Name: 研究原发性胚胎小鼠中脑多巴胺神经元中预制纤维诱导β-合成素积累 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 了解利用预制纤维诱导α-突触核蛋白聚集的小鼠原代多巴胺神经元模型。该方案结合自动化成像与无偏倚分析，适用于中高通量筛选抑制蛋白积累的药物候选分子，助力帕金森病神经退行性机制研究。

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我们感谢Kelvin Luk教授慷慨提供α-突触核蛋白PFFs，感谢Conjung Zheng建立和培养神经元细胞，以及赫尔辛基大学生物技术研究所光学显微镜单元在免疫染色细胞成像方面的支持。本工作获得了芬兰商业芬兰（芬兰创新资助机构）3i-再生项目、芬兰科学院（项目编号#309489、#293392、#319195）、Sigrid Juselius基金会，以及波兰科学院Maj药理学研究所法定资金的资助。

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作者无任何利益冲突需要披露。

路易体病理的扩散是帕金森病（PD）的组织病理学特征之一，其中磷酸化丝氨酸129位点的α-突触核蛋白（pS129-αsyn）是其主要成分。抑制或减缓聚集态pS129-αsyn的积累，可能有助于延缓多巴胺能神经元的变性及α-突触核蛋白病的进展。然而，pS129-αsyn聚集导致多巴胺能神经元死亡的具体机制仍有待阐明。来自不同疾病阶段患者脑组织尸检研究的证据，以及在移植的胎儿神经元中观察到pS129-αsyn阳性包涵体的现象，强烈提示路易体病理可在细胞间传播16,17,33。因此，近期研究已利用α-突触核蛋白预制纤维（PFFs）成功模拟了pS129-αsyn的朊病毒样传播过程9,10。建立一种在多巴胺能神经元中稳定、经济且具有相对高通量或中通量的pS129-αsyn传播与积累模型，将显著加快针对该过程的新型治疗手段和化合物的筛选进程。
由于多巴胺能神经元的丢失是帕金森病（PD）运动症状的主要原因，且这些细胞具有多种独特特性2,34,35，因此从转化医学的角度来看，建立pS129-αsyn在多巴胺能神经元中类朊病毒样扩散的模型是最具相关性的模型类型。此前已有研究描述了利用胚胎中脑神经元在4孔板上构建微岛培养体系并结合半自动定量分析的实验方案18。本文所述方案已适配至96孔板，微岛制备更为简便，经验丰富的研究人员可在一天工作时间内完成最多四块、每块含60个孔的培养板的制备。在96孔板中培养多巴胺能神经元可减少药物用量，同时实现慢病毒载体的高效转导。此外，还可联合不同处理方式，开展更为复杂的实验研究。
在施加任何处理（包括PFFs）之前，应使用明场显微镜检查培养质量。如果显微镜系统未配备带加热功能的CO2培养舱，细胞在培养箱外停留的时间不应超过几分钟，因为原代小鼠多巴胺能神经元较为脆弱，易受应激影响。基于相同原因，建议首次成像在接种后24小时（DIV1至DIV3之间）进行。细胞应呈现存活状态，具有清晰的胞体，并在微岛内均匀分布。原代神经元应已贴附于多聚鸟氨酸（PO）包被的表面，并开始形成神经突起。若消化吹打过程操作不当或接种密度过高，可能出现小团细胞聚集（即直径小于150–200 μm）。除非每孔中存在多个和/或较大团块，否则这些小团块通常不会影响实验结果。然而，细胞聚集会显著增加图像分析过程中识别免疫组织化学标记物及单个细胞的难度。因此，必须通过仔细的包被、吹打操作以及控制接种密度来避免此类团块的形成。若某些孔中无法观察到上述条件的均一性，则不应将这些存在缺陷的孔纳入实验。此类排除操作应在实施任何处理前完成。&#160;
此外，使用96孔板可在染色过程中方便地使用多通道移液器，并可通过自动板式显微镜直接观察，进一步提高通量。自动图像定量分析对于高内涵成像平台的数据分析至关重要。除了能够处理每次实验获得的数千张图像外，它还能对所有处理组进行无偏倚、一致的定量分析。所提出的图像分析工作流程基于以下简单原则：对多巴胺能神经元进行分割，通过有监督的机器学习筛选正确分割的细胞，随后再次利用有监督的机器学习对表型（pS129-αsyn阳性与pS129-αsyn阴性）进行定量分析。尽管该任务可设想采用多种不同方法，但我们发现，由于多巴胺能神经元培养密度高、细胞形态多样以及存在强染色的神经突，结合分割与机器学习的方法在多巴胺能神经元培养中最为稳健。所提出的图像分析算法已在CellProfiler和CellProfiler Analyst中实现，二者为开源、免费的高内涵图像分析软件26,27。该算法也可在其他图像分析软件中实现，无论是开源软件（如ImageJ/FIJI、KNIME）还是商业软件。然而，根据我们的经验，这些软件通常为了使用便捷而牺牲了自定义能力，因此在复杂分析中可能表现不佳。我们发现，CellProfiler和CellProfiler Analyst软件包结合了大量内置算法、极高的工作流程设计灵活性，以及对高内涵成像数据的并行高效处理能力，能够提供特别可靠的结果。
所述方案也可适用于其他通过不同抗体免疫染色鉴定的细胞表型的定量分析，例如其他神经元群体的标志物（如 DAT、GAD67、5-HT 等）以及蛋白质聚集体（如磷酸化 Tau、泛素）。也可联合使用多种荧光标记物以区分多种表型（例如处于不同成熟阶段的包涵体细胞）。通过在测量步骤中增加包含额外标志物免疫荧光图像的通道，并将细胞分入多个类别，即可在所述图像分析流程中轻松实现多种表型的自动化分类。然而，同时使用多种标记物需要优化免疫染色和成像条件。此外，为了获得更高质量的免疫荧光成像效果，建议使用专为荧光显微镜设计的特殊黑色壁 96 孔板。但这类耗材的成本明显高于标准细胞培养板，而后者已足以满足本方案中所述分析的需求。
所使用的PFFs的类型和质量对实验结果至关重要。PFFs既可能影响检测的稳健性，也可能影响结果的解释。制备条件可能会影响PFFs的接种效率，事实上已有报道指出具有不同生理特性的PFF &#34;株系&#34;的存在36。然而，PFFs的制备与验证超出了本文的范围，相关方法已在多篇文献中详细描述11,28,29,30。除了制备方案外，还需根据具体的实验条件，考虑PFFs中α-突触核蛋白的来源物种（例如小鼠、人源）以及使用野生型或突变型蛋白（例如人源A53T α-突触核蛋白）。研究表明，PFFs诱导pS129-αsyn聚集的程度依赖于培养物的年龄（即体外培养天数），更成熟的培养物表现出更显著的诱导效应11。这可能是由于更成熟的培养物中神经元连接数量增加，以及α-突触核蛋白表达水平升高所致。在我们的实验中，于DIV8（体外培养第8天）进行PFF处理可获得最稳健的结果，此时多巴胺能神经元胞体中pS129-αsyn的聚集显著，且未影响神经元存活。本方案非常适合研究干预内源性α-突触核蛋白聚集早期事件的治疗方法，因为我们是在接种PFFs后相对较早的时间点（7天）定量分析pS129-αsyn阳性包涵体。在此时间点，大量细胞中已出现胞内包涵体，可通过免疫染色清晰识别，且尚未观察到由PFF引起的细胞死亡，从而简化了结果的解读。重要的是，由于PFF诱导形成的包涵体在形态和组成上可能随时间发生变化12,13，原则上可通过在更晚的时间点进行固定和免疫染色，对本方案进行调整以研究更成熟的包涵体。然而，将多巴胺能神经元在体外培养超过15天需要极为谨慎的操作，且可能因细胞在未接种PFF的情况下无法存活而引入额外变异。此外，长期培养也会使药物处理方案更加复杂。许多化合物在细胞培养基中的稳定性有限或尚未被充分表征，且药物补充并非易事，因为完全更换培养基会损害多巴胺能神经元的存活。
在基于PFF的α-突触核蛋白聚集模型中，Ser129位点的磷酸化现象被广泛报道，并且与错误折叠和聚集的标志物（如硫黄素S、泛素或构象特异性抗体）共定位11,12。在我们的实验中，pS129-αsyn免疫染色信号最强、背景最低，分析最为简便，在筛选多种处理条件时可获得稳健的结果。重要的是，pS129-αsyn抗体的免疫染色不会检测到仍存在于细胞外的PFFs，从而显著降低背景信号。然而，必须注意的是，Ser129磷酸化可能是与α-突触核蛋白错误折叠相关的最早事件之一，并且在特定条件下可能受到不同的调控。因此，任何显示对pS129-αsyn具有积极作用的结果，均应通过其他标志物加以验证。
统计分析应根据实验设计相应地进行调整。实验至少需要进行三次独立的生物学重复（即独立的原代神经元培养）。这些重复实验应接种在不同的培养板上，并独立处理。我们采用随机区组设计的方差分析（ANOVA）37来分析来自不同培养板的重复实验数据，以考虑不同实验板之间数据的配对关系。&#160;

帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种神经退行性疾病，其特征是中脑黑质（substantia nigra, SN）中的多巴胺能神经元死亡，导致基底神经节多巴胺张力继发性降低，并引发相应的运动功能障碍1,2。PD 患者脑组织的主要组织病理学特征是神经元胞体内出现的细胞内蛋白质/脂质聚集物，称为路易小体（Lewy bodies, LB），或存在于神经突中的路易突（Lewy neurites, LN），统称为路易病理（Lewy pathology）3。脑内的路易病理似乎随着 PD 病情进展而扩展，呈现出类似致病因子通过神经元连接传播的模式。在黑质的多巴胺能神经元以及其他受神经退行性变影响区域的细胞中，均可发现大量的路易病理改变4。然而，在疾病进展过程中，蛋白质聚集的扩散和起始并不总是与神经元死亡相关，路易病理对神经元死亡的确切作用仍不明确5。
LB和LN已被证实由膜性成分和蛋白质成分组成3。前者包括膜碎片、囊泡结构（可能是溶酶体和自噬体）以及线粒体3。后者则包含至少300种不同的蛋白质6。Spillantini等人的一项标志性研究7表明，路易病理的主要蛋白质成分是α-synuclein。α-synuclein在神经元中高表达，与膜融合及神经递质释放相关，在路易病理中主要以错误折叠的淀粉样纤维形式存在，其中大部分在Ser129位点发生磷酸化（pS129-αsyn）4,8。
重要的是，研究还表明，由于具有类朊病毒特性，错误折叠的α-突触核蛋白可能在路易病理的形成中起致病作用4。错误折叠的α-突触核蛋白的类朊病毒特性已在帕金森病患者中脑组织提取物以及体外制备的α-突触核蛋白预形成的纤维（PFFs）中得到证实，这些物质可在体外培养的神经元和活体动物中诱导α-突触核蛋白聚集9,10。PFFs为研究α-突触核蛋白病理在多巴胺能神经元中的进展提供了一个可靠且稳健的模型。当PFFs被施加于原代培养神经元或注射入动物脑内时，可导致神经突和胞体中形成含α-突触核蛋白的包涵体11，这些包涵体重现了路易病理中的多种特征。所观察到的包涵体在Triton X中不溶，可被泛素化标记，能被淀粉样特异性染料硫黄素S染色，并含有在Ser129位点高度磷酸化的α-突触核蛋白11,12。重要的是，在α-突触核蛋白基因敲除动物中不会形成此类包涵体11，表明其形成依赖于内源性α-突触核蛋白。
尽管如此，直接比较PFF诱导的包涵体与帕金森病（PD）患者中的路易病理仍存在困难，因为人类路易小体（LBs）和路易神经突（LNs）具有高度异质性3。路易病理所观察到的异质性可能源于其形成的不同阶段、不同的解剖位置，或引发聚集过程的错误折叠α-突触核蛋白（α-synuclein）构象差异。这些相同因素也可能影响PFF诱导的pS129-αsyn阳性包涵体。事实上，最近的研究表明，在原代神经元培养中，PFF诱导的pS129-αsyn阳性包涵体代表了病理的极早期阶段，经过长期孵育后可成熟为与路易小体高度相似的结构12,13。
利用PFFs模拟错误折叠的α-突触核蛋白在早期的播散与聚集，对于药物开发具有重要价值，因为路易体病理的扩散被认为是帕金森病早期阶段的疾病标志之一。因此，在疾病极早期采用抑制聚集的治疗方法，可能有助于阻止或延缓帕金森病的进展。目前已有多个旨在减缓或阻止α-突触核蛋白聚集的临床试验正在进行14。对于疾病晚期患者，多巴胺能神经元前体细胞的移植可能是一种更优的治疗选择15。然而，在帕金森病患者脑组织的尸检分析中，已在移植的胚胎神经元中观察到路易体病理的存在16,17，这也表明需要采取措施防止α-突触核蛋白的聚集。
在体外，α-突触核蛋白PFFs已被证实可在永生化细胞系或更常见的啮齿类动物原代海马或皮层神经元中诱导聚集。然而，这些模型均未能很好地模拟多巴胺能神经元10。培养此类神经元需要在体外以特定数量进行高密度接种18。为了在材料有限（例如原代多巴胺能神经元）的情况下实现高接种密度，通常采用微岛培养法。在微岛培养中，细胞最初被接种于一个微小的培养基液滴中（通常为几微升），该液滴依靠表面张力维持在大孔板中央18。待神经元贴壁后，再将整个孔板加满培养基，而细胞仍保持在初始小面积区域内的高密度状态。除了实现高接种密度外，微岛培养还可避免细胞在孔边缘处接种，因为该区域常出现细胞密度和存活率的波动。微岛培养通常用于相对较大的孔板或培养皿中；然而，将中脑神经元培养于96孔板格式的微岛中，可实现对真正多巴胺能神经元中路易病理的中高通量研究。利用这些神经元进行的体外实验使我们发现了胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF），该因子可促进成熟多巴胺能神经元在体外和体内的存活19,20,21,22，并能防止多巴胺能神经元中α-突触核蛋白聚集体的形成23。源自人类患者诱导多能干细胞的多巴胺能神经元因其人类来源及在体外更长的存活时间，构成了更为精确的模型。然而，与小鼠胚胎神经元中约一周即可观察到病理变化相比，在人类神经元中诱导出α-突触核蛋白病理通常需要数月时间，且/或需联合多种应激因素（例如α-突触核蛋白过表达与PFFs联用）24,25。此外，与原代胚胎神经元相比，人类多巴胺能神经元的维持成本更高、操作更繁琐，这在本质上限制了其在高通量应用中的使用。
此外，原代多巴胺能神经元培养物可通过基因编辑（例如使用CRISPR/Cas9）和/或药物处理进行改造23。这些培养物构成了用于分子通路解析和药物文库筛选等应用的快速且可重复的实验平台。尽管从这些培养物中获得的材料有限，但仍可进行小规模的基因组学/蛋白质组学分析。将原代神经元以96孔板形式培养，更适用于免疫细胞化学和荧光显微镜技术，并可进一步开展高内涵表型分析。通过对96孔板进行自动成像所获得的多光谱荧光图像，可转化为定量结果（例如每孔中含路易小体的神经元数量）。此类分析可使用免费软件（如CellProfiler26,27）完成。总体而言，以96孔板接种的原代胚胎中脑培养物为研究多巴胺能神经元及α-突触核蛋白聚集提供了稳定高效的平台，同时具备高通量表型筛选的可能性。

<table><tbody><tr><td>0.4% 台盼蓝染色液</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>15 ml CELLSTAR 聚丙烯离心管</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>5 M 盐酸</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>媒体厨房，赫尔辛基大学生物技术研究所</td></tr><tr><td>5 M 氢氧化钠</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>媒体厨房，赫尔辛基大学生物技术研究所</td></tr><tr><td>96 孔视窗板（黑色）</td><td>PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>6005182</td><td></td></tr><tr><td>99.5% 乙醇（EtOH）</td><td>Altia Oyj, Rajam&amp;auml;ki, Finland</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>AquaSil 硅化液</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>TS-42799</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌 1.5 ml 微量离心管</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>媒体厨房，赫尔辛基大学生物技术研究所</td></tr><tr><td>Bioruptor 超声破碎仪</td><td>Diagenode, Liege, Belgium</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>无 Ca²⁺、Mg²⁺ 的 Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>14175-053</td><td></td></tr><tr><td>CellProfiler 和 CellAnalyst 软件包</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>免费开源软件</td></tr><tr><td>Centrifuge 5702 离心机</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Germany</td><td>5702000019</td><td></td></tr><tr><td>CO₂ 培养箱</td><td>HeraCell, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板</td><td>BioRad Inc., Hercules, California, USA</td><td>1450015</td><td></td></tr><tr><td>配备气浮台和机柜的 DeltaVision 超高分辨率显微镜</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Boston, Massachusetts, USA</td><td>29254706</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I（Dnase I）</td><td>Roche, Basel, Switzerland</td><td>22098700</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>21331&amp;ndash;020</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠 AlexaFluor 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 AlexaFluor 647</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>驴抗绵羊 AlexaFluor 488</td><td>Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>A11015</td><td></td></tr><tr><td>杜氏缓冲液</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>媒体厨房，赫尔辛基大学生物技术研究所</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 普通经济型 PTFE 搅拌子</td><td>fisher scientific, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>11507582</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Nano 自动成像系统</td><td>Molecular Devices, San Jose, California, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>25030&amp;ndash;032</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗酪氨酸羟化酶抗体</td><td>Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German</td><td>MAB318</td><td></td></tr><tr><td>N2 添加剂</td><td>Gibco, Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA</td><td>17502&amp;ndash;048</td><td></td></tr><tr><td>正常马血清</td><td>Vector Laboratories Inc., Burlingame, California, United States</td><td>S-2000</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>95% 多聚甲醛粉末</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>pH-Fix 显色固定 pH 指示条</td><td>Macherey-Nagel, D&amp;uuml;ren, Germany</td><td>92110</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>媒体厨房，赫尔辛基大学生物技术研究所</td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen, San Diego, California, USA</td><td>ant-pm-1, ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>兔单克隆抗α-突触核蛋白纤维抗体</td><td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td><td>ab209538</td><td></td></tr><tr><td>兔单克隆抗磷酸化丝氨酸129-α-突触核蛋白抗体</td><td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>RCT Basic IKA 磁力搅拌器</td><td>IKA&amp;reg;-Werke GmbH, Staufen, Germany</td><td>3810000</td><td></td></tr><tr><td>重组人胶质细胞源性神经营养因子（hGDNF）</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA 或 Prospec, Ness-Ziona, Israel</td><td>450-10 (PeproTech), CYT-305 (Prospec)</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠α-突触核蛋白预形成纤维（PFFs）</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>合作研究者 Kelvin C Luk 教授惠赠</td></tr><tr><td>研究用体视显微镜系统</td><td>Olympus Corporation, Tokyo, Japan</td><td>SZX10</td><td></td></tr><tr><td>绵羊多克隆抗酪氨酸羟化酶抗体</td><td>Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, German</td><td>ab1542</td><td></td></tr><tr><td>TC 20 自动细胞计数仪</td><td>BioRad Inc., Hercules, California, USA</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>MP Biomedicals, Valiant Co., Yantai, Shandong, China</td><td>2199700</td><td></td></tr></tbody></table>

研究预制纤维诱导的α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠中脑多巴胺能神经元中的聚集

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

本实验方案旨在建立一种稳定且可重复的α-突触核蛋白在原代多巴胺能神经元中聚集的模型。结合免疫染色与无偏倚的自动化图像分析，该模型可用于分析药物处理和基因操作对神经元培养中α-突触核蛋白聚集的影响。原代中脑培养物可提供可靠的真正胚胎期多巴胺能神经元来源。在本方案中，通过将α-突触核蛋白预形成的纤维（PFFs）直接加入神经元培养基中，模拟帕金森病的标志性组织病理学特征——路易小体（LB）。在加入PFF后7天即可通过免疫染色检测到多巴胺能神经元胞体中内源性磷酸化α-突触核蛋白的积累。体外细胞培养条件也适用于评估防止α-突触核蛋白积累的干预措施，例如小分子药物、神经营养因子，以及用于基因操作的慢病毒载体（如CRISPR/Cas9系统）。将神经元培养于96孔板中可提高实验设计的稳健性和统计效力。实验结束时，使用多聚甲醛固定细胞，用于免疫细胞化学染色和荧光显微镜成像。通过自动化显微镜对96孔板进行多光谱荧光成像以获取图像数据。利用免费软件对这些数据进行量化分析（例如，计数每孔中含有磷酸化α-突触核蛋白的多巴胺能神经元数量），该软件为无偏倚的高内涵表型分析提供了平台。PFF诱导的原代多巴胺能神经元中磷酸化α-突触核蛋白积累模型，为研究介导α-突触核蛋白包涵体形成与清除的潜在机制提供了可靠工具，同时具备高通量药物筛选和细胞表型分析的应用前景。

铺板后几天（DIV1–DIV3），通过明场显微镜观察评估培养细胞的健康状态及分布均匀性，以及各孔内条件的一致性（图3）。培养的中脑细胞均匀分布在铺板前形成的微岛区域内（图3A、B）。原代神经元已均匀贴附于包被表面，并形成神经突起（图3B）。在某孔中观察到一小团细胞聚集体（直径小于150 μm），作为示例展示（图3C）。
<img alt="显微镜图像中的神经元投射和成团细胞；示意图显示测量尺度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61118/61118fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：铺板后数天（例如，DIV3），通过明场显微镜观察中脑原代培养物的状态。（A）培养细胞在PO包被的微岛中央区域扩散，微岛半径约为4.4 mm（白色箭头所示），该微岛通过从约1 mm宽的孔板边缘刮除PO形成（黑色箭头所示）。（B）原代神经元在区域内均匀分布，并可见神经元投射（红色箭头标示）。（C）直径小于150 μm的细胞团由蓝色箭头标示。比例尺 = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61118/61118fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
培养15天后，采用抗TH和抗pS129-αsyn抗体对原代小鼠中脑细胞进行免疫染色，并使用自动显微镜成像。包被的微岛在孔板中央为细胞附着提供了限定区域（图4A，B）。TH标记的多巴胺能神经元以单层形式分布在微岛周围，彼此分离，无任何聚集现象（图4A’和4B’）。
<img alt="TH/pS129-αsyn/DAPI 神经元表达的荧光显微镜图像；TH 阳性细胞计数的柱状图。" class="xfigimg bigfig" src="/files/ftp_upload/61118/61118fig4v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：在 DIV15 时，每个微岛中定量了 800–1,000 个多巴胺能细胞，无论是否进行 PFF 处理。 胚胎中脑培养物的代表性图像，使用抗-TH 和抗-pS129-αsyn 抗体进行免疫染色。(A, A’, A’’) 未接受 PFF 处理的对照细胞。(B, B’, B’’) 经 PFF 处理并出现 pS129-αsyn 包涵体的细胞。(C) 接受溶剂（对照）、PFF 或 PFF 加 50 ng/mL GDNF 处理的孔中 TH 阳性细胞数量的定量结果。(D) 接受溶剂（对照）、PFF 或 PFF 加 50 ng/mL GDNF 处理的 TH 阳性细胞中 pS129-αsyn 聚集体的定量结果。统计学显著性通过随机区组设计 ANOVA 计算得出。**p &lt; 0.01，n = 4 个独立培养板（生物学重复），每组处理包含每板 3–6 个孔（技术重复）。比例尺 = A、B 图为 300 μm；A’、B’ 图为 50 μm；A’’、B’’ 图为 25 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61118/61118fig4v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
未经PFF处理的培养物中未检测到pS129-αsyn信号（图4A’ 和 4A’’），而经α-突触核蛋白PFF处理的培养物则形成了pS129-αsyn阳性包涵体（图4B’ 和 4B’’）。体外PFF处理7天后，与其它实验组相比，TH阳性神经元数量未出现显著下降（图4C）。PFF处理的培养物中约有40%的pS129-αsyn阳性TH阳性多巴胺能神经元。使用阳性对照GDNF处理后，可降低具有pS129-αsyn阳性包涵体的TH阳性多巴胺能神经元的比例（图4D，原始数据及示例图像详见补充文件）。
补充文件：使用 CellProfiler 和 CellAnalyst 软件包进行高内涵图像分析的示例流程、图4E、F 的示例图像和原始数据。（1-9）示例图像，可使用 ImageJ 或 CellProfiler 打开。（10）Fig_4_raw_data_Er_et_al.xlxs。（11）TH_LB_V1.cpipe（步骤 6.2–6.8），（12）TH_LB_V2.cpipe（步骤 6.11–6.18） <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61118/Supplementary_Files.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种用于研究原代小鼠多巴胺能神经元中α-突触核蛋白聚集的详细实验方案。通过预先形成的α-突触核蛋白纤维诱导神经元内磷酸化α-突触核蛋白的聚集。对免疫荧光标记的细胞进行自动化成像并结合无偏倚的图像分析，使该方案成为适用于中高通量筛选抑制α-突触核蛋白聚集药物的可靠方法。

本实验方案的目标是建立一种稳定且可重复的α-synuclein在原代多巴胺能神经元中聚集的模型。结合……

本方案为研究可能调控α-突触核蛋白聚集的机制和治疗方法，提供了一种稳定且可重复的原代多巴胺能神经元中α-突触核蛋白聚集模型。预先形成的α-突触核蛋白纤维可诱导进行性、高度可重复的蛋白聚集，结合自动化成像与无偏图像分析，本方案有助于相对快速地对抑制α-突触核蛋白聚集的化合物进行中等到高通量筛选。进行性α-突触核蛋白聚集可能是帕金森病及某些核体疾病中损害神经元功能的因素之一。能够阻断此类积聚的新分子可能成为治疗神经变性的新疗法。我们认为，本方案是建立一种标准且可靠的工具以研究调控多巴胺神经元中α-突触核蛋白积聚的分子机制的重要一步。本实验操作将由我实验室的博士生 Julia Konovalova 演示。在建立原代胚胎中脑细胞培养之前，向每孔中加入50微升多巴胺神经元培养基至已包被多聚-L-鸟氨酸的96孔板中，并使用100微升移液枪头吸取培养基，同时以环形方式轻轻刮擦每个孔的底部边缘，以去除孔周区域的包被层。每个孔的中央将保留一个呈岛状的多聚-L-鸟氨酸包被区域。向每个包被岛的中央加入10微升培养基，以形成微岛结构。从孕13.5天的小鼠胚胎中建立原代胚胎中脑培养物。将所有收集的中脑腹侧组织合并至同一个1.5毫升离心管中，每次用500微升不含钙和镁的HBSS洗涤样本，共洗涤三次。最后一次洗涤后，弃去HBSS，加入0.5%胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育30分钟。孵育结束时，向部分消化的组织中加入500 µL新鲜配制的含FBS的DNase I溶液，使用尖端经火焰抛光的硅化玻璃移液管吹打组织进行机械解离。当仅能观察到微小且几乎不可见的颗粒时，让这些组织碎片沉降到微量离心管底部，将上清液转移至一个新的15 mL圆锥形聚丙烯管中。向含有含FBS的DNase I溶液的管中加入1 mL HBSS，通过反复吹打混合数次。取一毫升该溶液加入剩余的组织颗粒中，再次吹打混匀。然后用移液管吸取消化后的细胞悬液，再用剩余的DNase I和HBSS中的FBS对组织样本进行一次吹打，避免转移任何残留的组织碎片，通过离心沉淀收集的细胞，并小心吸除上清液，勿扰动细胞沉淀。每次用两毫升预热的多巴胺能神经元培养基洗涤细胞，共洗涤两次。将细胞重悬于含有三倍十的六次方个细胞/六微升新鲜温热培养基的微量离心管中。接下来，移除每个预先制备的微岛中的培养基，轻轻吹打混匀细胞，然后使用十微升移液器向每个微岛中加入六微升细胞悬液。当所有细胞均添加完毕后，用150微升水或PBS填充培养板边缘的空孔，并将培养板放入细胞培养箱中孵育一小时。孵育结束时，向每个孔中加入 100 微升新鲜的多巴胺能神经元培养基，然后将培养板放回孵育箱。在细胞培养的第 8 天，在超净台中向每个实验孔加入 3.75 微升浓度为 100 微克/毫升的预先形成的纤维（preformed fibrils），向每个对照孔加入 3.75 微升 PBS。操作 PFS 时需注意防止外源性蛋白污染，使用后应用 1% SDS 和 70% 乙醇清洁超净台及所有与 PF 相关的仪器。在对目标标志物染色后，于适当的实验时间点，将96孔培养板装载到配备10倍物镜的高内涵平板扫描仪上。根据96孔板的具体参数（如板型、生产厂家、尺寸、孔间距离以及培养基类型和体积）调整仪器设置。选择成像区域以覆盖每个微岛中的全部细胞，并利用一个孔根据DAPI信号调整自动对焦。根据对照孔中染色强度校准每个荧光通道的采集时间，并调整参数，使经预制纤维处理的对照孔中细胞胞体内的磷酸化丝氨酸129 α-突触核蛋白聚集体所标记的多巴胺能细胞能够被清晰区分，从而能够明确地定量磷酸化丝氨酸129 α-突触核蛋白阳性与阴性细胞。随后，使用完全相同的参数同时对所有选定孔在所有通道中进行成像。在图像分析时，打开CellProfiler Analyst并选择V2_THpos。属性文件。为了将已分割的细胞分类为磷酸化丝氨酸129 α-突触核蛋白阳性和阴性细胞，首先将获取细胞数量设置为50个随机细胞，然后点击“获取”以加载已分割细胞的图像。将至少30个细胞拖入窗口底部对应的分类框中。选择使用最大规则数为50的快速温和增强方法或随机森林分类器，然后点击“训练”。将获取数量设置为50个阳性细胞，点击“获取”以根据训练好的分类器获得示例性的磷酸化丝氨酸129位点α-突触核蛋白阳性细胞；或设置获取50个阴性细胞，点击“获取”以获得示例性的磷酸化丝氨酸129位点α-突触核蛋白阴性细胞。当结果满意后，点击“评分全部”以生成结果表格，汇总每个孔中磷酸化丝氨酸129位点α-突触核蛋白阳性及阴性的多巴胺能神经元数量。接种后几天，可在接种前形成的微岛内通过光学显微镜观察到均匀分布的培养物。原代神经元均匀地附着在包被的培养板底部，并形成神经突起。在本图像中，可观察到一个直径小于150 µm的微小细胞团块。对未处理的对照组原代小鼠中脑培养物在接种后15天进行神经元细胞标志物免疫染色，结果显示细胞仅局限于培养板孔中央微岛区域附着。使用酪氨酸羟化酶标志物免疫标记的多巴胺能神经元在微岛周围以单层形式分布，彼此分离，无任何聚集现象。在α-突触核蛋白预形成纤维处理的培养物中，亦可观察到pS129 α-突触核蛋白阳性包涵体。与其它实验组相比，体外预先形成的纤维处理七天并未导致酪氨酸羟化酶阳性神经元数量显著减少。然而，胶质细胞系源性神经营养因子处理可降低磷酸化S129 α-突触核蛋白阳性包涵体中酪氨酸羟化酶阳性多巴胺能神经元所占的百分比。在制备微岛之前，务必充分洗涤聚-L-鸟氨酸包被的孔板。在接种新的脑细胞培养物时，也务必使用新鲜的培养基。该方法可与基因编辑技术和药理学抑制剂联合使用，以研究特定基因和脑电波对核素聚集的影响。我们 routinely 使用此方法筛选能够抑制 α-突触核蛋白聚集的新分子。已证明TDN具有累积保护作用，目前正在分析几种小分子候选化合物。

studying-pre-formed-fibril-induced-synuclein-accumulation-primary

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

研究原发性胚胎小鼠中脑多巴胺神经元中预制纤维诱导β-合成素积累

从表达突变型α-突触核蛋白的胚胎大鼠中脑原代培养物开始，其中含有多巴胺能神经元。将处理孔中的培养基更换为含有测试化合物的新鲜培养基，对照孔中的培养基更换为不含化合物的普通培养基，然后进行孵育。在对照组中，α-突触核蛋白在多巴胺能神经元中形成毒性聚集物，导致神经突回缩，并最终引发神经元死亡。在治疗过程中，测试化合物与α-突触核蛋白相互作用，抑制其聚集，保护神经突结构，并提供神经保护作用。固定并透化细胞，然后封闭非特异性结合位点。使用一抗孵育以标记所有神经元，并对多巴胺能神经元进行额外标记。洗涤细胞，并加入针对一抗的荧光标记二抗。使用倒置荧光显微镜对不同标记的多巴胺能神经元进行计数，然后切换至共聚焦显微镜以测量神经突长度。与对照组相比，治疗组中具有完整神经突的多巴胺能神经元数量更多，证实了受试化合物具有神经保护潜力。...

评估测试化合物在大鼠胚胎神经元中对抗α-突触核蛋白毒性的神经保护作用

该视频展示了从小鼠胚胎中脑分离和培养多巴胺能神经元的过程。分离出的腹侧中脑组织通过酶消化法进行解离。获得的多巴胺能神经元被收集并转移至多孔板内的微岛结构中。细胞在多巴胺能神经元培养基中孵育，以维持其在微岛内的高密度生长状态。...

原代小鼠中脑多巴胺能神经元的分离与培养

本视频展示了在经α-突触核蛋白预形成纤维预处理的胚胎小鼠多巴胺能神经元中，定量α-突触核蛋白聚集的过程。该方法详细说明了通过免疫荧光技术对含有α-突触核蛋白聚集体的多巴胺能神经元进行固定、染色和定量分析的步骤。...

研究α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠多巴胺能神经元中的聚集

多巴胺能神经元在大脑中发挥着重要的调节作用，其丢失与帕金森病相关。在本视频中，我们展示了如何从胚胎小鼠中脑分离培养原代中枢多巴胺能神经元。此类培养体系可用于研究这些神经元对各种应激因素高度敏感的特性。...

小鼠多巴胺能神经元的原代培养

帕金森病期间中脑多巴胺能神经元退化的原因尚未完全明确。细胞培养系统为研究这些神经元的神经生理特性提供了重要工具。本文介绍了一种优化的方案，可用于 体外...

从胚胎啮齿类动物脑组织中分离、培养及长期维持原代中脑多巴胺能神经元

本实验方案的目的是提供一种基于细胞的系统，用以模拟α-突触核蛋白聚集体的形成...

外源性施加与微粒体相关的α-突触核蛋白聚集体至原代神经元：一种高效的纤维形成细胞模型

本文的目的是概述由单体α-突触核蛋白生成纤维、后续质量控制以及在体内使用预先形成的纤维的步骤。...

由单体生成α-突触核蛋白预制纤维及其在体内的应用

本文介绍了一种利用原代小鼠中脑神经元培养物，在体外检测中脑神经元内Ca2+流及其对caspase-3下游效应的方法。该模型可用于研究与中脑神经元Ca2+活动异常相关的病理生理变化，并用于筛选具有抗凋亡特性的新型治疗药物。...

量化原代小鼠中脑神经元中自发性 Ca2+ 流及其下游效应

本研究分析了在帕金森病临床前模型中诱导神经炎症、神经变性及运动功能障碍所需的病毒载体剂量和暴露时间。这些编码人源α-突触核蛋白的载体被递送至黑质 ，以重现与帕金森病相关的突触核蛋白病理变化。...

分析由编码人α-突触核蛋白的腺相关病毒载体诱导的帕金森病小鼠模型

研究和理解帕金森病的发病机制需要一种α-突触核蛋白的体内生理模型。我们描述了一种利用人源化酵母模型监测α-突触核蛋白细胞毒性及聚集体形成的方法。...

一种利用人源化酵母模型研究α-突触核蛋白毒性和聚集的方法

了解利用预制纤维诱导α-突触核蛋白聚集的小鼠原代多巴胺神经元模型。该方案结合自动化成像与无偏倚分析，适用于中高通量筛选抑制蛋白积累的药物候选分子，助力帕金森病神经退行性机制研究。

研究预制纤维诱导的α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠中脑多巴胺能神经元中的聚集

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