研究预制纤维诱导的α-突触核蛋白在原代胚胎小鼠中脑多巴胺能神经元中的聚集

本方案为研究可能调控α-突触核蛋白聚集的机制和治疗方法，提供了一种稳定且可重复的原代多巴胺能神经元中α-突触核蛋白聚集模型。预先形成的α-突触核蛋白纤维可诱导进行性、高度可重复的蛋白聚集，结合自动化成像与无偏图像分析，本方案有助于相对快速地对抑制α-突触核蛋白聚集的化合物进行中等到高通量筛选。进行性α-突触核蛋白聚集可能是帕金森病及某些核体疾病中损害神经元功能的因素之一。

能够阻断此类积聚的新分子可能成为治疗神经变性的新疗法。我们认为，本方案是建立一种标准且可靠的工具以研究调控多巴胺神经元中α-突触核蛋白积聚的分子机制的重要一步。本实验操作将由我实验室的博士生 Julia Konovalova 演示。

在建立原代胚胎中脑细胞培养之前，向每孔中加入50微升多巴胺神经元培养基至已包被多聚-L-鸟氨酸的96孔板中，并使用100微升移液枪头吸取培养基，同时以环形方式轻轻刮擦每个孔的底部边缘，以去除孔周区域的包被层。每个孔的中央将保留一个呈岛状的多聚-L-鸟氨酸包被区域。向每个包被岛的中央加入10微升培养基，以形成微岛结构。

从孕13.5天的小鼠胚胎中建立原代胚胎中脑培养物。将所有收集的中脑腹侧组织合并至同一个1.5毫升离心管中，每次用500微升不含钙和镁的HBSS洗涤样本，共洗涤三次。最后一次洗涤后，弃去HBSS，加入0.5%胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育30分钟。

孵育结束时，向部分消化的组织中加入500 µL新鲜配制的含FBS的DNase I溶液，使用尖端经火焰抛光的硅化玻璃移液管吹打组织进行机械解离。当仅能观察到微小且几乎不可见的颗粒时，让这些组织碎片沉降到微量离心管底部，将上清液转移至一个新的15 mL圆锥形聚丙烯管中。向含有含FBS的DNase I溶液的管中加入1 mL HBSS，通过反复吹打混合数次。

取一毫升该溶液加入剩余的组织颗粒中，再次吹打混匀。然后用移液管吸取消化后的细胞悬液，再用剩余的DNase I和HBSS中的FBS对组织样本进行一次吹打，避免转移任何残留的组织碎片，通过离心沉淀收集的细胞，并小心吸除上清液，勿扰动细胞沉淀。每次用两毫升预热的多巴胺能神经元培养基洗涤细胞，共洗涤两次。

将细胞重悬于含有三倍十的六次方个细胞/六微升新鲜温热培养基的微量离心管中。接下来，移除每个预先制备的微岛中的培养基，轻轻吹打混匀细胞，然后使用十微升移液器向每个微岛中加入六微升细胞悬液。当所有细胞均添加完毕后，用150微升水或PBS填充培养板边缘的空孔，并将培养板放入细胞培养箱中孵育一小时。

孵育结束时，向每个孔中加入 100 微升新鲜的多巴胺能神经元培养基，然后将培养板放回孵育箱。在细胞培养的第 8 天，在超净台中向每个实验孔加入 3.75 微升浓度为 100 微克/毫升的预先形成的纤维（preformed fibrils），向每个对照孔加入 3.75 微升 PBS。操作 PFS 时需注意防止外源性蛋白污染，使用后应用 1% SDS 和 70% 乙醇清洁超净台及所有与 PF 相关的仪器。

在对目标标志物染色后，于适当的实验时间点，将96孔培养板装载到配备10倍物镜的高内涵平板扫描仪上。根据96孔板的具体参数（如板型、生产厂家、尺寸、孔间距离以及培养基类型和体积）调整仪器设置。选择成像区域以覆盖每个微岛中的全部细胞，并利用一个孔根据DAPI信号调整自动对焦。

根据对照孔中染色强度校准每个荧光通道的采集时间，并调整参数，使经预制纤维处理的对照孔中细胞胞体内的磷酸化丝氨酸129 α-突触核蛋白聚集体所标记的多巴胺能细胞能够被清晰区分，从而能够明确地定量磷酸化丝氨酸129 α-突触核蛋白阳性与阴性细胞。随后，使用完全相同的参数同时对所有选定孔在所有通道中进行成像。在图像分析时，打开CellProfiler Analyst并选择V2_THpos。

属性文件。为了将已分割的细胞分类为磷酸化丝氨酸129 α-突触核蛋白阳性和阴性细胞，首先将获取细胞数量设置为50个随机细胞，然后点击“获取”以加载已分割细胞的图像。将至少30个细胞拖入窗口底部对应的分类框中。

选择使用最大规则数为50的快速温和增强方法或随机森林分类器，然后点击“训练”。将获取数量设置为50个阳性细胞，点击“获取”以根据训练好的分类器获得示例性的磷酸化丝氨酸129位点α-突触核蛋白阳性细胞；或设置获取50个阴性细胞，点击“获取”以获得示例性的磷酸化丝氨酸129位点α-突触核蛋白阴性细胞。当结果满意后，点击“评分全部”以生成结果表格，汇总每个孔中磷酸化丝氨酸129位点α-突触核蛋白阳性及阴性的多巴胺能神经元数量。

接种后几天，可在接种前形成的微岛内通过光学显微镜观察到均匀分布的培养物。原代神经元均匀地附着在包被的培养板底部，并形成神经突起。在本图像中，可观察到一个直径小于150 µm的微小细胞团块。

对未处理的对照组原代小鼠中脑培养物在接种后15天进行神经元细胞标志物免疫染色，结果显示细胞仅局限于培养板孔中央微岛区域附着。使用酪氨酸羟化酶标志物免疫标记的多巴胺能神经元在微岛周围以单层形式分布，彼此分离，无任何聚集现象。在α-突触核蛋白预形成纤维处理的培养物中，亦可观察到pS129 α-突触核蛋白阳性包涵体。

与其它实验组相比，体外预先形成的纤维处理七天并未导致酪氨酸羟化酶阳性神经元数量显著减少。然而，胶质细胞系源性神经营养因子处理可降低磷酸化S129 α-突触核蛋白阳性包涵体中酪氨酸羟化酶阳性多巴胺能神经元所占的百分比。在制备微岛之前，务必充分洗涤聚-L-鸟氨酸包被的孔板。

在接种新的脑细胞培养物时，也务必使用新鲜的培养基。该方法可与基因编辑技术和药理学抑制剂联合使用，以研究特定基因和脑电波对核素聚集的影响。我们 routinely 使用此方法筛选能够抑制 α-突触核蛋白聚集的新分子。

已证明TDN具有累积保护作用，目前正在分析几种小分子候选化合物。