使用液相色谱串联质谱法对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞脂质组进行定量分析

本方案提供了一种准确且可重复的方法，通过单一提取方法和单一液相色谱-质谱（LC-MS）方法，对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的十种不同脂质类别进行定量分析。该方法能够检测并定量具有不同化学和物理性质的同量异位及同分异构脂质分子。在培养酿酒酵母时，首先向两个含有无菌YNB培养基的锥形瓶中，分别加入5 ml无菌的20%葡萄糖储备液，使葡萄糖终浓度为2%。

然后，使用无菌移液管将含有五乘以十的七次方个酵母细胞的过夜酵母培养物转移至每个锥形瓶中，并在30摄氏度下以每分钟200转的转速振荡培养至少24小时。进行脂质提取时，测定每毫升培养液中的酵母细胞总数，并将五乘以十的七次方个细胞转移至15 ml离心管中。加入预冷的纳米纯水，使总体积达到15 ml，通过离心收集细胞。

将酵母沉淀重悬于15 ml预冷的等渗碳酸氢铵缓冲液中，进行第二次离心，随后将沉淀重悬于1.5 ml新鲜的预冷碳酸氢铵溶液中。离心结束后，将沉淀于-80摄氏度保存至提取前。开始脂质提取时，先将细胞沉淀置于冰上解冻，然后在200 µL预冷的纳米纯水中重悬细胞。

在通风橱中，将细胞悬液转移至一个 15 ml 耐高压玻璃螺口离心管中，该管配有聚四氟乙烯衬垫的盖子，并加入 25 µL 内标脂质混合物（用 2:1 氯仿-甲醇配制）。向管中加入 100 µL 425–600 µm 经酸洗涤的玻璃珠以及 600 µL 17:1 氯仿-甲醇溶液。在室温下高速涡旋振荡该管 5 分钟，以裂解细胞。

随后在室温下以低速涡旋震荡一小时，以促进脂质提取。提取结束后，将样品在冰上孵育15分钟，以促进蛋白质沉淀以及水相与有机相的分离。孵育结束后，离心样品以进一步分离上层水相和下层有机相，并在通风橱中使用硼硅酸盐玻璃移液管将下层有机相转移至新的15 ml高强度玻璃螺口离心管中，该离心管配有聚四氟乙烯衬垫盖。

将下层有机相置于氮气气流下，在通风橱中向剩余的上层水相加入300微升2:1的氯仿-甲醇混合液。为促进磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和心磷脂的提取，于室温下剧烈涡旋振荡试管5分钟，然后离心样品。使用硼硅酸盐玻璃移液管将下层有机相转移至氮气保护下的下层有机相中，并在通风橱中蒸发合并后的有机相中的溶剂。

然后，在氮气流下封闭脂质薄膜管，并将样品在 80 摄氏度下保存。进行液相色谱时，向脂质薄膜管中加入 500 微升体积比为 63:35:5 的乙腈-2-丙醇-纳米纯水混合液，于室温下涡旋振荡三次，每次十秒。将管内物质进行超声处理 15 分钟后，再按上述方法涡旋振荡三次，每次十秒。

将100微升样品转移至用于24孔板的带插管的玻璃小瓶中，并去除插管内的任何气泡。将插管放入24孔板的一个孔中，并将与预柱连接的反相C18 CSH色谱柱装入液相色谱系统。设置柱温为55摄氏度，流速为300微升每分钟。

设置好所有参数后，在上样第一个样品之前，先上样十微升的提取空白样。随后，按照指示使用液相色谱梯度分离不同的脂质种类。将生成来自细胞提取脂质的LC-MS数据的代表性总离子色谱图。

对于提取的脂质进行质谱分析，将样品上样至配备加热电喷雾电离离子源的质谱仪，并按照表格中所述设置分析参数。使用傅里叶变换分析器在150–2000道尔顿的质量范围内以60,000的分辨率检测MS-1母离子，随后根据表格中所示设置检测MS-2二级离子。

为了从广泛的串联液相色谱-质谱（LC-MS）文件中识别和定量不同类型的脂质，需搜索包含全扫描一级质谱（MS-1）数据和依赖数据的二级质谱（MS-2）数据的LC-MS原始文件，针对游离未酯化脂肪酸、心磷脂、植烷酰基神经酰胺、植烷鞘氨醇、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸和三酰甘油等脂质类别，采用前体离子五百万分之一、产物离子十万分之一的质量/电荷比容差进行分析。随后，按照软件用户手册中的说明，识别内标脂质以及具有非常见脂肪酸组成的脂质种类。该高灵敏度串联LC-MS方法可实现对低至0.165皮摩尔/微升浓度的脂质分子种类的鉴定与定量。

该定量限在不同脂质类别中因浓度范围较宽而有所差异。本方法可通过使用电喷雾电离质谱的替代性流动相添加剂，提高脂质离子化效率。这些替代性流动相添加剂均可用于正相和反相液相色谱柱。

在质谱的电喷雾电离负离子模式下，若将碰撞诱导解离方法与乙酸铵流动相添加剂联用，则具有优势，因为在此条件下，该方法可提高MS-1脂质离子碎裂为MS-2产物的效率。相反，在质谱的电喷雾电离正离子模式下，若将高能碰撞解离方法与甲酸铵流动相添加剂联用则更为有利，因为在此条件下，该方法能够提高MS-1脂质离子碎裂为MS-2产物的效率。收集有机相时，切勿混合各相。

在氮气流下封闭管子。去除插入物中的任何气泡，并以正确方向连接色谱柱。如果无法通过液相色谱-质谱法（LC-MS）确定任何峰的归属，则可使用质谱-核磁共振联用技术（MS-NMR）推断该分子的结构。