蝙蝠主要组织相容性复合体I类分子与异源β₂-微球蛋白结合后的稳定性与结构研究

本研究以蝙蝠MHC I类分子为模型，总结了相关方法，并评估了异源β-2微球蛋白与MHC I类分子形成的杂合复合物的可行性。先前的研究表明，哺乳动物B2M的替换对肽段呈递的影响不显著。事实上，这种杂合MHC I类分子能够形成与原始分子相似的结构和功能，并可被有效激活。

这些技术可用于促进在感染性疾病和肿瘤免疫治疗期间对 MHC I 分子的功能和结构研究，以评估组织反应。进行大肠杆菌培养转化时，将 10 纳克含有蝙蝠或人类 MHC I 类分子 β2-微球蛋白重链的质粒加入 100 微升均质悬浮液中，并将悬浮液置于冰上孵育 30 分钟。孵育结束后，在 42 摄氏度下对细菌进行 90 秒的热激处理，然后将菌液重新放回冰浴中冷却 2 分钟。

接着向培养物中加入 800 µL 的 LB 培养基（Lysogeny broth），并在 37 °C、200 rpm 条件下于摇床中振荡悬浮液 20 分钟。孵育结束后，取 100 µL 菌液涂布于含有相应抗生素的培养平板上。次日清晨，挑取一个新近转化的单菌落，接种至 3 mL 含抗生素的 LB 培养基中。

将培养物置于37摄氏度的摇床上，振荡培养12至16小时。次日早晨，取500 µL活化后的菌种加入含抗生素的50 mL LB培养基中，重新放入摇床过夜培养。将剩余的活化菌种分装为每份500 µL，分别加入等体积（500 µL）的40%甘油溶液中，用于-80摄氏度保存。

为了大量制备重组蛋白，次日早晨将细菌悬液以1:100的比例转接到两升含抗生素的LB培养基中，并将培养物放回摇床培养箱，直至其在600纳米处的吸光度达到0.6。随后，向培养物中加入1毫摩尔的IPTG以诱导目的基因的表达。诱导4至6小时后，将细菌培养物转移至离心瓶中进行离心，每瓶用60毫升PBS重悬细菌细胞沉淀。

然后使用超声波细胞破碎仪处理99次，每次超声6秒，间隔12秒，功率为300瓦，以释放表达的重组蛋白。为纯化包涵体，将超声处理后的细菌通过离心收集，并将沉淀重新悬浮于适量洗涤缓冲液中，再进行两次离心。第二次洗涤后，将包涵体重新悬浮于重悬缓冲液中，并保留20微升样品作为 aliquot，用于SDS-PAGE检测包涵体纯度。

将剩余样品离心，并称量含有包涵体的沉淀。向沉淀中加入溶解缓冲液，使包涵体的终浓度为每毫升缓冲液含30毫克。然后在4°C下使用磁力搅拌器缓慢搅拌溶液，直至包涵体完全溶解于溶解缓冲液中。

弃去沉淀后，将包涵体在零下20或零下80摄氏度保存。进行MHC复合物复性时，在250至300毫升、4摄氏度的复性缓冲液中加入5毫摩尔还原型谷胱甘肽和0.5毫摩尔氧化型谷胱甘肽，并在4摄氏度下用磁力搅拌器缓慢搅拌10至20分钟。

对于MHC重链和β2微球蛋白的稀释，将包涵体加载至1毫升注射器中，并将1毫升包涵体溶液全部注入靠近搅拌棒的1升复性缓冲液中，以实现快速而有效的稀释。接下来，将肽段溶解于二甲基亚砜中，浓度为5毫克/毫升，并迅速将200微升肽段溶液注入复性液中，操作方式如前所述。在缓慢搅拌10至20分钟后，将3毫升重链包涵体注入新的1升复性缓冲液中，并在4°C下继续复性8至10小时。

为测定复性后蛋白质浓度，将置换缓冲液加入含有10千道尔顿多铜氧化酶膜的加压室中，并将缓冲液浓缩至30至50毫升体积。将复性溶液转移至离心管中，通过离心去除沉淀物。小心地将上清液转移至加压室中，进一步浓缩缓冲液至最终体积约1毫升。

通过离心去除任何残留的污染物，并将上清液转移至无菌管中。使用10/300 GL尺寸排阻柱纯化蛋白质，在洗脱峰处收集样品，并通过SDS-PAGE进行分析。收集MHC复合物的峰馏分，并将蛋白质浓缩至终浓度为15毫克/毫升。

然后将复合物稀释至7.5毫克/毫升的浓度。为了利用悬滴蒸汽扩散法对MHC-肽复合物进行结晶，取0.8微升样品加入商业化的结晶板中，并密封结晶板。将样品溶液与100微升储液在4或18摄氏度下进行平衡，并在接下来的六个月内定期使用显微镜观察晶体生长情况。

为了进行低温保护，在实验结束时，将晶体转移至含有20%甘油的储存溶液中，然后在100开尔文的气态氮气流中迅速冷却样品。随后根据标准流程收集X射线衍射数据。为了确定晶体复合物的结构，使用HKL-2000软件包中的Denzo程序打开高分辨率X射线衍射数据，并在蛋白质数据库中选择一个初始模型。

为了确定蛋白质的结构，将数据在 CCP4 的 Phaser MR 程序中打开，并使用优化后的 X 射线模型进行初始联合精修。然后分别使用 Phoenix refine 的单独模式进行 X 射线单独精修，以及联合中子与 X 射线的联合精修。每轮精修后，需在 Coot 中手动将模型与 Fo-Fc 和 2Fo-Fc 正电子密度图进行比对检查。

在这些代表性实验中，评估了源自亨德拉病毒的亨德拉病毒肽与蝙蝠MHC I类重链在分别结合同源蝙蝠β2-微球蛋白和异源人β2-微球蛋白情况下的结合能力。在两种分析中，均通过与β2-微球蛋白轻链复性形成了高分辨率晶体。在缺乏β2-微球蛋白的情况下，这些复合物无法形成。

在MHC I类分子重链与亨德拉病毒一、人源β2微球蛋白的结构中，人源β2微球蛋白的保守残基H31、D53、W60和Y63（对应于蝙蝠β2微球蛋白）与肽结合槽底部发生接触，而保守残基Q8、Y10、R12和24（对应于结合在α3结构域上的β2微球蛋白）也参与相互作用。在整体的蝙蝠与人源结构中，在所有碳α原子叠加的情况下，重链残基1至184的平均均方根偏差为0.248，表明这两个复合物之间无显著差异。肽段排列结构显示，亨德拉病毒一的肽段在这两个复合物中的构象非常相似。

序列比对还显示，不同物种的β2微球蛋白氨基酸序列高度保守。提供具有高报告效率的拮抗复合物非常重要。因此，选择合适的β2微球蛋白并使用高纯度的包涵体至关重要。

该方案可用于通过其他物种中潜在的β2微球蛋白替换来获得稳定的MHC I复合物，并用于研究MHC I的结构与功能。这些研究获得的数据可用于评估感染性疾病和肿瘤免疫治疗过程中的T细胞应答。