Name: 使用高分辨率X射线吸收光谱在低温下制备生物样品以进行形态分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: 学习低温生物样品制备方法，用于同步辐射X射线吸收光谱的形态分析。本方案以人前列腺和卵巢癌细胞为例，建立标准化冷冻保存流程，确保样品化学完整性，适用于不同同步辐射实验地点的可重复研究。

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我们感谢CEMHTI（法国奥尔良，ANR-13-BS08-0012-01）和Labex OSUG@2020（法国格勒诺布尔，ANR-10-LABX-0056）对光束线开发提供的资金支持。FAME-UHD项目获得了法国&#34;grand emprunt&#34; EquipEx（EcoX，ANR-10-EQPX-27-01）、CEA-CNRS CRG联合体以及INSU CNRS研究所的财政资助。我们感谢在实验过程中所有参与人员的贡献，特别是BM30B和BM16线站上的所有工作人员。作者感谢欧洲同步辐射设施提供的同步辐射机时。我们同时感谢PHYTOMET ANR项目（ANR-16-CE01-0008）和SEDMAC项目（INCA-Plan cancer-ASC16019CS）提供的资金支持。

1. 用于硒形态分析的人源PC-3和OVCAR-3癌细胞沉淀物的制备
注意：以下实验方案改编自 Weekley 等人的研究10。所有步骤均须在生物安全二级条件和限制下，于细胞培养罩内采用无菌技术进行。
<ol>
	<li>使用马氏计数板对细胞进行计数。PC-3细胞系每瓶接种150,000–200,000个细胞，OVCAR-3细胞系每瓶接种300,000个细胞。</li>
	<li>在适当的细胞培养基中，将种子细胞接种于T-75培养瓶中（每种条件设三个培养瓶，以实现三重复）表1在超净工作台内。</li>
	<li>将细胞培养物置于37 °C、含5% CO₂的湿润培养箱中继续培养2 待其生长至80%融合度。通常情况下，PC-3前列腺癌细胞系每24小时倍增一次，而OVCAR-3卵巢癌细胞系则需72小时。培养瓶须置于培养箱中。</li>
	<li>同时，将用于处理的硒纳米颗粒（Se-NPs）稀释至最终浓度，该浓度对应于通过MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）法预先测定的IC20（抑制浓度，即引起20%细胞死亡的浓度），用于评估细胞毒性。这些浓度因Se-NPs的类型而异，也因所研究的细胞系不同而有所差异。
	<ol>
		<li>将纳米颗粒储备液（2 mg/mL）置于&#160;在室温（RT）下，于超声水浴中处理30分钟，使用牛血清白蛋白（BSA）或壳聚糖包被的硒纳米颗粒（Se-NPs）。</li>
		<li>在完全细胞培养基中通过连续稀释法将Se-NPs溶液稀释至工作浓度。每次稀释之间涡旋振荡1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用稀释的硒盐制备硒阳性对照以进行处理。
	<ol>
		<li>在15 mL聚丙烯管中配制1 mg/mL的亚硒酸钠水溶液储备液。取1 mg亚硒酸钠粉末，加入1 mL超纯水，混匀。</li>
		<li>将储备液涡旋振荡1分钟。</li>
		<li>将亚硒酸钠储备液用完全细胞培养基进行系列稀释，以获得工作浓度。 
		注意：每次稀释前务必反复吹打数次，以混匀溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将癌细胞暴露于硒处理中。 
	注意：本实验步骤需针对每种测试的纳米颗粒（NP）重复进行。此处的纳米颗粒分为两种类型，分别为牛血清白蛋白（BSA）和壳聚糖包被的硒纳米颗粒（Se-NPs），另设对照组。亚硒酸钠溶液作为阳性对照，不进行任何处理作为阴性对照。
	<ol>
		<li>在超净工作台中打开含有细胞的三个T-75培养瓶。</li>
		<li>吸除培养基，用5 mL预热（37 °C）的磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤细胞2次。</li>
		<li>轻轻将15 mL处理液加入每个培养瓶底部侧面，不要直接加在细胞层上，使用配备25 mL无菌塑料吸管的自动移液器进行操作。将瓶盖盖回培养瓶上，但不要拧紧。 
		注意：如步骤 1.3 和 1.4 所述，处理溶液必须预先重悬并混匀。</li>
		<li>将三个烧瓶水平放置于37 °C、5% CO₂湿润环境的培养箱中2 24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞沉淀的制备
	<ol>
		<li>在T75培养瓶中用5 mL预热的PBS（37 °C）轻轻洗涤细胞2次。</li>
		<li>使用配备10 mL无菌塑料移液管的移液器，向T-75培养瓶中的细胞层加入6 mL预热至37 °C的细胞培养基。</li>
		<li>使用细胞刮轻轻刮取细胞进行收集。每个培养瓶使用一个细胞刮。</li>
		<li>使用移液器助吸器和10 mL移液管吸取液体，并将细胞/培养基冲洗回培养瓶表面，以收集全部细胞。重复此步骤数次，以解离并分散细胞。将含有细胞的培养基收集至15 mL聚丙烯管中。</li>
		<li>250 x g 离心 g 室温下离心5分钟。吸除上清液。</li>
		<li>用5 mL PBS重悬细胞以洗涤细胞。</li>
		<li>250 x g 离心 g 室温下孵育5分钟。吸除上清液，重复步骤1.6.5和1.6.6两次，以彻底去除处理剂的所有残留痕迹。</li>
		<li>将细胞重悬于 1 mL PBS 中，并转移至 1.5 mL 聚丙烯管中。最后，在 250 x g 室温下孵育5分钟。 图1 表示离心后弃去上清液所得的细胞沉淀。</li>
		<li>使用 200 µL 移液器轻轻吸除所有 PBS 上清液。 
		注意：切勿触碰或损坏细胞沉淀。理想情况下，沉淀应呈2–3 mm高度或厚度，直径为3–6 mm。对于PC-3细胞系，9 x 106–10 × 106 进行该检测需要细胞。对于 OVCAR-3 细胞系，需要 8 x 106–9 × 106 需要细胞（图1）。在后续缓冲液洗涤步骤中可能会损失部分细胞。细胞数量越多，形成的沉淀越好。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞沉淀物的速冻
	<ol>
		<li>将装有沉淀物的1.5 mL离心管底部浸入液氮（LN₂）中2) 至细胞沉淀的水平。</li>
		<li>在充满惰性气体（如氮气）的手套箱中，将1.5 mL离心管轻轻敲击于液氮罐口的平坦表面，收集细胞沉淀2冷却的铜块（图2然后收集沉淀，避免细胞损失。 
		注意：使用液氮时，需配备冷冻防护装备、实验服、密闭鞋、防冻手套以及面罩或护目镜2 操作。</li>
		<li>如有需要，一个LN2 冷却的枪头可用于帮助取出沉淀。 
		注意：冻存的细胞沉淀可能碎裂。这些步骤必须在几分钟内完成，并依赖于研究人员的熟练程度和操作速度。</li>
		<li>冷冻样品的尺寸必须与冷冻切片机样品架相匹配。使用所述设备时，若细胞沉淀的高度大于2 mm，且略小于用于XAS分析的样品架孔径，则可直接使用该样品。若不符合此条件，或需要获得一个平整的分析表面，则必须制备一个整体圆柱形压片，同时保持样品处于冷冻状态。若细胞沉淀已碎裂，建议在充满惰性气体气氛并彻底置换的手套箱中进行以下操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备大体积冷冻圆柱形颗粒
	<ol>
		<li>将手动液压机所有会与样品接触的部件浸入液氮中2 (图3A；3 毫米或 5 毫米直径的压片模具、模具、活塞/拉丝</li>
		<li>将快速冷冻的沉淀物碎片转移至装有相应沉淀物模具的模具中（图3B).</li>
		<li>使用液压机快速压片。制备5 mm直径的片剂使用1.5吨压力，或制备3 mm直径的片剂使用0.5吨压力即可（图3C). 
		注意：每次使用液压机制备完样品后，需用氮气将所有材料充分解冻并干燥，以避免残留霜气和湿气带来问题。</li>
		<li>快速收集冷冻细胞的大量沉淀，并将其放入合适的冻存管中储存。</li>
		<li>将其存回液氮中2 用于长期储存的容器。</li>
		<li>转移并安装冷冻沉淀物以进行分析。将保存在液氮中的沉淀物2 预冷的冻存管被转移至液氮中77 K预冷的低温恒温器样品架2 (图4，用于CRG-FAME-UHD光束线）。此步骤应尽快完成，但可能需要几分钟。然后将样品架转移至低温恒温器中，并在整个XAS分析过程中保持在10 K。 
		注意：步骤 1.9.3 和 1.9.6 操作难度较大，需迅速完成，以避免产生霜冻，否则会堵塞活塞和模具。替代方法是在完全用氮气吹扫过的塑料帐篷内进行这些操作。液氮2冷却的铜块可使沉淀物保持冷冻状态。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 铁形态分析用浮游生物细胞的制备
注意：本实验方案所用的人工海水是通过向超纯水中添加海盐、吗啉丙磺酸（MOPS）、硝酸铵、硝酸钠、五水合硅酸钠、磷酸二氢钠、维生素储备液、微量元素储备液、抗生素储备液以及 pH = 7.9 的 HEPES 缓冲液配制而成。各组分的浓度详见材料表。有关培养的详细信息可参见 Sutak 等人11。
<ol>
	<li>离心 a P. tricornutum 在50 mL聚丙烯管中培养硅藻，转速为1,100 x g 6 分钟后将沉淀转移至含有新鲜培养基的烧瓶中。</li>
	<li>在培养箱中，将培养物置于合成海水中培养24小时。</li>
	<li>将浮游生物培养物在1,100 x g条件下离心6分钟 g 将沉淀物转移至含有柠檬酸铁（最终培养浓度为1 µM）的新鲜培养基中，孵育72小时。</li>
	<li>制备浮游生物细胞
	<ol>
		<li>离心细胞 3 分钟，1,100 x g g 用不含铁的培养基冲洗。</li>
		<li>将沉淀转移至1.5 mL聚丙烯管中，用超纯水洗涤，然后以1,100 × g离心3分钟，重复两次 g去除上清液。</li>
		<li>将含有沉淀物的1.5 mL聚丙烯管底部浸入液氮中2 如步骤1.8所述。</li>
		<li>将冻存的细胞转移至液氮中2 冷冻压片机并使用XRF压片机快速加压（图3 和 图7如步骤1.9所述。</li>
		<li>去除沉淀物，并将其储存在液氮中2 用于长期储存的容器。</li>
		<li>参照步骤 1.9.6（参见 图4 （用于转移至冷冻切片机样品架）</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 参照化合物的制备与测定
注意：必须制备并分析代表生物系统中可能存在的物种的参考化合物（固体或液体），并通过XAS测定其光谱，以便与实验性生物样品进行比较。参考光谱也可在数据库中获取12,13,14，但前提是测量条件（例如，光谱分辨率）与实验样品相近。
<ol>
	<li>对于水溶液中的参比物质，需在厌氧条件或惰性气氛下称取初始的粉末或液体化合物。在惰性气氛中（例如厌氧手套箱或施伦克线系统）配制对氧化还原敏感的参比物质，参见 图5 和 图6）以避免发生氧化还原反应，并保持该化合物的化学完整性（该化合物在环境空气中可能具有高反应性和不稳定性）。所有硒标准溶液均使用施伦克线（Schlenk line）制备，并使用脱气的超纯水（图6）。液体铁III-在常温空气中制备了苹果酸和铁蛋白。</li>
	<li>用适当的溶液混合，使所研究元素（如硒或铁）的终浓度达到1%（重量比），用于荧光模式检测。 
	注意：超纯水是制备XAS参比样品最常用的溶液。对于采用标准XAS荧光模式测量的液体样品，需添加甘油（15%–20%），以防止冰晶产生X射线衍射伪影，并保持固态探测器采集的XAS信号质量。&#160;然而，对于高分辨率荧光检测X射线吸收光谱（HERFD-XAS），甘油并非必需。使用晶体分析光谱仪替代固态探测器，可实现极高能量分辨率的选择，且冰晶产生的衍射不会影响目标元素的数据采集。1.</li>
	<li>将配制好的溶液保存并储存在密封的施伦克瓶（Schlenk balloon）中图5或置于1.5 mL聚丙烯管中，与样品在相同条件下保存直至检测。</li>
	<li>对于固体参比样品，可在空气中称量硒或铁的标准化合物粉末；若该物质对氧化还原敏感，则应在手套箱中进行称量。此处，固体 FeII 参考文献（FeII-乙酸盐和蓝铁矿）在气态N₂环境下制备2 手套箱，同时进行铁III (Fe(OH)3，和 FeIII在常温空气中制备了磷酸盐。</li>
	<li>称取高纯度氮化硼粉末，并与模型化合物粉末混合，使所研究元素的最终浓度达到1%（质量分数）（图7A).</li>
	<li>使用研钵研磨至少15分钟，直至形成细粉。</li>
	<li>将粉末混合物放入模具中，使用液压机压片制备颗粒图7B，类似于 图3A （用于样品沉淀）</li>
	<li>用活塞闭合模具图7C，类似于 图3B （用于样品沉淀）</li>
	<li>压紧以获得大量沉淀物（图7D，类似于 图3C （用于样品沉淀）</li>
	<li>将制备好的块体样品储存在手套箱中，直至在与样品相同的条件下进行分析。 
	注意：大量样品颗粒有时会粘附在活塞上，具体取决于粉末的压实程度，例如。此时若不破坏样品而将其轻轻取出可能会很困难。在这种情况下，必须采用以下使用聚酰亚胺（例如 Kapton）圆片的方法。</li>
	<li>在将与粉末接触的活塞两侧各滴加一滴乙醇图8A).</li>
	<li>准备两个直径略小于活塞的聚酰亚胺圆盘。聚酰亚胺的厚度应为10–25 µm（过薄则难以操作，过厚则在分析过程中会吸收过多X射线光子）。</li>
	<li>将圆盘置于活塞上，它们会通过毛细作用力粘附在上面（图8B).</li>
	<li>安装模具与活塞，加入粉末，再放入第二个活塞图8C).</li>
	<li>按压（参见步骤 3.11），并将压缩后的块状沉淀物从活塞上取下。 
	注意：固体参比样品可像待测样品一样安装在冷冻切片机专用的样品架上（参见步骤1.8.6）。液体参比样品也可安装在冷冻切片机专用的样品架上。参见 图9A 用于CRG-FAME冷冻切片机样品架。相同的步骤也可应用于图中所示的CRG-FAME-UHD样品架， 图4D，采用以下步骤。</li>
	<li>将液体参照物固定在冷冻切片机样品架上。
	<ol>
		<li>在室温下，将聚酰亚胺（如 Kapton）胶带（25 µm 厚）贴于样品 holder 上以密封孔的一侧图9B).</li>
		<li>使用注射器将溶液缓慢注入腔体，直至液面到达顶部，避免产生气泡。储液腔必须注满（图9C，左侧。</li>
		<li>用胶带密封腔体的另一侧（图9C，右侧。</li>
		<li>将密封的样品架浸入液氮中2 (图9D，T0–T3).</li>
		<li>热反应诱导LN2 冒泡。等待气泡停止，表明反应结束（图9D，T3–T5).</li>
		<li>将样品架在77 K下转移至光束线的低温恒温器中，然后开始数据采集（图9D，T6）或在液氮中保存2 Dewar 
		注意：冷冻溶液在空腔内充分铺展，形成均匀且均一的沉淀颗粒（图9D，T7).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 高分辨率荧光检测X射线吸收光谱（HERFD-XAS）：测量步骤
<ol>
	<li>使用浓缩的参考化合物，在布拉格条件下对CAS中的所有晶体进行优化，以匹配目标荧光谱线能量。</li>
	<li>使用已知吸收边能量位置的参考物质（通常为纯金属箔）校准入射单色光束能量。该参考物质可在样品之后的第二步中放置，采用双透射模式，以便能够对每条获得的光谱进行校准检查，并在后期处理中对其进行能量对齐。</li>
	<li>按照步骤1.9.6中描述的适当程序，将生物样品置于液氦低温恒温器中。</li>
	<li>根据同步辐射安全规程关闭实验屏蔽舱。</li>
	<li>在覆盖所选吸收边的能量范围内进行XAS数据采集。</li>
	<li>每次光谱采集后，将样品在运动方向上至少移动两倍于光束尺寸的距离，再开始下一次采集。 
	注意：本实验中，使用Ge(440)晶体选择Fe Ka1谱线，使用Ge(844)晶体选择Se Ka1谱线。样品上的光束尺寸为200 × 100 µm²（H × V，半高全宽）。每次采集之间，样品在两个方向上均移动500 µm，以探测结构的均匀性，并确保每次分析的区域均未受到先前可能的辐射损伤影响。若各单次光谱在噪声范围内可重叠，则将其进行比对并合并。当某一特定样品的合并光谱质量达到要求时，即停止测量。随后可使用任何专用于XAS分析的软件进行数据分析，尤其是支持归一化光谱线性组合拟合的软件，例如Athena和Artemis（Demeter软件组）15、SixPack16或Viper17。完整的XAS分析方法超出了本实验方案的范围，可在近期发表的文献中找到详细说明18,19，其中部分文献特别针对生物样品20。硒XANES参考光谱已收录于SSHADE光谱数据库中21。</li>
</ol>

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<li>Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples.+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+Atomic+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial.</a> Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).</li>
<li>Bissardon, C., Bohic, S., Proux, O. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001">https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001</a> (2019).</li>
<li>George, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray-induced+photo-chemistry+and+X-ray+absorption+spectroscopy+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).</li>
</ol>

作者无利益冲突。

本方案通过X射线吸收光谱法研究生物样品中硒和铁的化学形态。重点介绍生物样品及参比化合物的冷冻制备与储存，以及高能量分辨率荧光检测X射线吸收光谱（HERFD-XAS）测量。
冷冻制备与保存 
对大体积生物样品颗粒进行冷冻制备，可有效保存样品中各类化学组分的完整性。这一点至关重要，因为在样品制备过程中若采用冷冻干燥或空气干燥方法，已观察到化学形态发生变化6。当所选用于测量的光束线配备了氦气低温恒温器后，应立即采用本方案。
对于参比化合物，当使用对氧化还原敏感的元素时，必须在无氧气氛中操作，以保持其氧化态。随后可通过谱图边缘位置的变化来验证，如二价和三价铁参比化合物所示（图11）。
此样品制备可在同步辐射或实验室分析之前进行。在此情况下，应将冷冻沉淀物或参照样品转移至冻存管中，并储存在液氮中2 罐。该LN<...

对必需或有毒元素的细胞生物转化过程的研究需要高灵敏度的形态分析技术，并应尽量减少样品前处理步骤，因为这些步骤往往容易导致化学形态的改变。
硒和铁等生理元素由于其复杂的化学性质、不同硒或铁物种的稳定性差异，以及在样品中极低的浓度（ppm（mg/kg）甚至低于ppm水平），通常难以进行形态分析。因此，利用X射线吸收谱（XAS）研究这些元素的形态具有极大挑战性。在同步辐射光源上，可采用同步辐射XAS技术，尤其是高能量分辨率荧光检测XAS（HERFD-XAS），后者能够实现极低的信号与背景比1，从而对复杂生物基质中高度稀释的元素进行形态分析2,3。常规荧光XAS测量可在欧洲同步辐射装置（ESRF）的CRG-FAME光束线上，使用能量分辨的固态探测器（SSD）进行，其能量带宽约为150–250 eV4；而HERFD-XAS测量则需在ESRF的CRG-FAME-UHD光束线上，采用晶体分析谱仪（CAS），其能量带宽约为1–3 eV2。两种方法分别通过电子或光学过程，根据荧光光子的能量对其进行分辨。
样品的冷冻制备对于保持结构完整性及化学组成的原始状态至关重要，从而使得分析能够接近生物体的天然状态5。此外，在低温条件下（低至10 K）使用液氦冷却（LN2）进行分析，可显著减缓辐射损伤，从而在X射线吸收光谱（XAS）分析中保持元素的化学种态。尽管已有部分关于XAS技术在生物样品中应用的综述指出，样品需在低温条件下制备和分析（例如Sarret等6，Porcaro等7），但均未明确描述相关的详细实验方案。本文介绍了一种用于癌细胞和浮游微生物低温制备的方法，以实现硒（Se8）和铁（Fe9）在低温条件下的高分辨率荧光检测X射线吸收光谱（HERFD-XAS）种态分析。
在先进的XAS光谱测量中，样品制备和环境控制的良好实践需要满足以下三点：1）实验装置；2）分析流程应尽可能限制辐射损伤的影响；3）样品（或模型化合物参比物）在X射线光子束尺寸范围内应尽可能均一。第一点通过在低温下进行数据采集来实现，使用液氦恒温器完成。第二点通过每次在样品的新区域进行采集来实现，即相对于光束移动样品位置。最后，针对第三点要求，将样品（压片）和参比物（粉末）均制备成压制成型的块状压片，以尽可能减少孔隙和不均匀性，并避免X射线探测样品表面相对于光束尺寸出现表面粗糙。本文将详细说明该实验方案如何解决上述所有问题。
我们采用人前列腺癌细胞系PC-3（高转移潜能）和卵巢癌细胞系OVCAR-3（占所有卵巢癌病例的70%）来研究硒纳米颗粒（Se-NPs）对癌细胞的抗增殖特性，并以硅藻Phaeodactylum tricornutum作为模式物种，研究浮游植物中的铁螯合现象。

<table><tbody><tr><td>硝酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3795</td><td>NH4NO3，溶于milliQ水，浓度为2.66 mg/L</td></tr><tr><td>厌氧培养箱</td><td>Coy Laboratory, USA</td><td></td><td>配备厌氧监测仪（CAM-12）</td></tr><tr><td>抗生素储备液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166（氨苄青霉素），S9137（硫酸链霉素）</td><td>溶于milliQ水，浓度为1 mL/L（氨苄青霉素钠和硫酸链霉素，100 mg/mL）</td></tr><tr><td>氮化硼粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255475</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td></td><td></td><td>Neubauer 或 Malassez</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>GIBCO</td><td>14190-094</td><td>不含钙、镁和酚红</td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td></td><td></td><td>0.5 mL 和 1.5 mL</td></tr><tr><td>Falcon 管</td><td></td><td></td><td>15 mL 和 50 mL</td></tr><tr><td>柠檬酸铁（Fe/柠檬酸 = 1/20）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3388</td><td>FeCl3 50 mM 和柠檬酸钠 1 M 的水溶液，pH 6.5</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>GIBCO</td><td>A31604-02</td><td>性能增强型，经认证的 One Shot 规格，源自美国</td></tr><tr><td>培养瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503</td><td>TPP，表面积 150 cm²</td></tr><tr><td>生长培养箱</td><td>Sanyo</td><td>Sanyo MLR-352</td><td>20&amp;deg;C，12:12 光照（3,000 lux）暗周期</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>HEPES 溶于 milliQ 水，浓度为 1 g/L</td></tr><tr><td>高级别浆液性卵巢癌细胞系 OVCAR-3</td><td>ATCC, Rockville, MD</td><td>HTB-161</td><td>储存温度：液氮蒸气相温度</td></tr><tr><td>培养箱</td><td></td><td></td><td>37&amp;deg;C，加湿环境，含 5% CO2</td></tr><tr><td>牛胰腺胰岛素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td>胰岛素 10 mg/mL 溶于 25 mM HEPES（pH 8.2），BioReagent 级，经无菌过滤，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>手动液压机</td><td>Specac, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>海洋硅藻 Phaeodactylum tricornutum</td><td>Roscoff 培养物保藏中心</td><td>RCC69</td><td>http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69</td></tr><tr><td>吗啉代丙磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3183</td><td>MOPS，溶于 milliQ 水，浓度为 250 mg/L（pH 7.3）</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>前列腺癌细胞系 PC-3</td><td>ECCAC, Salisbury, UK</td><td>90112714</td><td>储存温度：液氮蒸气相温度</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>稳定化溶液，含 10,000 单位青霉素和 10 mg 链霉素/mL，经无菌过滤，BioReagent 级，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>移液器辅助器（Pipette-boy）</td><td></td><td></td><td>25 mL、10 mL 和 5 mL 无菌塑料移液管</td></tr><tr><td>浮游生物培养基 Mf：海水盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9883</td><td>40 g/L 的 milliQ 水。成分：Cl⁻ 19.29 g，Na⁺ 10.78 g，SO₄²⁻ 2.66 g，Mg²⁺ 1.32 g，K⁺ 420 mg，Ca²⁺ 400 mg，CO₃²⁻/HCO₃⁻ 200 mg，Sr²⁺ 8.8 mg，BO₂⁻ 5.6 mg，Br⁻ 56 mg，I⁻ 0.24 mg，Li⁺ 0.3 mg，F⁻ 1 mg</td></tr><tr><td>塑料镊子</td><td>Oxford Instrument</td><td>AGT 5230</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（ATCC 改良型）</td><td>GIBCO</td><td>A10491-01</td><td>含 4.5 g/L D-葡萄糖、1.5 g/L 碳酸氢钠、110 mg/L（1 mM）丙酮酸钠、2.388 g/L（10 mM）HEPES 缓冲液和 300 mg/L L-谷氨酰胺的溶液，仅供科研使用</td></tr><tr><td>硒纳米颗粒（Se-NPs），牛血清白蛋白（BSA）包被，2 mg/mL</td><td>NANOCS Company, USA</td><td>Se50-BS-1</td><td>BSA 稳定的 Se-NPs 溶液。平均粒径约 30 nm。4&amp;deg;C 避光保存。</td></tr><tr><td>硒纳米颗粒（Se-NPs），壳聚糖包被，2 mg/mL</td><td>NANOCS Company, USA</td><td>11. Se50-CS-1</td><td>壳聚糖稳定的 Se-NPs 溶液。平均粒径约 30 nm。4&amp;deg;C 避光保存。</td></tr><tr><td>五水合硅酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71746</td><td>Na2SiO3·5H2O，溶于 milliQ 水，浓度为 22.8 mg/L</td></tr><tr><td>硝酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5022</td><td>NaNO3，溶于 milliQ 水，浓度为 75 mg/L</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5011</td><td>NaH2PO4，溶于 milliQ 水，浓度为 15 mg/L</td></tr><tr><td>T-75 培养瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织培养超净台</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量元素储备液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857</td><td>1 mL/L 的 milliQ 水（MnCl2·4H2O 200 mg/L，ZnSO4·7H2O 40 mg/L，Na2MoO4·2H2O 20 mg/L，CoCl2·6H2O 14 mg/L，Na3VO4·nH2O 10 mg/L，NiCl2 10 mg/L，H2SeO3 10 mg/L）</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液（0.4%）</td><td>GIBCO</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红</td><td>GIBCO</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>维生素储备液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270（硫胺素），B4639（生物素），V6629（维生素B12）</td><td>1 mL/L 的 milliQ 水（盐酸硫胺素 20 mg/L，生物素 1 mg/L，维生素B12 1 mg/L）</td></tr><tr><td>37&amp;deg;C 水浴</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用高分辨率x射线吸收光谱法在低温条件下进行物种分析的生物样品制备

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

利用X射线吸收光谱法（XAS）研究元素在生物系统中金属的作用具有重要意义。样品制备是其中关键且通常较为复杂的步骤，尤其对于生物样品而言更是如此。尽管X射线形态分析技术已被广泛应用，但目前尚未向该技术的使用者发布详细的实验方案。此外，化学状态的改变是一个需要关注的问题，建议采用基于冷冻的技术，以接近天然水合状态分析生物样品，从而最大程度地保持细胞或组织的化学完整性。本文提出了一种基于冷冻保存样品的细胞制备方案，并将其应用于癌细胞中硒的高能量分辨率荧光检测X射线吸收光谱研究，以及浮游植物中铁的研究。该方案也可用于其他生物样品以及其他易受辐照损伤的X射线技术。

这些制备的主要目的是研究硒纳米颗粒（Se-NPs）与癌细胞之间的相互作用，以及浮游植物中铁的结合与隔离。
初始状态（BSA Se-NPs）以及在营养培养基中孵育后的细胞（BSA Se-NPs 经24小时孵育后）中硒的HERFD-XANES谱图如图10所示。结果表明，初始Se-NPs中的硒以Se(0)和类似亚硒酸盐的形式存在，而在与PC-3细胞相互作用后，细胞内的硒主要以Se(0)形式存在，表明细胞内硒的物种发生了变化。对于铁元素，参考样品的HERFD-XANES谱图显示出明显的边位置差异，取决于铁的氧化态，其中还原态铁物种的边位置向低能量方向偏移（图11）。在同一硅藻颗粒位置连续采集的两条谱图相似，表明在10 K的氦低温恒温器条件下进行两次采集时，光束损伤有限。此外，从硅藻颗粒不同位置（此处为三个位置）获得的谱图完全一致，说明样品颗粒具有均一性，因此可将谱图进行平均以获得信噪比更高的谱图（平均谱图）。硅藻的平均谱图显示其...

本方案介绍了一种用于同步辐射X射线吸收光谱实验的生物冷冻样品制备的详细步骤。我们描述了优化样品制备和冷冻保存所需的所有步骤，并以癌细胞和浮游植物细胞为例展示了该方案的应用。该方法为生物样品的冷冻制备提供了通用标准。

使用高分辨率X射线吸收光谱法在低温条件下进行物种分析的生物样品制备

利用X射线吸收光谱法（XAS）研究元素在生物系统中金属作用具有重要意义。样品……

该方案已针对细胞样本进行了标准化，可实现不同同步辐射光源地点之间实验结果的比较。该技术的主要优势在于其简单直接的工作流程，能够快速且可靠地保存样本的化学完整性。初次使用该技术的研究人员可能在冷冻反复离心获得的细胞沉淀以及快速将细胞沉淀装入冷冻样品架的过程中遇到困难。在低温条件下精确且快速地分离样品至关重要。因此，直观的演示对于理解该技术的操作方法必不可少。为进行硒形态分析而制备人前列腺癌和卵巢癌细胞系的细胞沉淀时，需在超净台中将每种细胞系适当数量的细胞分别接种至每种条件下三个T-75培养瓶中，加入合适的细胞培养基，随后将培养瓶置于37°C、5% CO₂的细胞培养孵箱中，直至细胞融合度达到80%。为了使癌细胞接受硒处理，首先将新配制的纳米颗粒储备液在室温下置于超声水浴中震荡30分钟，随后用完全细胞培养基将硒纳米颗粒溶液连续稀释至适当的工作浓度。在超净工作台内，用5毫升37摄氏度的PBS轻柔洗涤细胞两次，每次洗涤后弃去液体，并使用无菌的25毫升移液管将15毫升目标硒处理溶液小心地沿培养瓶底部加入。盖上瓶盖但不要完全密封，然后将培养瓶水平放置于细胞培养箱中孵育24小时。在洗涤并更换培养基后，准备细胞沉淀时，每个培养瓶使用一把细胞刮棒轻轻刮下细胞。用培养基冲洗粘附在培养瓶上的细胞，使其进入上清液，并通过离心收集解离的细胞。每次洗涤时，每管用五毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞沉淀两次，以彻底去除残留的处理试剂，最后将细胞重悬于一毫升 PBS 中。将细胞转移至1.5毫升聚丙烯管中，通过另一次离心收集细胞。然后使用200微升移液器轻轻吸除所有上清液，并将每个1.5毫升管的底部浸入液氮中，直至与细胞沉淀物齐平。细胞冻结后立即转移至液氮杜瓦瓶中进行长期保存。对于高分辨率X射线吸收光谱分析，需将晶体分析光谱仪中的所有晶体针对目标荧光线能量在布拉格条件下进行优化，并使用已知吸收边能量位置的参考物质对入射单色光束能量进行校准。将样品架转移至液氦低温恒温器中用于生物样品，并将低温恒温器设定为10开尔文，随后依照同步辐射安全规程关闭实验屏蔽舱，开始分析。此处展示的硒在初始状态以及在营养培养基中孵育后的细胞中的代表性高分辨率X射线吸收光谱表明，初始硒纳米颗粒中的硒以零价硒和类纤维素形态同时存在。然而，在与 PC3 细胞相互作用后，硒主要以零价硒的形式存在于细胞内，表明细胞内的硒形态发生了变化。对于铁元素，高分辨率 X 射线吸收光谱参考谱图根据铁的氧化态表现出明显的边位置差异，还原态铁物种的谱边向低能量方向偏移。在硅藻沉淀物的同一位置连续采集的两条光谱相似，表明使用 10 开尔文氦气低温恒温器时，两次采集之间的光束损伤有限。此外，来自硅藻沉淀物不同位置的光谱完全相同，表明样品压片具有均一性，且光谱可进行平均处理以获得信噪比更优的光谱。最关键的步骤包括纳米颗粒稀释液的制备、低温条件下的离心沉淀，以及标准参比样品的制备。该方法可应用于其他体相分析技术，例如电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS），或其他可在低温条件下实施的非同步辐射光谱技术。该实验方法还可用于探索其他科学问题，特别是在生物地质学、生物化学、环境科学或毒理学研究领域。硒化合物和硒纳米颗粒可能对健康有害，操作时应使用手套、护目镜和面罩，并在专用的化学通风橱中进行。

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化学

使用高分辨率X射线吸收光谱在低温下制备生物样品以进行形态分析

冷冻电子显微镜，包括扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM），广泛用于含水量较高的生物样品或其他材料的表征1。利用扫描电镜/聚焦离子束（FIB）可识别样品中感兴趣的结构特征，并切割出一片薄而电子束可穿透的薄片，用于转移至冷冻透射电镜中进行进一步分析。...

利用聚焦离子束制备冷冻电子显微镜样品

本文介绍了一种结合两种样品处理技术的实验方案：高压冷冻与微波辅助样品处理，随后进行极小树脂包埋，以用于聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）获取数据。本方法以小鼠胫神经样品和Caenorhabditis...

高压冷冻、微波辅助对比度增强及最小树脂包埋的生物样本制备用于体积成像

本文介绍了一种在氮化硅膜上进行细胞培养，并在利用同步辐射低温X射线纳米探针进行X射线荧光成像前进行...

在氮化硅膜上进行细胞培养及用于同步辐射X射线荧光纳米分析的低温制样

本文介绍了一种将冷冻样品低温转移至动态核极化（DNP）魔角旋转（MAS）核磁共振（NMR）探头的实验方案。该方案包括实验前转子的储存方法，以及实验前后样品活性检测的操作步骤。...

将低温样品装入魔角旋转核磁共振波谱仪并保持细胞活性的方法

本文介绍了一种用于冷冻软X射线断层成像（SXT）的实验方案，该方案描述了对完整冷冻保存的细胞进行超微结构成像所需的样品制备和数据采集步骤，成像分辨率达到25...

通过低温软X射线断层扫描对细胞进行三维制图描述

我们描述了一种利用水稻（Oryza sativa...

一种用于保存湿地植物根系及根际环境以进行元素成像的方法

本实验方案展示了如何利用冷冻结构光照明显微镜对生物冷冻保存样品进行成像。我们通过成像U2OS细胞的细胞骨架来演示该方法。...

冷冻保存细胞的冷冻结构光照显微镜数据采集

本文介绍了一种用于在 Diamond Light Source 的 I23 光束线上进行长波长大分子 X...

样品制备与转移方案：在 Diamond Light Source 同步辐射光源 I23 光束线上进行真空内长波长晶体学实验

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该方法提供了一种简便且灵活的电镜（EM）载网制备方案，适用于 原位...

样品制备 原位 哺乳动物细胞的冷冻断层扫描技术

优化冷冻电子显微镜样品制备

学习低温生物样品制备方法，用于同步辐射X射线吸收光谱的形态分析。本方案以人前列腺和卵巢癌细胞为例，建立标准化冷冻保存流程，确保样品化学完整性，适用于不同同步辐射实验地点的可重复研究。

使用高分辨率X射线吸收光谱法在低温条件下进行物种分析的生物样品制备

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