研究原发性胚胎小鼠中脑多巴胺神经元中预制纤维诱导β-合成素积累

在这里，我们提出了一个详细的协议，研究神经元+-合成素积累在原发性小鼠多巴胺神经元。神经元中的磷酸化β-合成素聚合体通过预制的β-合成素纤维诱导。免疫荧光标记细胞的自动成像和无偏图像分析使这个强大的协议适用于抑制β-合成素积累的药物的中高通量筛选。

该协议提供了一个健壮的，可重复的模型的阿尔法合成素积累在初级多巴胺神经元研究机制和治疗，可能调节这种积累。预制的α-核素纤维素诱导渐进的、高度可重复的蛋白质积累，结合自动成像和无偏图像分析，该协议有助于对α-核素积累抑制卡车进行相对快速、中到高通量筛选。渐进性α-核素积累可能是影响帕金森病和某些核体神经元功能的因素之一。

阻断这种积累的新分子可能成为神经退化的新疗法。我们认为，该协议是建立一个标准可靠的工具，研究分子机制调节多巴胺神经元的α-核素积累的重要步骤。演示这个程序的将是朱莉娅·科诺瓦洛娃，一个博士学生从我的实验室。

在建立初级胚胎中脑细胞培养体之前，在聚-L-Ornithine 涂层 96 井板的每个孔中加入 50 微升多巴胺（神经元介质），并使用 100 微升移液器尖端吸气介质，同时以圆形方向划伤每孔底部，以去除每个孔周围的涂层。一个多L-奥尼辛涂层岛将保留在每一个井的中间。在每个涂布岛屿的中间添加 10 微升介质，以创建微岛屿。

建立原发性胚胎中脑培养从小鼠胚胎13.5小鼠胚胎。将所有收获的中脑地板池入同一个1.5毫升管中，每次洗涤时用500微升钙和镁洗涤样品三次。上次洗涤后，用0.5%的三辛代替HPSS，在37摄氏度下孵育30分钟。

在孵化结束时，在FBS溶液中加入500微升新准备的DNase I溶液，并使用硅化玻璃移液器与火抛光尖端三角组织。当只能观察到微小的，几乎看不见的颗粒，让这些组织碎片定居到微型离心管的底部，并转移这个上清液到一个空的15毫升圆锥形聚丙烯管。将一毫升的HSS添加到FBS中含有DNase I的管子中，通过移液混合多次。

将溶液的一毫升转移到剩余的组织颗粒中，然后再次对样品进行三化。然后用上流剂管拉消化的细胞悬浮液，无需转移任何剩余的组织片段，再将组织样本与HSS中剩余的DNase I和FBS混合一次，通过离心沉淀收集的细胞，吸气上能剂，而不会干扰颗粒。每次洗涤两毫升加热多巴胺神经元介质中洗两次细胞。

并在微离心管中以每6微升新鲜温暖、中等浓度的力细胞以3倍10重新作用。接下来，从每个先前准备的微岛中去除介质，在使用 10 微升移液器向每个微岛添加 6 微升细胞之前，先将细胞与温和移液混合。添加所有细胞后，用 150 微升水或 PBS 填充板边缘的空井，并在细胞培养箱中放置板一小时。

在孵化结束时，将100微升的新鲜多巴胺神经元培养剂添加到每井，并将板返回孵化器。在第8天，在层流罩中的细胞培养以3.75微升（每毫升100微克）的预制纤维添加到每口实验井，并将3.75微升PBS添加到每个控制井中。使用 PFS 时，请谨慎注意不需要的蛋白质污染，然后用 1%SDS 和 70% 乙醇清洁发动机罩和所有 PF 相关仪器。

在适当的实验端点染色后，将96井培养板加载到装有10 X目标的高含量板扫描仪上。根据 96 孔板的规格调整设置，如打孔类型、制造商、尺寸、井间距离以及介质的类型和体积。选择孔的成像区域以覆盖每个微岛的所有细胞，并使用一个孔调整 DAPI 表达式上的自动聚焦。

根据控制井中染色的强度校准每个荧光通道的采集时间，并调整参数，使预造纤维处理控制井中的多巴胺细胞在细胞索马内含有磷素 129 alpha 合成素聚合物，从而清楚地区分，从而明确量化磷素 129 alpha 合成素阳性和负细胞。然后，使用完全相同的参数在所有通道中同时成像所有选定油井。要分析图像，请打开 CellProfiler 分析师并选择V2_THpos。

属性文件。要将分段细胞分段到磷素129 alpha合成素阳性和负细胞，首先将提取细胞的数量设置为50个随机细胞，然后单击提取以加载分段细胞的图像。将至少 30 个单元格拖入窗口底部的相应条柱中。

选择使用快速温和提升与 50 最大规则或随机林分类器，然后单击列车。将提取设置为 50 个阳性细胞，然后单击提取以获取示例正磷素 129 alpha 合成素细胞，根据列车分类器评分，或将提取设置为 50 个负细胞，然后单击提取以根据列车分类器获取负磷素 129 alpha 合成素细胞示例。当结果令人满意时，单击所有分数以生成结果表，汇总每个井中磷素 129 alpha 合成素阳性和负多巴胺神经元的数量。

电镀几天后，通过电镀前创建的微岛内的光显微镜可以观察到均匀传播的文化。原神经元均匀地稳定在涂层板底部并建立神经元投影。在此图像中，可以观察到直径小于 150 微米的小团。

在电镀后15天，对控制未治疗的原发小鼠中脑培养物的免疫染色显示，在板井中间的微岛内的细胞受到限制。多巴胺神经元免疫标记与酪氨酸羟基酶标记分布在微岛周围，在一个单层彼此分离，没有任何块。在α-核素预制纤维治疗培养物中，也可以观察到pS129α核素阳性内含物。

与其他实验组相比，体外预制纤维治疗7天不会导致酪氨酸羟基酶阳性神经元数显著减少。然而，用胶质细胞系衍生神经营养因子治疗，降低pS129α-核素阳性内含百分比，含有酪氨酸羟基酶阳性多巴胺神经元。在创建微岛之前，请确保聚-L 地氨酸涂层井已牢固清洗。

在电镀新的大脑文化时，请务必使用新媒体。该方法可与基因编辑和药理抑制剂相结合，研究特定基因和思想波对核子聚集的影响。我们经常使用这种方法来筛选抑制α核素积累的新分子。

证明了TDN的积累保护效果，目前对几个小候选分子进行了分析。