使用高分辨率X射线吸收光谱在低温下制备生物样品以进行形态分析
May 27th, 2022
该协议提出了为基于同步加速器的X射线吸收光谱实验制备生物冷冻样品的详细程序。我们通过癌症和浮游植物细胞方案的示例描述了优化样品制备和冷冻保存所需的所有步骤。该方法提供了样品冷冻制备的通用标准。
该协议已针对细胞标本进行了标准化，允许比较在不同同步加速器位置运行的实验。该技术的主要优点是简单明了的工作流程，可以快速可靠地保存样品的化学整合。对这种技术不熟悉的个体可能会与冷冻的迭代细胞造粒和细胞沉淀快速加载到冷冻样品顺序中作斗争。
在低温下精确快速地断开样品链接至关重要。因此，视觉演示对于了解如何执行该技术至关重要。为了制备用于硒形态的人前列腺和卵巢癌细胞系细胞沉淀，将每个细胞系中适当数量的细胞接种到每个条件下的三个T-75烧瓶中，在层流罩中的适当细胞培养基中，并将烧瓶放入37摄氏度和5%二氧化碳细胞培养箱中，直到细胞汇合80%。
为了将癌细胞暴露于硒处理中，首先在室温下超声处理新鲜制备的纳米颗粒储备溶液在超声水浴中超声处理30分钟，然后将全细胞培养基中的硒纳米颗粒溶液连续稀释至适当的工作浓度。在层流罩中，每次洗涤用5毫升37摄氏度PBS轻轻洗涤细胞两次，并使用无菌的25毫升移液管小心地将15毫升感兴趣的硒处理液添加到烧瓶的底部。在不完全密封烧瓶的情况下关闭盖子，并将烧瓶水平放置在细胞培养箱中24小时。
为了在洗涤和补充培养基后制备细胞沉淀，每个烧瓶使用一个细胞刮刀轻轻分离细胞。使用培养基将粘附在烧瓶上的任何细胞冲洗到上清液中，并通过离心收集解离的细胞。每次洗涤每管用五毫升PBS洗涤沉淀两次，以除去所有剩余的处理痕迹，并将细胞重悬于一毫升PBS中。
将细胞转移到1.5毫升聚丙烯管中，并用另一次离心收集细胞。然后使用200微升移液管轻轻除去所有上清液，并将每个1.5毫升管的底部浸入液氮中至细胞沉淀的水平。冷冻后立即将管子转移到液氮杜瓦瓶中以长期储存。
对于高分辨率X射线吸收光谱，在布拉格条件下，相对于感兴趣的荧光线能量优化晶体分析仪光谱仪的所有晶体，并使用已知吸收边缘能量位置的参考来校准入射单色束能量。将样品架转移到用于生物样品的液氦低温恒温器中，并将低温恒温器设置为10开尔文度，然后按照同步加速器安全规则关闭实验小屋，然后开始分析。在这里，具有代表性的高分辨率X射线吸收光谱光谱在初始状态下和在营养培养基中孵育的细胞中的硒表明，初始硒纳米颗粒中的硒以零硒和脂肪团样形式存在。
然而，在与PC3细胞相互作用后，硒主要以零硒的形式存在于细胞中，这表明细胞内硒物种的变化。对于铁，高分辨率X射线吸收光谱参考光谱根据铁氧化态表现出不同的边缘位置，还原的铁种类转移到低能值。在硅藻颗粒的相同位置收集的两个连续光谱相似，表明当在10开尔文下使用氦低温恒温器时，两次采集之间的光束损伤受到限制。
此外，硅藻颗粒不同位置的光谱相同，表明样品颗粒是均匀的，并且光谱可以平均以获得更好的信噪比频谱。最关键的步骤是纳米颗粒的制备，在低温下造粒，以及标准参考样品的制备。该程序可应用于其他本体分析技术，如ICP-MS或HPLC-ICP-MS或其他能够在低温下进行的非同步加速器光谱技术。
使用这种方法可以探索其他科学问题，特别是在生物地质学，生物化学，环境科学或毒理学研究领域。硒化合物和硒纳米颗粒对您的健康可能同样艰巨，应该使用手套，眼镜和口罩在专用的化学罩中操纵。
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概述
本协议介绍了一种详细的程序，用于为基于同步加速器的X射线吸收光谱实验准备生物冷冻样品。它描述了优化样品制备和冷冻保存所需的步骤，并以癌细胞和浮游植物细胞为例。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物冷冻保存
- X射线吸收光谱
- 细胞标本制备
背景
- 本协议针对细胞标本进行了标准化。
- 它允许比较不同同步加速器位置的实验。
- 该技术提供了一个简单的工作流程来保存化学完整性。
- 视觉演示对于理解该技术至关重要。
研究目的
- 建立样品冷冻制备的通用标准。
- 促进生物样品的可靠保存。
- 改善对这一技术不熟悉的研究人员的工作流程。
使用的方法
- 制备人类前列腺和卵巢癌细胞系颗粒。
- 在受控条件下将细胞接种在T-75瓶中。
- 在37°C、5% CO2培养箱中培养细胞直至80%融合。
- 将细胞颗粒快速装入冷冻样品持有器中。
主要结果
- 成功优化了冷冻保存技术。
- 证明了在保存样品化学完整性方面的可靠性。
- 标准化协议增强了实验间的可重复性。
- 视觉辅助工具改善了对程序的理解。
结论
- 该方法为生物冷冻保存提供了一个稳健的框架。
- 它适用于各种细胞标本，包括癌细胞。
- 未来的研究可以在这种标准化方法上进行同步加速器实验的拓展。
常见问题
Executive Industry Relevance
Preserving the native chemical state of biological samples is critical for accurate metalloprotein and nanoparticle speciation in drug target validation and mechanistic studies. This cryo-preservation protocol enables reliable, reproducible X-ray absorption spectroscopy analysis across synchrotron facilities, supporting consistent data generation in early discovery workflows. By minimizing radiation-induced artifacts and maintaining sample integrity, it strengthens predictive confidence in target engagement and pathway modulation studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of metal speciation in cancer cells to validate selenium or iron-based therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Standardized workflow allows cross-laboratory comparison of target engagement data from different synchrotron sources.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares homogeneous, damage-resistant samples for quantitative metalloproteomic screening campaigns.
- Operational Value: Cryo-fixation preserves labile species, enabling reliable detection of low-abundance metallodrugs or nanoparticles in cellular systems.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant systems by preserving near-native hydrated state of phytoplankton and mammalian cells for mechanistic de-risking.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by enabling longitudinal tracking of metal fate in biological systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery biology phase, where understanding metal localization and oxidation state informs target validation and lead identification decisions, particularly for metallodrugs or nanoparticle-based therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing quantitative, speciation-resolved data on metal distribution in treated vs. untreated cells.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, reproducible sample preparation compatible with high-throughput synchrotron screening.
- Analytics: Delivers edge-position and XANES/EXAFS outputs that quantify oxidation states and ligand environments for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work by preserving samples in a state reflective of in vivo conditions, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cryo-preparation platform applicable across multiple projects involving metal-containing biologics, environmental toxins, or nutrient-metabolism studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by preserving native metal speciation, increasing confidence in target validation data.
- Operational Value: Ensures reproducibility across sites and time, minimizing variability in multi-institutional collaborative projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable speciation data that de-risks metallo-based therapeutic mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on confirmed target engagement and pathway modulation evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, cryogenic handling, and synchrotron-based X-ray spectroscopy.
- Depends on access to helium cryostats and high-resolution fluorescence-detected beamlines for optimal sensitivity.
- Necessitates standardized reference samples and energy calibration protocols for cross-experiment comparability.
- Involves adaptation considerations for non-adherent or fragile cell types during pelleting and freezing steps.
- Limited by beam sensitivity of certain metalloproteins, though cryo-preservation significantly extends tolerable exposure times.
