Name: 神经干细胞向大鼠和小鼠大脑的动脉内传递:对脑缺血的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 了解通过颈动脉向大鼠和小鼠脑缺血模型动脉内递送神经干细胞的方法。该技术可实现细胞在脑内广泛分布并存活长达30天，为中风治疗提供潜在方案。

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本研究获得以下资助：美国心脏协会（AHA）奖项14SDG20480186（授予LC），山西中医药大学学科创新团队项目2019-QN07（授予BZ），肯塔基州脊髓与头部损伤研究信托基金14-12A（授予KES和LC）。

所有涉及动物的实验程序均经肯塔基大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并采取适当措施以尽量减少手术相关的应激或疼痛。
1. 注射导管和手术钩的制备
<ol>
	<li>构建注射导管（图1）。准备所需材料，包括：MRE010、MRE025 和 MRE050 导管，20 G、26 G 和 27 G 注射针（图2A），600 目砂纸、瞬干胶和双组分 5 分钟环氧树脂。
	<ol>
		<li>从针座端起，在 1 cm 处截断 20 G 和 26 G 针头，并在砂纸上打磨断端（图2B）。用 10 mL 双蒸水冲洗针头以清洁针腔。 
		注意：使用两种不同的设计（图1）。设计 1 为单接头，用于注射溶液或悬浮液。设计 2 具有 20 G 和 26 G 鲁尔锁接头，分别用于细胞注射（20 G 针）和冲洗死腔体积（26 G 针），以确保将含神经干细胞（NSC）的溶液全部注入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设计 1：将一段 3–4 cm 长的 MRE010 导管插入一段 15 cm 长的 MRE025 导管中，并用瞬干胶固定。
	<ol>
		<li>将 MRE025 导管的另一端连接至一段 MRE050 导管，并用瞬干胶固定。将一根钝化的 20 G 针头插入 MRE050 导管的剩余末端，并用瞬干胶固定（图1）。</li>
		<li>使用环氧树脂进一步加固各连接部位。该导管设计适用于试剂注射（如化学物质、药物溶液或其他生物制剂，如细胞因子）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设计 2：将一段 3–4 cm 长的 MRE010 导管插入一段 15 cm 长的 MRE025 导管中，并用瞬干胶固定。
	<ol>
		<li>将 MRE025 导管的另一端连接至一段 MRE050 导管，并用瞬干胶固定。将一根钝化的 20 G 针头插入 MRE050 导管的剩余末端，并用瞬干胶固定。</li>
		<li>沿注射流向，在靠近第一根针头尖端的位置，将一根钝化的 26 G 针头插入 MRE050 导管，并用瞬干胶固定（图1 和 图2C）。使用透明环氧树脂加固两根针头及 MRE050 导管段（图2C）。该设计允许在通过针 1（20 G）注射神经干细胞后，通过针 2（26 G）注入载体溶液，以冲洗导管内的死腔体积，从而实现对注射体积的更精确控制。</li>
		<li>使用 20 G 针头进行神经干细胞注射，以尽量减少对细胞的损伤，避免影响其活力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建完成后，先用 10 mL 双蒸水冲洗导管，再用 70% 乙醇冲洗，然后在 70% 乙醇中浸泡过夜。</li>
	<li>手术前，将导管从 70% 乙醇中取出，用 10 mL 无菌 PBS 冲洗，并将其放入已灭菌的手术器械盒中保存和运输。</li>
	<li>手术钩的制备
	<ol>
		<li>从 27 G 针头截取一段 1.5–2 cm 长的针杆，用砂纸打磨两端至钝化。然后使用小型止血钳将针杆一端弯成钩状，另一端弯成环状。</li>
		<li>将一段 10–15 cm 长的 MRE025 导管穿过环状端，并用透明外科胶带固定（图2D）。用相同方法再制作两个钩子。</li>
		<li>将所有钩子和导管系统浸泡于 70% 乙醇中，待用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 动物准备：给药、饲养、环境适应
<ol>
	<li>本研究使用雄性和雌性 C57BL/6 小鼠（10–12 周龄，每时间点 n=10）和 Wistar 大鼠（10–12 周龄，n=10）。</li>
	<li>将动物饲养在环境可控的动物实验室内，自由摄取食物和水。</li>
	<li>在脑卒中手术前，让动物至少适应环境 1 周。 
	注：1 只小鼠和 1 只大鼠在脑卒中手术后 1 天死亡，另有 1 只小鼠因严重瘫痪出于人道原因在卒中后第 3 天于神经干细胞注射前实施安乐死。</li>
</ol>
3. 小鼠和大鼠神经干细胞（NSCs）的培养
注意：神经干细胞（NSC）的分离与培养遵循既定方案20。
<ol>
	<li>小鼠
	<ol>
		<li>从与GFP阳性雄性小鼠（B6 ACTb-EGFP）交配的定时妊娠C57BL/6雌性小鼠的E18胚胎皮层中分离野生型（WT）和GFP标记的NSCs。为鉴定GFP（+）胚胎，将收获的胚胎置于荧光显微镜下使用FITC通道观察。GFP（+）胚胎显示绿色荧光信号，而WT胚胎仅显示微弱的自发荧光（图3A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大鼠
	<ol>
		<li>从年轻成年WT大鼠的脑室下区（SVZ）分离NSCs。按照制造商说明书，在注射前用DiI进行标记21。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养小鼠或大鼠NSCs，直至其形成神经球，当神经球直径达到约100 µm时进行传代（图3B）。用于注射的NSCs应处于第3至第5代之间。</li>
	<li>使用胚胎干细胞标志物抗体组合验证其干细胞特性（图3C）。</li>
	<li>在注射当天，收集NSC神经球，用细胞解离液解离后，重悬于无钙、无镁的PBS中，细胞浓度为107个/mL，并置于湿冰上保存直至注射。</li>
</ol>
4. 手术准备
<ol>
	<li>手术前，使用银色记号笔在商用MCAO缝合线上距离尖端9 mm（小鼠）或15 mm（大鼠）处标记一个点，作为术中插入长度的参考。每次手术前对手术器械（剪刀、镊子）进行高压灭菌，并在每次操作之间使用玻璃珠灭菌器进行加热灭菌。</li>
	<li>通过吸入5%异氟烷诱导动物麻醉，并以1–2%异氟烷维持麻醉。通过观察动物的一般状况（呼吸模式、胡须运动和自发体位矫正）、角膜反射以及足趾夹捏反应来评估麻醉深度。</li>
	<li>将动物仰卧于加热垫上，使用聚维酮碘溶液对动物手术区域进行剪毛和擦拭消毒，随后用70%乙醇冲洗。术中使用眼用软膏（例如人工泪液软膏）保护动物眼睛，防止干燥。</li>
	<li>手术人员需使用杀菌洗手液彻底清洁双手，并佩戴口罩、无菌手套和洁净实验服。</li>
</ol>
5. 大脑中动脉阻塞（MCAO）卒中手术
注意：在小鼠或大鼠单侧大脑诱导缺血性脑卒中的手术方法相似，均是将缝线插入颈内动脉（ICA）以阻断血流（图4）17,18,19,22。然而，选择用于插入缝线的动脉取决于后续干细胞注射所需的操作空间。大鼠的颈外动脉（ECA）段具有足够的操作空间，可允许进行两次独立且连续的手术（脑卒中建模和NSC注射），而小鼠则不具备这一条件，因此需要采用替代方法。有关脑卒中诱导后的脑血流变化、脑梗死面积及神经功能缺损情况，已在作者先前的报道中有所描述17,18,19。
<ol>
	<li>为诱导缺血性脑卒中，开始小鼠和大鼠手术时，先在颈部区域做正中切口，并分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。图4）。注意避免拉伸、移位或挤压颈总动脉（CCA）或迷走神经。由于后续动脉选择和手术步骤有所不同，小鼠与大鼠的MCAO手术将分别描述。</li>
	<li>小鼠MCAO手术（图4A)
	<ol>
		<li>在颈总动脉（CCA）下方放置三根编织的6-0尼龙缝线图4A，步骤1），使用近端结扎线打一个紧密的外科结，尽可能远离分叉处以阻断血管图4A，步骤 2）。剪短缝合线末端。</li>
		<li>在颈总动脉远端打一个滑结（注意：不要过度收紧，因该结将在第6步中松开），并在两个已收紧的结之间打一个松散的滑结图4A，步骤 2。</li>
		<li>切开一个小切口（~ &#188; - &#8531; 用显微剪刀在颈总动脉（CCA）近端结扎处附近剪开约三分之一周长的小口图4A，步骤 3），并小心插入商用硅胶包被的 7-0 实心尼龙线栓（图4A，步骤4）。用中间的线固定此缝线，适度收紧（图4A，步骤5）确保切口无血液渗漏，且颈内动脉（ICA）的反流不会导致硅胶包被尼龙线栓移动，同时仍允许用镊子轻轻推动缝合线向颈外动脉（ECA）方向前进。</li>
		<li>松开上方（远端）的活结（图4A，步骤6）并将尼龙线推进至颈内动脉，直至其尖端超过分叉处9 mm（以缝线上银色标记作为参考）。扎紧上方两个滑结以固定缝线，防止血液反流。</li>
		<li>1 小时后撤出细丝（图4A，步骤7），并使用中间结扎线结扎CCA以防止出血（图4A，按步骤5-7的相反顺序操作，最终结果如步骤8所示）。松开上方的结。用4-0外科缝线关闭切口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大鼠MCAO手术（图4B)
	<ol>
		<li>在颈外动脉（ECA）下方放置两根编织的6-0尼龙缝线图4B，步骤1），并在远端尽可能远处打一个紧结（图4B，步骤 2）。</li>
		<li>在颈内动脉和颈总动脉上放置血管夹以阻断动脉血流（图4B，步骤3）。滑结可作为血管夹的替代方法。</li>
		<li>用显微剪刀在颈外动脉（ECA）上做一个小切口（图 4B，步骤3-4），插入商用硅胶包被的6-0尼龙线 filament（图4B，步骤5），并用滑结在ECA上妥善固定。</li>
		<li>松开 ICA 上的血管夹，将尼龙丝推进 ICA，直至银色标记（15 mm）到达分叉处图4B，步骤6），然后用2号缝线固定nd ECA 上的结（图4B，步骤 6。</li>
		<li>缺血1小时后，撤出该线栓并结扎切口以防止出血（图4B，步骤7），从颈总动脉（CCA）上移除血管夹（最终结果如步骤8所示），并用4-0外科缝线关闭切口。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 恢复
<ol>
	<li>卒中手术后，将动物置于加热垫上，直至其完全恢复意识。</li>
	<li>通过皮下注射给予镇痛药物。将动物放回饲养笼中，并可自由获取水和食物。</li>
</ol>
7. 动脉内注射
<ol>
	<li>用70%乙醇清洗整个导管，并浸泡过夜直至使用。注射前，将针头的鲁尔锁接头与无菌注射器连接，用10 mL无菌PBS冲洗导管系统的整个管腔侧。</li>
	<li>NSC注射的时间窗与准备 
	注意：根据经验及其他研究团队的报告，NSC注射的时间对于受试动物及外源性NSC的存活至关重要。在我们的初步研究中，早期时间点（再灌注后6小时内）注射NSC导致较高的死亡率。因此，我们测试了较晚的注射时间点，并确定卒中后2天（48小时）至3天（72小时）之间的时间窗对动物是安全且可耐受的，并能有效实现NSC在脑实质内的分布。本文所展示的结果均来自卒中后3天接受NSC注射的动物。
	<ol>
		<li>将注射泵的注射速率设定为小鼠20 µL/min，大鼠50 µL/min。注射速度过快或持续时间过长可能导致全身容量超负荷，小鼠比大鼠对此更为敏感。</li>
		<li>简言之，在卒中手术后第3天，用异氟烷麻醉动物，并将其仰卧于加热垫上。</li>
		<li>重新打开颈部切口，再次暴露ECA、ICA和CCA（图5，步骤1）。与卒中手术相同，根据物种确定注射路径：小鼠使用CCA进行NSC注射，大鼠使用ECA23。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过小鼠CCA进行动脉内注射
	<ol>
		<li>在CCA下方放置两根6-0编织尼龙缝线。在分叉处与前次卒中手术的下结扎点之间，每根缝线打一个松动的滑结（图5，步骤2）。</li>
		<li>收紧上方滑结，然后在下结扎点上方做一个小切口（图5，步骤3）。通过切口插入MRE010导管（图5，步骤4），并用中间结扎线固定，确保不阻塞注射流路（图5，步骤5）。松开上方结扎线并调整导管位置时，应可见导管内有血液回流。</li>
		<li>在ECA上放置血管夹，通过该导管以20 µL/min的速度在5分钟内注入1 × 106个GFP-NSC，随后以相同速度用50–100 µL PBS冲洗。</li>
		<li>注射完成后，用上方滑结在切口上方结扎CCA，并撤出MRE010导管（图5，步骤6）。收紧并修剪中间结和上方结。移除ECA上的血管夹。参见图5的最终图像（步骤7）。</li>
		<li>用4-0外科缝线关闭切口。</li>
		<li>在加热垫上充分恢复，并皮下注射镇痛剂后，将动物放回其原有笼具中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过大鼠ECA进行动脉内注射
	<ol>
		<li>用血管夹暂时阻断ECA和CCA（图5，步骤2）。</li>
		<li>在ECA近端做一小切口（图5，步骤3），插入MRE010导管，并用结扎线固定（图5，步骤4）。</li>
		<li>移除两个血管夹，使用电动注射泵以50 µL/min的速度在2分钟内注入5 × 106个NSC（溶于100 µL PBS中），随后以相同速度用50–100 µL PBS冲洗（图5，步骤5）。</li>
		<li>注射完成后，再次用血管夹阻断CCA和ECA，在撤出注射导管后，于第二切口近端结扎ECA（图5，步骤6）。</li>
		<li>移除两个血管夹（图5，步骤7），并用4-0外科缝线关闭切口。</li>
		<li>在加热垫上充分恢复，并皮下注射镇痛剂后，将动物放回其原有笼具中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织学检测
	<ol>
		<li>在注射NSC或载体溶液后，对接受缺血性卒中建模的大小鼠实施安乐死，并经心灌注4%多聚甲醛，随后采集其脑组织，分别于注射后1天（大小鼠）、7天（小鼠）和30天（小鼠）进行取材。这四个组每组均包括5只注射NSC和5只注射载体的动物。</li>
		<li>将脑组织固定过夜，并在30%蔗糖中冷冻保存3天。</li>
		<li>将脑组织包埋于OCT中，切片&#160;厚度为40 µm，通过免疫染色检测NSC的分布情况，所用细胞特异性标记物包括胶质纤维酸性蛋白（GFAP，星形胶质细胞）、Tuj1（成熟神经元）和双皮质素（DCX，未成熟神经元）。 
		注意：由于缺乏表达GFP的大鼠品系，我们使用DiI（一种短暂的荧光标记物）标记大鼠NSC，该标记仅支持相对较短时间的观察。因此，大鼠NSC的分布仅在卒中后1天进行检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Microsurgery+Infusion+Technique+for+Targeted+Substance+Delivery+into+the+CNS+via+the+Internal+Carotid+Artery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2017).</li>
<li>Chua, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-arterial+injection+of+neural+stem+cells+using+a+microneedle+technique+does+not+cause+microembolic+strokes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).</li>
<li>Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Devices+for+cell+transplantation+into+the+central+nervous+system%3A+Design+considerations+and+emerging+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Neurology+International%22%5BJournal%5D)">Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies.</a> Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).</li>
<li>Duma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intracerebroventricular+%28ICV%29+injection+of+autologous%2C+non-engineered%2C+adipose-derived+stromal+vascular+fraction+%28ADSVF%29+for+neurodegenerative+disorders%3A+results+of+a+3-year+phase+1+study+of+113+injections+in+31+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients.</a> Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).</li>
</ol>

干细胞治疗神经系统疾病仍处于早期探索阶段。其中一个主要问题是，目前尚无成熟的方法能够将干细胞（SCs）或神经干细胞（NSCs）充分递送至大脑。
尽管通过静脉（IV）、腹腔（IP）或脑实质/脑内注射后可在脑内检测到外源性施万细胞（SCs）/神经干细胞（NSCs），但每种递送方式均存在局限性。通过外周注射（IV或IP）后，脑内可检测到的细胞数量估计极低，仅占注射或输注细胞的一小部分。脑内注射则导致分布极为局限，并可能直接引起脑损伤2,6,7,8,9,10,11,12</...

干细胞（SC）疗法在治疗脑卒中、头部外伤和痴呆等神经系统疾病方面具有巨大潜力1,2,3,4,5,6。然而，如何高效地将外源性干细胞递送至病变脑组织仍是一个难题2,6,7,8,9,10,11,12,13。通过外周途径（如静脉注射（IV）或腹腔注射（IP））递送的干细胞会受到微循环中的首过清除效应影响，尤其是在肺、肝、脾和肌肉中8,9,13,14，从而增加细胞在非靶向区域积聚的风险。侵入性的脑内注射方法则会导致局部脑组织损伤，并且干细胞在注射部位附近的分布范围极为有限2,6,8,14,15,16。我们近期建立了一种基于导管的动脉内注射方法，用于递送外源性神经干细胞（NSCs），本文描述了该方法在局灶性缺血性脑卒中啮齿类动物模型中的应用。我们使用涂有硅胶的细丝阻塞小鼠或大鼠左侧大脑中动脉（MCA），从而在一侧大脑半球诱导短暂（1小时）的缺血-再灌注损伤17,18,19。在此模型中，通过激光多普勒或激光散斑成像技术可重复观察到同侧半球脑血流量（CBF）下降约75–85%17,19，并产生稳定的神经功能缺损17,18,19。
为节省时间，视频以正常速度的两倍播放，并且未展示皮肤准备、缝合伤口等常规外科操作，以及电动注射泵的使用和设置过程。神经干细胞（NSCs）的动脉内递送方法是在啮齿类动物实验性脑卒中模型——大脑中动脉闭塞（MCAO）模型背景下进行演示的。因此，我们包含了短暂性缺血性脑卒中手术步骤，以便后续在同一动物先前手术部位的基础上，展示如何实施第二次手术，即动脉内注射。通过评估外源性神经干细胞在体内的分布与存活情况，验证了在啮齿类脑卒中模型中进行动脉内NSC递送的可行性。NSC治疗减轻脑部病理改变和神经功能障碍的有效性将另行报道。

<table><tbody><tr><td>20 G 针头</td><td>Becton &amp;amp; Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305175</td><td>注射导管制备</td></tr><tr><td>26 G 针头</td><td>Becton &amp;amp; Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305111</td><td>注射导管制备</td></tr><tr><td>27 G 针头</td><td>Becton &amp;amp; Dickinson</td><td>BD PrecisionGlide 305136</td><td>注射导管制备</td></tr><tr><td>4-0 NFS-2 缝合线（带针）</td><td>Henry Schein 动物健康</td><td>56905</td><td>手术</td></tr><tr><td>6-0 尼龙缝合线</td><td>Teleflex/Braintree Scientific</td><td>104-s</td><td>手术</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7922</td><td>细胞解离溶液</td></tr><tr><td>刀片</td><td>Bard-Parker</td><td>10</td><td>手术</td></tr><tr><td>Buprenorphine-SR Lab</td><td>ZooPharm</td><td>Buprenorphine-SR Lab&amp;reg;</td><td>镇痛（0.6–1 mg/kg，持续 3 天）</td></tr><tr><td>无钙/镁 PBS</td><td>VWR</td><td>02-0119-0500</td><td>神经干细胞解离</td></tr><tr><td>DCX 抗体</td><td>Millipore</td><td>AB2253</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>GFAP 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>180063</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein 动物健康</td><td>50562-1</td><td>手术</td></tr><tr><td>小鼠用 MCAO 线栓</td><td>Doccol</td><td>702223PK5Re</td><td>手术</td></tr><tr><td>大鼠用 MCAO 线栓</td><td>Doccol</td><td>503334PK5Re</td><td>手术</td></tr><tr><td>MRE010 导管</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE010</td><td>注射导管制备</td></tr><tr><td>MRE025 导管</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE025</td><td>注射导管制备</td></tr><tr><td>MRE050 导管</td><td>Braintree Scientific</td><td>MRE050</td><td>注射导管制备</td></tr><tr><td>Nu-Tears 眼膏</td><td>NuLife Pharmaceuticals</td><td>Nu-Tears Ointment</td><td>术中眼部护理</td></tr><tr><td>S&amp;amp;T 镊子 - SuperGrip 尖端 JF-5TC 角形</td><td>Fine Science Tools</td><td>00649-11</td><td>手术</td></tr><tr><td>S&amp;amp;T 镊子 - SuperGrip 尖端 JF-5TC 直形</td><td>Fine Science Tools</td><td>00632-11</td><td>手术</td></tr><tr><td>超级胶水</td><td>Pacer Technology</td><td>15187</td><td>注射导管制备</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Kent Scientific</td><td>GenieTouch</td><td>手术</td></tr><tr><td>Tuj1 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAb1637</td><td>免疫染色</td></tr><tr><td>双组分 5 分钟环氧树脂</td><td>Devcon</td><td>20445</td><td>注射导管制备</td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>手术</td></tr><tr><td>血管夹</td><td>Fine Science Tools</td><td>00400-03</td><td>手术</td></tr><tr><td>蔡司显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axio Imager 2</td><td>显微成像</td></tr></tbody></table>

向大鼠和小鼠脑内动脉内递送神经干细胞：应用于脑缺血

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

神经干细胞（NSC）治疗是一种针对脑卒中、创伤性脑损伤及神经退行性疾病新兴的创新疗法。与颅内给药相比，经动脉途径注射NSC侵入性更小，且能使神经干细胞在脑实质内实现更广泛的分布。此外，动脉内给药可利用脑循环的首过效应，减少细胞在肝脏和脾脏等外周器官中的滞留风险，而外周注射常伴随此类并发症。本文详细描述了在小鼠和大鼠中，通过颈总动脉（小鼠）或颈外动脉（大鼠）向缺血性脑卒中后同侧半球输送NSC的方法。通过使用GFP标记的NSC，我们展示了在缺血后1天、1周和4周时，NSC在啮齿类动物同侧半脑中广泛分布的情况，其中在缺血损伤区域内部或附近密度更高。除了长期存活外，我们在4周时还观察到了GFP标记细胞分化的证据。本文所述的NSC经动脉给药方法也可用于递送治疗性化合物，因此在多种物种的不同中枢神经系统损伤和疾病模型中具有广泛的应用前景。

在缺血性脑组织中可轻易检测到GFP标记的NSCs，主要位于同侧半球，尤其是半暗带区域及损伤边缘（图6）。成像与分析过程中，观察者处于单盲状态。
例如，在注射后第1天，可在小鼠海马体内检测到神经干细胞（NSCs）。即使在此早期时间点，部分神经干细胞在齿状回中也显示出与未成熟神经元标志物DCX共表达（图6A）。
在卒中后第10天（NSC注射后第7天），在纹状体和皮层的损伤边缘区（分水岭区域）观察到外源性GFP-NSCs密度最高（图6B）。值得注意的是，在注射后7天，许多GFP-NSCs也开始表达DCX（由蓝色圆圈标示），表明其向神经元方向分化。与接受载体溶液注射的动物相比，NSC注射还增加了同侧半球的DCX染色（红色）信号。
注射后30天，仍可在损伤皮层中检测到神经干细胞，其中部分细胞表现出胶质细胞...

本文报道了一种通过小鼠颈总动脉或大鼠颈外动脉在缺血性脑卒中后递送神经干细胞的方法，该方法适用于注射溶液或悬浮液。注射后的细胞广泛分布于脑实质中，并可在递送后长达30天内被检测到。

神经干细胞（NSC）疗法是一种针对中风、创伤性脑损伤和神经退行性疾病新兴的创新治疗方法。与……相比，

脑卒中是全球范围内导致死亡和残疾的首要原因。尽管在部分患者中可采用溶栓治疗和手术清除脑血管阻塞，但仍迫切需要有效的脑卒中治疗方法。在此，我们展示了一种基于导管的动脉内干细胞输送方法，将其作为脑卒中治疗的一种潜在方案，用于向缺血半球输送干细胞。首先，我们介绍如何制备注射导管和手术钩。我们设计了两种类型的注射导管用于动脉内注射。设计一适用于注射无需冲洗管路的溶液或混悬液。设计二允许先注射神经干细胞，然后冲洗死体积以输送全部体积。要制作一套注射导管，您需要26号和20号针头、一段10至15厘米长的MRE 25导管，以及两段各3厘米长的MRE 50和MRE 10导管。剪去两种针头的尖端，并在砂纸上打磨金属末端，以重新打开管腔并使边缘光滑，然后用蒸馏水冲洗，以清洁内腔并去除碎屑。图中显示的是剪去针尖后的20号针头的闭合端，经抛光后重新打开形成光滑内孔。在显微镜下，将20号针头插入MRE 50导管末端。弯曲26号针头，然后刺入20号针头尖端下方的导管。用超级胶水固定26号针头。然后将两个针座和导管用环氧树脂包埋，形成一个坚固的整体以增强强度。您还需要三个外科钩子来固定组织位置，以便更好地暴露手术区域。从27号针头截取一段1.5至2厘米长的针轴，用砂纸将两端打磨至钝。使用小型止血钳将针轴一端弯成钩状，另一端弯成环状。将一根10至15厘米长的MRE 25导管穿过环状端，并用透明手术胶带固定。使用相同方法再制作两个钩子。钩子和导管系统应浸泡在70%乙醇中过夜以进行消毒。所有涉及动物实验的操作均经肯塔基大学机构动物护理与使用委员会批准。我们使用表达GFP的胚胎小鼠脑组织来培养GFP阳性神经干细胞。在荧光显微镜的FITC通道下，GFP阳性胚胎可被清晰观察到，而野生型胚胎在相同曝光条件下无荧光信号。野生型胚胎的自发荧光仅在曝光时间增加100倍时才可见。收集胚胎皮层，并根据制造商说明书建立神经干细胞培养物。这些神经干细胞能够形成神经球，并可传代超过10代，且能够分化为胶质细胞和神经元。诸如 nanog、SSEA1、Oct4 和 Sox3 等胚胎干细胞标志物的检测可用于鉴定神经球中的干细胞特性。神经球按照试剂盒说明书提供的方案在培养基中培养，并在第3至第5代之间用于神经干细胞移植。通过采用基于尼龙丝线的改良大脑中动脉阻塞（MCAO）方法，在小鼠和大鼠的左侧大脑半球诱导缺血性脑卒中，具体操作根据物种不同略有调整。在小鼠中，将线栓经由颈总动脉（CCA）插入，并推进至颈内动脉（ICA）。而在大鼠中，由于操作空间较大，线栓则通过颈外动脉（ECA）进入ICA。本文演示小鼠的手术操作。沿颈部正中线切开后，使用钝性分离法分离下方组织。使用由27号针头制成的三个显微外科钩以获得更好的视野。黑色方框指示下一步手术区域。仔细切开左侧颈总动脉（CCA）上方的肌层，以暴露左侧颈总动脉及迷走神经。沿颈总动脉走行

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神经干细胞向大鼠和小鼠大脑的动脉内传递:对脑缺血的应用

本方案描述了一种非病毒性方法，用于将遗传载体递送至活体啮齿类动物大脑的特定区域。该方法包括质粒制备、微移液管制作、新生大鼠幼崽手术、载体的微量注射以及 体内...

通过非脑室途径质粒注射与电穿孔法向新生大鼠脑组织递送基因

本方案中描述的小鼠自体血注射脑出血模型采用双次注射技术，以最大限度降低血液沿针道反流的风险，泵系统中不使用抗凝剂，并且消除了系统中的所有死腔和可扩张的管路。...

自体血注射法建立小鼠自发性脑内出血模型

大脑中动脉（MCA）结扎是一种用于在动物模型中研究局灶性脑缺血的技术。该方法通过开颅暴露大脑中动脉，并采用电凝法进行结扎。与其他现有方法相比，该技术可获得高度可重复的梗死体积，并提高术后存活率。...

小鼠永久性大脑中动脉结扎的应用

脑出血的临床前模型用于模拟临床疾病的某些方面，从而可研究损伤机制及潜在的治疗策略。本方案中描述了两种脑出血模型，即自体血或胶原酶注入纹状体（基底节）。...

纹状体内注射自体血或梭状芽胞杆菌胶原酶作为脑内出血的小鼠模型

本文描述了对出生后第1至第8天的幼鼠或幼大鼠进行短暂间歇性缺氧处理的方法。该方法可有效诱导在缺氧暴露后30分钟内获取的培养神经前体细胞产生显著的组织水平“启动效应”。...

递送 体内 新生啮齿类动物急性间歇性低氧处理以启动侧脑室下区来源的神经前体细胞培养

为了研究病理条件下大脑的重组，我们使用微型渗透泵将蛋白质直接递送至大脑，从而绕过血脑屏障。随后注射示踪剂，以研究在该蛋白质影响下大脑连接性的改变。...

在病理生理条件下研究大脑重组的微型渗透泵植入与示踪剂递送

由于干细胞具有内在的肿瘤趋向性，它们作为治疗脑肿瘤的载体具有广阔前景。非侵入性的经鼻干细胞递送可绕过血脑屏障，在临床转化方面展现出巨大潜力。本文总结了在胶质瘤小鼠模型中经鼻干细胞递送的基本原理。...

小鼠模型中通过鼻内递送治疗性干细胞至胶质母细胞瘤

本文介绍了一种通过将导管植入大鼠脊柱腰段鞘内空间，向其中枢神经系统递送药物的方法。我们重点阐述反义寡核苷酸的递送，但该方法同样适用于其他治疗方式的给药。...

大鼠中枢神经系统中反义寡核苷酸的鞘内递送

干细胞作为心肌损伤患者的潜在治疗方法正不断被研究，然而，其在受损组织中的存活率和滞留率降低可能影响其长期疗效。在本研究中，我们描述了一种在小鼠缺血再灌注损伤模型中递送干细胞的替代方法。...

小鼠模型中缺血再灌注损伤后延迟的心肌内干细胞递送

在小鼠模型中，颈内动脉注射后对其进行修复可恢复动脉血流，且不会对注射物质的分布产生负面影响。注射部位的修复有利于通过同一条动脉进行后续注射，并可防止在缺乏完整威尔氏环的小鼠品系中发生脑缺血。...

通过一种新型注射位点修复技术实现小鼠模型颈动脉重复注射

了解通过颈动脉向大鼠和小鼠脑缺血模型动脉内递送神经干细胞的方法。该技术可实现细胞在脑内广泛分布并存活长达30天，为中风治疗提供潜在方案。

向大鼠和小鼠脑内动脉内递送神经干细胞：应用于脑缺血

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