的时序区间，将每个节段的显迹图分解为独立的节段时序区间。随后，工作人员识别出每个节段时序区间显迹图中的主要角度，并提供以CSV数据文件形式输出的计算速度测量值。该CSV输出结果可用于分析整体速度分布，从而实现对各个血管节段随时间变化的速度进行绘图分析。可以将其可视化为按颜色编码的速度图图像的堆叠。需要注意的是，Staff 分析所得结果取决于图像序列的质量，包括样本稳定性、帧率、分辨率以及信噪比。Staff 速度图输出可直观展示空间流动模式，而 Staff CSV 输出则可用于对处理组内及处理组间的流速进行统计分析。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

微血管中场流的空间时间分析

采用活体显微技术追踪软脑膜微循环中血流动力学和炎症事件的时间与空间变化。...

使用封闭式颅窗对小鼠脑微循环进行活体显微成像

微粒图像测速技术（μPIV）用于可视化血流中示踪微粒的成对图像，通过互相关分析获得精确的速度分布。剪切速率、最大流速、速度分布形态及流量等参数均可由这些测量结果推导得出，这些参数均具有临床应用价值。...

微粒子图像测速法用于微小血流速度分布测量

活体显微镜可用于动物，以观察和测量视网膜血管直径、血流速度以及总视网膜血流量。...

小鼠视网膜血流的活体视频显微测量

生物膜与其周围环境之间存在复杂的相互作用。为了全面研究生物膜与环境之间的相互作用，本文介绍了一系列方法，用于构建有利于生物膜生长的异质化学环境，量化局部流速，以及分析生物膜菌落内部及周围的物质传输过程。...

生物膜与生境异质性协同发育的表征方法

本文介绍了制备透明神经血管仿体及其内部流动表征的简化方法。我们强调了若干关键参数，并展示了这些参数与测量场准确度之间的关系。...

中尺度粒子图像测速法在神经血管血流研究中的应用 体外

本文提供了一种微流控芯片及一种可自动控制、高效循环的微流控系统，可重现血管新生的初始微环境，使内皮细胞（ECs）同时受到高管腔剪切应力、生理水平的跨内皮流动以及不同分布的血管内皮生长因子（VEGF）的刺激。...

模拟新生血管化初始事件的微流控模型

我们介绍了一种分离和培养原代小鼠胚胎腭部间充质细胞的方案，用于进行二维（2D）生长和伤口修复实验的延时成像。同时提供了分析延时成像数据的方法，以确定细胞流的形成及定向运动能力。...

分离与原代小鼠胚胎腭间充质细胞的延时成像以分析集体运动特性

本方案介绍了一种利用光片荧光显微镜进行定量整体三维血管成像的快速方法。该方法的有效性通过鸡胚模型的咽弓动脉系统加以验证，并对血流动力学力进行了量化。 通过...

小型动物血管系统的快速全组织高分辨率成像用于定量研究

超声定位显微镜（Ultrasound Localization Microscopy, ULM）是一种 recently developed 技术，可实现前所未有的分辨率来成像微血管系统 体内本文详细描述了如何利用专为临床前研究设计的标准化功能超声成像平台，获得啮齿类动物脑微血管的超分辨率图像。...

超分辨率超声定位显微成像用于啮齿类动物脑微血管系统的精细定位

本文描述了一种利用光控小GTP酶活性的时空调控方法。该方法基于雷帕霉素诱导的FKBP-FRB异源二聚化及光敏保护基团系统。通过优化光照条件，可实现亚细胞水平上小GTP酶活性的时空精确控制。...

活细胞中亚细胞水平及秒级时间尺度下小GTP酶活性的时空操控

学习使用STAFF软件对微血管血流进行连续定量分析，通过生成彩色编码空间图实现可视化。该方法显著缩短测量时间，帮助研究人员高效获取全视野血流速度数据。

微血管内全场流动的时空分析

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