Name: 使用随机微种子基质筛选与 I3C 的蛋白质晶体的衍生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: 学习利用随机微种子基质筛选技术优化蛋白质晶体生长，同时使用I3C作为重原子衍生物进行X射线晶体学相位解析。该方法可显著提高晶体质量并简化结构测定流程。

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本研究在澳大利亚核科学技术组织（ANSTO）所属的澳大利亚同步辐射装置MX1光束线上开展。作者谨此感谢Shearwin实验室和Bruning实验室成员就本研究工作的讨论与建议。作者同时感谢Santosh Panjikar博士和Linda Whyatt-Shearwin博士，他们为开创本实验方案的原始研究做出了贡献。
感谢以下资助：澳大利亚研究理事会（资助编号 DP150103009 和 DP160101450，授予 Keith E. Shearwin）；阿德莱德大学（澳大利亚政府研究培训计划津贴奖学金，授予 Jia Quyen Truong 和 Stephanie Nguyen）。

1. 实验设计与注意事项
<ol>
	<li>使用已有蛋白质晶体，最好通过气相扩散结晶法获得。有关气相扩散结晶的通用实验方案，请参见 Benvenuti 和 Mangani34。其他结晶方法（如油下微批量法和自由界面扩散法）在研磨产生微晶种前需先收获晶体。</li>
	<li>在制备晶种储备液时，应选用可牺牲的最高质量晶体。晶体质量可通过形态学外观进行目视判断，或在有相关数据时选择衍射效果最佳的晶体。通过晶种优化后，很可能获得质量更优的晶体。若无晶体可用，也可使用晶状沉淀物（如球晶和针状物）代替。</li>
	<li>识别盐晶体。盐晶体可在结晶筛选过程中形成，外观可能与蛋白质晶体相似。在重复微晶种（rMMS）实验中使用盐晶体会毫无益处，并浪费珍贵样品，因此排除盐类假阳性至关重要。
	<ol>
		<li>盐晶体在研磨时会发出响声。由于必须研磨晶体以制备晶种储备液，此方法尤为适用。若研磨晶体时听到明显的爆裂声，则该晶体很可能是盐晶体。</li>
		<li>若蛋白质含有色氨酸&#160;和酪氨酸残基，可利用紫外荧光显微镜观察在该照明条件下发出荧光的蛋白质晶体，以区分于盐晶体。</li>
		<li>使用 Izit 染料（亚甲蓝）对蛋白质晶体进行染色，使其与基本不着色的盐晶体区分开来。但该方法更具破坏性，仅建议在有来自同一液滴重复实验的多余晶体时使用。 
		注意：尽管上述检测方法可能提供有希望的结果，盐晶体仍可能被误判为蛋白质晶体。此时可通过衍射实验明确区分蛋白质晶体与盐晶体。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 碘化锂 I3C 储备液的制备
<ol>
	<li>将120 mg的I3C（5-氨基-2,4,6-三碘异苯二甲酸）称量至1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>用200 µL的2 M氢氧化锂溶解I3C。可使用40–60 °C的加热块轻微加热以促进溶解。所得的碘化锂I3C溶液应呈棕色，浓度为1 M。 
	注意：氢氧化锂具有腐蚀性，应佩戴安全眼镜、手套和实验服。</li>
	<li>测量溶液的pH值。如有必要，加入少量1 M盐酸或2 M氢氧化锂，将pH值调节至7–8之间。加入超纯水，使最终溶液体积达到400 µL。此时I3C储备液的浓度为0.5 M。 
	备注：步骤2.3为可选步骤。在调节pH前，溶液pH值应处于7–8范围内。若目标蛋白对pH值高度敏感，则应执行此步骤。此处可暂停实验流程。碘化锂I3C可在避光条件下于4 °C保存至少两周35。</li>
</ol>
3. 向蛋白质储备液中添加 I3C
<ol>
	<li>方法 1
	<ol>
		<li>将储备液碘化锂 I3C 加入目标蛋白的 150 µL 等分试样中。最终碘化锂 I3C 浓度应在 5–40 mM 之间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>方法 2（较温和的方法）
	<ol>
		<li>配制一种与目标蛋白缓冲液相匹配的蛋白稀释缓冲液。向该稀释缓冲液中加入储备液碘化锂 I3C，使碘化锂 I3C 浓度达到 10–80 mM。</li>
		<li>用蛋白稀释缓冲液以 1:1 的比例稀释蛋白，使碘化锂 I3C 的最终浓度在 5–40 mM 之间。 
		注意：某些蛋白在方法 1 中接触高浓度碘化锂 I3C 时会发生沉淀，而其他蛋白则可耐受。方法 2 可降低沉淀发生的可能性。然而，该方法会使蛋白浓度减半。对于尚无既定结晶方案的蛋白，通常建议初始结晶筛选时蛋白浓度为 10 mg/mL。建议初始 I3C 与蛋白的摩尔比为 8。在初步筛选后，可进一步优化蛋白浓度及 I3C 与蛋白的摩尔比。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 制备种子液
<ol>
	<li>制作用于压碎晶体的圆头探针。
	<ol>
		<li>使用本生灯的蓝色火焰，加热巴斯德吸管的中部。用镊子夹住巴斯德吸管的一端，将其拉伸至直径小于0.3 mm的细丝状。</li>
		<li>当中段足够细时，将该部分保持在火焰中，使吸管在此处断开，并将断端熔融成圆滑形状，完成玻璃探针的制作。 
		注意：市售有第三方供应商提供的圆头探针晶体压碎工具，可作为自制圆头探针的替代方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将五个1.5 mL微量离心管置于冰上预冷。</li>
	<li>在光学显微镜下检查结晶板，选择适合生成微晶的条件。理想情况下应选择形态良好、尺寸较大的晶体，但该技术同样适用于形态较差的晶体、针状晶体、片状晶体、微晶及球晶。</li>
	<li>打开结晶板的孔位。对于用塑料密封的96孔结晶板，使用手术刀切开密封孔位的塑料膜；对于用油脂密封的悬滴板，可用镊子取下盖玻片并倒置放在平整表面上。</li>
	<li>将70 µL储液转移至一个微量离心管中，并在冰上冷却。向其余微量离心管中各加入90 µL储液，随后放回冰上预冷。 
	注意：若储液体积不足或不存在（如油下微批量法），可通过混合相应试剂配制结晶储液。</li>
	<li>使用晶体探针在液滴中搅动晶体，彻底将其压碎。晶体需完全破碎，可通过显微镜观察确认破碎程度。</li>
	<li>将液滴中的全部液体移出，并转移至含有储液的微量离心管中。混匀后，从中取出2 µL混合液加回原孔中，用该溶液冲洗孔位，再将冲洗液转移回微量离心管。重复此冲洗步骤一次。此后，始终保持微量离心管处于低温状态，以防止混合物中的微晶种子融化。</li>
	<li>在4 °C条件下以最大速度涡旋震荡该离心管3分钟，期间定期将管子放回冰上冷却，防止过热。 
	注意：某些微晶接种方案会在微量离心管中加入聚四氟乙烯种子珠以辅助晶体破碎7,36。我们已在不使用种子珠的情况下成功应用该技术，但也认为使用种子珠破碎晶体并无问题。</li>
	<li>通过依次将10 µL混合液转移至预冷的储液中，对种子储备液进行1:10的系列稀释。</li>
	<li>未立即使用的种子储备液应储存于-80 °C。</li>
</ol>
5. 设置 rMMS 筛选实验
<ol>
	<li>使用液体分配机器人设置96孔筛选板。若无机器人，也可使用多通道移液器。
	<ol>
		<li>从深孔块中转移75 µL至96孔结晶板。向结晶液滴中加入1 µL，向储液池中加入74 µL。</li>
		<li>将步骤2中制备的含碘化锂I3C的蛋白质溶液取1 µL加入结晶液滴中。</li>
		<li>将0.1 µL的晶种原液转移至结晶液滴中。</li>
		<li>用透明封口胶带密封板子，并在恒定温度下孵育以促进晶体生长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置悬滴结晶筛
	<ol>
		<li>在悬滴孔边缘涂抹封口油（悬滴结晶板有24孔和48孔两种规格）。</li>
		<li>将500 µL结晶溶液转移至储液池中。</li>
		<li>在玻璃盖玻片中央附近，放置1 µL步骤2中制备的含碘化锂I3C的蛋白质溶液。</li>
		<li>向该液滴中加入1 µL结晶溶液。</li>
		<li>将0.1 µL晶种原液转移至结晶液滴中。</li>
		<li>将盖玻片翻转，并通过将其压入封口油中以密封结晶孔。</li>
		<li>在恒定温度下孵育板子，以促进晶体生长。 
		注意：对于新制备且未经测试的晶种原液，建议使用最高浓度的晶种原液，以最大化获得结晶的成功率。后续可使用较低浓度的晶种进行条件优化，以调节晶体数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定期在显微镜下检查结晶板中的晶体生长情况。若晶体质量足够高，即可收获用于数据采集。晶体还可用于制备新的晶种原液及新的rMMS筛，以实现迭代优化。</li>
</ol>
6. 数据采集
<ol>
	<li>使用冷冻环收集晶体，对晶体进行冷冻保护，并在液氮中快速冷却。有关晶体快速冷却的更多信息，请参见 Teng37 和 Garman 与 Mitchell38。
	<ol>
		<li>在冷冻保护过程中，若将晶体转移至新的水溶液中，I3C 可能因渗入冷冻保护液而从晶体中流失。可在冷冻保护液中加入碘化锂 I3C，其浓度应与结晶条件一致，以减轻此现象。</li>
		<li>本实验方案所获得的晶体已成功使用基于 Parabar 10312 油的冷冻保护剂（Hampton Research）进行冷冻保护。 
		注：晶体可在液氮中储存，实验可在此处暂停。 
		警告：液氮可导致冻伤。在密闭空间中使用液氮还可能导致窒息。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将晶体安装至X射线源测角仪上，并根据X射线源的具体方案收集衍射数据。</li>
	<li>该技术依赖于 I3C 中碘原子的反常散射信号。因此，应选择能够最大化该信号的X射线能量。
	<ol>
		<li>对于能量可调的同步辐射X射线源，应将其设置为尽可能低的能量。对于多数大分子晶体学光束线，最低可配置能量为 8000 至 8500 eV。</li>
		<li>旋转阳极X射线源无法调节能量。常用的铜阳极源其Kα吸收边位于 8046 eV，可为碘提供良好的反常散射信号（f&#34; = 6.9 e）。铬阳极源的Kα吸收边位于 5415 eV，可为碘提供更强的反常散射信号（f&#34; = 12.6 e）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在数据收集中，辐射损伤是一个显著问题，因其会削弱反常散射信号39。应选择适当的曝光时间和光束衰减，以在最小化辐射剂量的同时获得最佳衍射效果。 
	注：在一种类似相位化合物中，若以溴原子替代碘原子，已证实辐射损伤会导致碳-溴键的辐射分解，并降低溴原子的占据率24。
	<ol>
		<li>采用反向束SAD数据收集策略。数据以扇区形式收集，相邻扇区按相反角度顺序依次收集。该方法可使Friedel对在等剂量条件下被测量，从而提高反常信号的测定精度，并减少辐射损伤的影响。例如，采用八扇区策略收集360°数据时，其收集顺序为：扇区1（0°–45°）、扇区2（180°–225°）、扇区3（46°–90°）、扇区4（225°–270°）、扇区5（90°–135°）、扇区6（270°–315°）、扇区7（135°–180°）和扇区8（315°–360°）。 
		注：连续旋转是反向束数据收集策略的一种替代方法。有关不同数据收集策略的近期比较，请参见 Garcie-Bonte &amp;#38; Katona40。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 数据处理与结构解析
<ol>
	<li>使用 XDS41 对衍射数据进行数据约简，目标是最大化反常信号。数据约简的输入参数因数据集而异，可能需要进行若干次尝试和调整。以下是一些起始建议：
	<ol>
		<li>设置 FRIEDEL'S LAW=FALSE。执行两次 CORRECT，&#160;分别设置 STRICT_ABSORPTION_CORRECT = TRUE 和 STRICT_ABSORPTION_CORRECT = FALSE。其中一次运行可能比另一次产生更强的反常信号。通过输出中的“Anomal Corr”和“SigAno”指标比较两次运行的反常信号，这可作为数据质量的参考指标。</li>
		<li>对 XDS_ASCII.HKL 文件运行 SHELXC，以更准确地评估反常信号。“Ranom”指标将显示在不同分辨率下的反常信号强度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行 POINTLESS42 和 AIMLESS43 对数据进行标度处理。在 AIMLESS 中，设置参数 ANOMALOUS ON。如果使用图形界面，选择选项 Separate anomalous pairs for outlier rejection and merging statistics。可能需要测试不同的分辨率截断值，以最大化反常信号。</li>
	<li>使用 Auto-Rickshaw 自动晶体结构解析流程44 求解蛋白质结构。Auto-Rickshaw 将尝试解决相位问题，并利用蛋白质建模与精修软件自动构建蛋白质的晶体结构。
	<ol>
		<li>对于没有同源模型模板的蛋白质，在高级模式下运行 Auto-Rickshaw 的 SAD 协议。输入所需参数。
		<ol>
			<li>选择 PROTEIN 作为分子类型。</li>
			<li>输入以埃（Å）为单位的数据收集波长。</li>
			<li>选择 &#34;I&#34; 作为子结构元素，表示使用了碘原子。</li>
			<li>选择 &#34;i3c&#34; 作为子结构类型，表示 I3C 是用于相位测定的分子。</li>
			<li>选择 &#34;sub_direct&#34; 作为子结构测定方法。该方法使用 SHELXD32 搜索子结构。</li>
			<li>选择 &#34;3&#34; 作为每个单体中预期的子结构数量。</li>
			<li>输入 &#34;1&#34; 作为子结构搜索的分辨率截断值。这将允许 Auto-Rickshaw 自动确定合适的分辨率截断值。</li>
			<li>输入单个单体中的残基数、数据集的空间群，以及根据 Matthews 系数确定的非对称单元中的分子数。</li>
			<li>选择适当的 X 射线数据公开级别以满足需求。选择 &#34;AutoRickshaw developers&#34; 可在出现问题时允许 Auto-Rickshaw 开发人员协助排查故障。</li>
			<li>以 mtz 文件格式输入反常数据。</li>
			<li>以 seq、pir 或 txt 文件格式输入蛋白质序列。可在文本编辑器（如 Windows 上的 Notepad++9 或 Linux 中的 nano）中生成 seq 文件。新建一个文件，将蛋白质的一级序列作为单行长文本或分行输入，保存时使用 .seq 扩展名。</li>
			<li>输入一个机构邮箱地址。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结果将通过电子邮件提供的链接发送。 
	注意：Auto-Rickshaw 是一个自动化流程，调用多种晶体学软件包来求解 X 射线晶体结构32,33,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58。如果 Auto-Rickshaw 运行未能成功求解结构，可尝试其他 Auto-Rickshaw 设置。可将结构测定方法更改为 &#34;sub_phassade&#34;，以使用 Phaser59 代替 SHELXD32。每个单体中预期的子结构数量也可相应增加或减少。</li>
	<li>在晶体结构的实验相位测定过程中，Auto-Rickshaw 将尝试在晶胞中定位重原子，从而形成一个子结构。I3C 中碘原子呈等边三角形排列，这一特征为验证子结构提供了有效手段。如果步骤 6.3 失败，验证子结构可能有助于排查结构求解中的问题。
	<ol>
		<li>从 Auto-Rickshaw 结果页面下载重原子位点列表。该列表是一个名为 &#34;heavy atom sites&#34; 的超链接，点击后将下载包含重原子位点的文本文件。</li>
		<li>将文件扩展名从 .txt 更改为 .pdb。</li>
		<li>在 Coot60 中打开该 PDB 文件，并开启对称性显示，以查看来自相邻非对称单元的其他重原子。</li>
		<li>测量重原子之间的距离，包括跨非对称单元的距离。I3C 应呈现边长为 6 埃的等边三角形。若存在符合此尺寸的三角形，则表明这些重原子的位置正确。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在缺乏合适的同源模型用于分子置换的情况下，新蛋白质结构的测定需要采用实验相位法。这些方法要求将重原子掺入蛋白质晶体中，从而为结构测定流程增加了复杂性，并可能引入多种必须解决的障碍。重原子可通过标记表达（如使用硒代甲硫氨酸和硒代半胱氨酸）直接掺入蛋白质中。由于该方法成本较高、操作繁琐，且可能导致蛋白质产量降低，因此通常在使用未标记蛋白质找到并优化结晶条件后，才进行标记蛋白质的表达。另一种方法是将晶体浸泡在含有重原子的溶液中以实现衍生化22,63,64。该方法通常使用高质量的晶体，因此一般在已建立稳定的结晶方法后进行。采用此方法成功获得衍生化晶体还需进一步优化浸泡程序，并对不同的相位化合物进行筛选，从而进一步延长了本已十分耗时的流程。
可在筛选阶段进行蛋白质与重原子的共结晶，从而有效简化流程，并减少可能造成晶体损伤的操作步骤。然而，仍存在初始结晶命中较少以及选择合适重原子化合物的问题。目前许多可用的衍射相位化合物与结晶条件中常见的沉淀剂、缓冲液和添加剂不相容。它们可能在硫酸盐和磷酸盐缓冲液中不溶，与柠檬酸盐和乙酸盐发生螯合，与 HEPES 和 Tris 缓冲液发生不利反应，或被 DTT 和 β-巯基乙醇螯合而失活21。由于 I3C 衍射相位化合物不受上述不相容性影响，因此是一种稳健的相位化合物，可适用于多种不同的结晶条件。
本研究介绍了一种简化的衍生物晶体生产方法，通过将I3C定相化合物与rMMS同时共结晶，直接获得适用于SAD定相的晶体。这两种技术的结合提高了结晶成功的数量，许多条件下的晶体形态和衍射特性均得到改善。在Orf11 NTD和HEWL的测试案例中，I3C-rMMS筛选中发现了若干在不含I3C时未出现的新结晶条件。I3C可能以有利的方式与蛋白质结合，促进晶格接触的形成并增强其稳定性27，从而诱导结晶，并可能改善衍射特性。除了与稀疏矩阵筛选兼容外，I3C还因其固有特性而成为一种理想的定相化合物。其芳香环骨架上交替排列的官能团与碘原子可实现与蛋白质的特异性结合，从而提高占据率并可能降低背景信号23。此外，异常散射原子呈等边三角形排列的亚结构特征明显，可用于快速验证I3C的结合（图4B 和 4C）。最后，I3C可在可调谐同步辐射以及铬和铜旋转阳极X射线源下产生异常散射信号，因此适用于多种不同的实验流程。由于I3C广泛可得且价格低廉，该方法适用于大多数结构生物学实验室。
使用I3C-rMMS方法时，必须考虑若干实验因素。如果无法获得蛋白质的初始晶体材料，则不能应用该方法。在困难情况下，可使用同源蛋白质的晶体材料制备晶种储备液。这种交叉接种的rMMS方法已显示出一定的前景7。通过稀释晶种储备液来优化晶体数量是一个关键步骤，不可忽视，以最大程度地获得高质量的大晶体并获取合适的衍射数据。如果在非对称单元中识别出的I3C位点较少，应进一步优化有利于结晶的条件，提高I3C的浓度。这可能增加I3C的占有率，从而最大化反常散射信号，并促进晶体的衍生化。
在某些情况下，该技术可能并非对蛋白质晶体进行衍生化的最优方法。随着蛋白质或蛋白质复合物尺寸的增大，蛋白质表面有限数量的I3C位点可能无法提供足够的定相能力来解析结构。当怀疑蛋白质尺寸较大而影响定相时，采用硒代甲硫氨酸标记蛋白质可能是更可行的定相策略。如果蛋白质中含有足够数量的甲硫氨酸残基（建议每100个氨基酸残基中至少含有一个甲硫氨酸65），并且能够高效地将硒代甲硫氨酸掺入蛋白质中（例如在细菌表达系统中66），则晶体中将含有多个高占据度的硒原子，可用于结构定相。
此外，某些蛋白质本身可能不适合与 I3C 进行衍生化。蛋白质上的 I3C 结合位点依赖于其空间结构。可能存在一些天然具有较少暴露区域、且这些区域与 I3C 结合不兼容的蛋白质。因此，某些靶蛋白与 I3C 共结晶存在困难并非不可预见。

在结构生物学领域，X射线晶体学被认为是确定大分子原子分辨率结构的金标准技术。该技术已被广泛用于理解疾病的分子基础、指导合理药物设计项目以及阐明酶的催化机制1,2。尽管结构数据提供了丰富的信息，但蛋白质表达与纯化、结晶及结构解析的过程可能极为繁琐。在这些项目中常常会遇到多个瓶颈，阻碍研究进展，因此必须解决这些问题，以高效地优化晶体结构解析流程。
在完成重组表达与纯化后，必须确定有利于结晶的初步条件，而这通常是X射线晶体学中一项艰巨且耗时的工作。为缓解这一瓶颈，已开发出商业化的稀疏矩阵筛选试剂盒，整合了已知并已发表的结晶条件3,4。然而，即使使用高纯度和高浓度的蛋白质样品，初始筛选中仍常常只能获得少量阳性结果。若观察到澄清的液滴，则表明蛋白质可能未达到成核所需的过饱和水平。为了促进晶体成核与生长，可将由已有晶体产生的晶种加入筛选条件中，从而扩大对结晶空间的采样范围。Ireton 和 Stoddard 首次提出了微晶种基质筛选方法5。他们将质量较差的晶体研碎制备成晶种储备液，然后系统地添加到含有不同盐类的结晶条件中，成功获得了原本无法形成的可用于衍射分析的优质晶体。该技术随后由 D'Arcy 等人进一步改进，发展出随机微晶种基质筛选法（rMMS），即将晶种引入一套独立的基质结晶筛选试剂盒中6,7。此方法平均将晶体质量显著提升，并使结晶阳性结果的数量增加至原来的7倍。
在成功获得晶体并获取X射线衍射图谱后，会遇到另一个瓶颈，即解决“相位问题”。在数据收集过程中，记录的是衍射强度（与振幅的平方成正比），而相位信息则丢失，从而导致相位问题，阻碍了结构的直接解析8。如果目标蛋白与已知结构的蛋白具有较高的序列一致性，可采用分子置换法来估算相位信息9,10,11,12。尽管该方法快速且成本较低，但可能缺乏可用或合适的模型结构。当序列一致性低于35%时，基于同源模型的分子置换法成功率显著下降13。在缺乏合适同源模型的情况下，可尝试从头计算方法（ab initio），例如ARCIMBOLDO14,15和AMPLE16。这些方法利用计算机预测的模型或片段作为分子置换的起始点。AMPLE以预测的诱饵&#160;模型为起点，在解析较大（&#62;100个残基）的蛋白或主要由β-折叠构成的蛋白结构时存在困难。ARCIMBOLDO试图通过拟合小片段并将其扩展为完整结构，但其应用受限于高分辨率数据（≤2 Å）以及算法将片段扩展为完整结构的能力。
如果分子置换法失败，则必须使用直接法，例如同晶置换法17,18，或单波长反常散射（SAD19）以及多波长反常散射（MAD20）。这种情况通常出现在全新结构的解析中，需要在晶体中引入或衍生化重原子。可通过将晶体浸泡在重原子化合物中或共结晶、化学修饰（如在RNA中引入5-溴尿嘧啶）或表达标记蛋白（如在蛋白质一级结构中引入硒代甲硫氨酸或硒代半胱氨酸氨基酸）来实现21,22。这进一步增加了结晶过程的复杂性，并需要额外的筛选和优化步骤。
一类新型的衍射相位化合物，包括 I3C（5-氨基-2,4,6-三碘代间苯二甲酸）和 B3C（5-氨基-2,4,6-三溴代间苯二甲酸），相较于已有的相位化合物具有显著优势23,24,25。I3C 和 B3C 均具有芳香环骨架，其上交替排列着适用于直接相位法的反常散射原子，同时含有氨基或羧酸根官能团，可特异性地与蛋白质相互作用，从而提供结合位点的特异性。后续形成的等边三角形排列的重金属基团有利于相位子结构的简化验证。截至撰写本文时，蛋白质数据库（PDB）中已有 26 个与 I3C 结合的结构，其中 20 个是通过单波长反常衍射（SAD）相位法解析的26。
本方案通过结合重金属衍生物化方法与rMMS筛选技术，同时提高结晶命中数量并简化晶体衍生物化过程，从而提升结构解析流程的效率。我们以鸡蛋清溶菌酶及来自噬菌体P68的一种新型溶素蛋白的结构域为例，验证了该方法的高效性27。文中描述了使用高度自动化的Auto-Rickshaw结构解析流程进行结构求解的过程，并针对I3C相位化合物进行了专门优化。此外也可采用其他自动化流程，例如AutoSol28、ELVES29和CRANK230。非完全自动化的软件包如SHELXC/D/E同样可用于此目的31,32,33。对于研究在PDB中缺乏同源模型蛋白的研究人员而言，该方法尤为有益，可显著减少筛选和优化步骤的数量。本方法的前提条件是已通过前期结晶实验获得目标蛋白的晶体或晶状沉淀物。

<table><tbody><tr><td>10 mL 一次性鲁尔锁注射器</td><td>Adelab Scientific</td><td>T3SS10LAT</td><td>用于向悬滴结晶板孔中分配真空润滑脂</td></tr><tr><td>24 孔组织培养板</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3527</td><td>用于悬滴结晶板</td></tr><tr><td>3 英寸宽 Crystal Clear 密封胶带</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-506</td><td>用于机器人设置的 96 孔结晶筛选板</td></tr><tr><td>5-氨基-2,4,6-三碘间苯二甲酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22178</td><td>在文中通常简称为 I3C</td></tr><tr><td>Art Robbins Intelli-Plate 96-2 原装板</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-297</td><td>用于机器人设置的 96 孔结晶筛选板</td></tr><tr><td>盖玻片&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18X18-2</td><td>用于悬滴结晶板孔的盖玻片</td></tr><tr><td>道康宁真空润滑脂</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-510</td><td>用于密封悬滴结晶板孔</td></tr><tr><td>Eppendorf 移液器 0.1 &amp;mu;L-2.5 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>3120000011</td><td></td></tr><tr><td>Gilson 移液器 2 &amp;mu;L-20 &amp;mu;L</td><td>John Morris Group</td><td>1153247</td><td></td></tr><tr><td>Gilson 移液器 20 &amp;mu;L-200 &amp;mu;L</td><td>John Morris Group</td><td>1152006</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>Adelab Scientific</td><td>HIR92601.01</td><td></td></tr><tr><td>鸡卵清溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>纯度约 95%</td></tr><tr><td>IndexHT 筛选试剂盒</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-134</td><td></td></tr><tr><td>显微镜照明器</td><td>Meiji Techno</td><td>FT192/230</td><td>为晶体学实验提供光源</td></tr><tr><td>PEG/ION HT 筛选试剂盒</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-139</td><td></td></tr><tr><td>Phoenix 液体分配仪</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>602-0001-10</td><td></td></tr><tr><td>带 15 号刀片的手术刀</td><td>Adelab Scientific</td><td>LV-SMSCPO15</td><td></td></tr><tr><td>晶种珠试剂盒</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-320</td><td>试剂盒包含一根用于压碎晶体的玻璃探针。另含专为压碎晶体设计的 PTFE 晶种珠，但本实验方案中未使用该部件。</td></tr><tr><td>体视显微镜&amp;nbsp;</td><td>Meiji Techno</td><td>EMZ-5TR</td><td>用于观察晶体学实验的显微镜</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5415</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Adelab Scientific</td><td>RAVM1</td><td></td></tr></tbody></table>

使用随机微晶种子矩阵筛选法对蛋白质晶体进行i3c衍生化

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

利用X射线晶体学解析蛋白质结构需要高质量的衍射晶体以及通过计算方法解决衍射相位问题。对于缺乏合适同源模型的新结构，通常通过引入重原子进行衍生化以提供实验相位信息。本方案通过结合随机微晶接种基质筛选与重原子分子I3C（5-氨基-2,4,6-三碘间苯二甲酸）的衍生化，高效地获得衍生化蛋白质晶体。将I3C整合入晶体晶格后，可利用单波长反常散射（SAD）法高效解决衍射相位问题。I3C中碘原子呈等边三角形排列，有利于快速验证反常散射子结构的正确性。本方案对致力于通过基于晶体学技术解析大分子结构并关注实验相位法的结构生物学家具有重要应用价值。

将 I3C 掺入 rMMS 可产生支持衍生物晶体生长的新条件 
通过两种蛋白质验证了 rMMS 筛选与 I3C 衍生化同时进行的有效性，这两种蛋白质分别为鸡卵清溶菌酶（HEWL，以冻干粉末形式获得）和来自噬菌体 P68 的假定 Orf11 溶菌酶 N 端结构域（Orf11 NTD）。每种蛋白质均在四种不同条件下对 PEG/ION HT 进行筛选，包括：未加晶种、加晶种、未加晶种但含 I3C 以及加晶种且含 I3C（图 1）。对于这两种蛋白质，单独添加 I3C 并未增加有利于结晶的条件数量。在 Orf11 NTD 的情况下，无论是否添加 I3C，仅鉴定出一种合适的结晶条件（图 1B）。当将 I3C 添加至 HEWL 的筛选中时，结晶“命中”数量从 31 种减少到 26 种，表明引入相位化合物会增加结晶过程的复杂性（图 1A）。与其他研究结果一致，向商业稀疏矩阵筛选中添加晶种以生成 rMMS 筛选，显著增加了两种蛋白质可能的结晶条件数量，分别使 HEWL 和 Orf11 NTD 的条件数量提高 2.1 倍和 6 倍6,61（图 1）。最重要的是，同时添加 I3C 和晶种相较于未加晶种的筛选显著增加了“命中”数量，使 HEWL 和 Orf11 NTD 的“命中”数分别提高了 2.3 倍和 7 倍。许多在含 I3C 的 rMMS 条件下获得的晶体表现出优异的晶体形态（图 2）。
接种可精确控制 I3C rMMS 筛选实验中的晶体数量 
在微接种实验中，通过稀释接种原液可控制加入结晶实验中的接种量，从而精确调控液滴中的成核过程7,36。这种方法通常能够形成更大的晶体，因为成核位点处蛋白质分子间的竞争减少。这一优势同样适用于 I3C-rMMS 方法，并已在 HEWL 和 Orf11 NTD 实验中成功验证。利用稀释后的接种原液重现 I3C-rMMS 筛选中确定的结晶条件，可获得数量更少但尺寸更大的晶体（图 3）。
可利用SAD相位法解析来自rMMS I3C筛选所获晶体的结构 
使用图3所示稀释后的晶种母液所生长的晶体，结合单颗晶体的衍射数据，通过SAD相位法解析了蛋白质的结构（图4）。数据采集在澳大利亚同步辐射MX1光束线完成62。详细的数据采集与结构解析细节见其他文献27。
<img alt="蛋白质结晶结果；微孔板检测；溶菌酶（Hen Egg White Lysozyme）、Orf11 N端结构域；接种效应。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig01.jpg" data-altupdatedat="1779768095000" data-alt="图1"> 
图1 - 使用rMMS为两种测试蛋白在I3C存在条件下生成新的晶体生长条件。采用商业化的稀疏矩阵筛选试剂盒进行96孔板汽相扩散结晶筛选。（A）使用Index HT试剂盒对鸡蛋清溶菌酶（Hen egg white lysozyme, HEWL）进行测试。培养板使用在0.2 M 酒石酸二铵（pH 7.0）、20% (w/v) 聚乙二醇3350中生长的HEWL晶体进行接种。（B）使用PEG/ION试剂盒对噬菌体P68来源的Orf11 N端结构域（Orf11 NTD）进行测试。Orf11 NTD培养板的接种晶体来自未接种筛选中G12条件下的晶体，如蓝色所示。支持晶体生长的条件以红色显示。在有或无I3C存在的情况下，rMMS接种均显著提高了晶体获得率，优于未接种的培养板。该图改编自Truong等人的研究27。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Crystallography setup; HEWL, Orf11 NTD protein crystallization results; Index/PEG conditions visualized." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig02.jpg" data-altupdatedat="1779768095000" data-alt="Figure 2"> 
图2 - 气相扩散试验中生长晶体的代表性图像，如图所示 图1 (a) 和 (b)。 图改编自 Truong 等人27. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结晶过程，通过稀释法展示HEWL和Orf11 NTD的结晶情况，图示为对比示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig03.jpg" data-altupdatedat="1779768095000" data-alt="图3"> 
图3 - 在使用I3C-rMMS方法筛选出的结晶条件下，通过稀释晶种储备液可有效减少成核现象，从而控制晶体形成数量。降低液滴内的成核率通常有助于晶体生长至更大的尺寸。该图改编自Truong等人的研究27。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61894fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结构分析，HEWL 与 Orf11 NTD，3D 模型与分子图示，用于教学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61894/61894fig04.jpg" data-altupdatedat="1779768095000" data-alt="图 4"> 
图 4 - Orf11 NTD（PDB ID 6O43）和 HEWL（PDB ID 6PBB）通过 I3C-rMMS 方法结晶，并利用 Auto-Rickshaw SAD 相位法解析结构。（A）通过实验相位法解析的 HEWL 和 Orf11 NTD 的带状结构。（B）结合在 HEWL 和 Orf11 NTD 上的 I3C 分子。（C）I3C 中的反常碘原子呈等边三角形排列，边长为 6 Å。因此，相位子结构中出现该三角形表明该位置存在一个 I3C 分子。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61894/61984fig04large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种利用微晶接种法在稀疏矩阵筛选中生成经I3C（5-氨基-2,4,6-三碘间苯二甲酸）衍生物修饰的蛋白质晶体的方法。该方法可通过液体分配机器人或手工设置结晶板。

使用随机微晶种子矩阵筛选法对蛋白质晶体进行I3C衍生化

利用X射线晶体学解析蛋白质结构需要高质量的衍射晶体以及衍射数据的计算求解……

本方案是一种结晶实验流程，旨在优化蛋白质晶体的生长，同时利用相位分子对蛋白质进行衍生化，从而通过X射线晶体学确定蛋白质的结构。为了确定一种全新蛋白质的X射线晶体结构，需优化结晶条件以获得高质量的晶体。对于一种全新的蛋白质，需要将重原子引入晶体中，以生成可用于结构解析的衍生化晶体。从衍生化晶体中收集X射线衍射数据，并需通过计算求解以获得X射线晶体结构。结晶和衍生化均为耗时费力的过程。为解决这些瓶颈问题，我们设计了一种优化的筛选流程，可同时实现这两个目标。本方案采用了一种先前开发的技术，称为随机微晶种子矩阵筛选法。将晶体或晶状沉淀物研磨成微晶种子，可用于在完全独立的条件下启动晶体生长。同时，我们将一种名为 I3C 的衍射相位分子引入结晶条件中。该分子可提供强的反常散射信号，从而能够通过单波长反常散射相位法解析结构。对于不熟悉晶体结构实验测定的用户，我们提供了一套用户友好的软件流程，可部分自动化地完成结构解析，并针对利用I3C的反常信号进行优化。第一步是制备I3C储备液。取120毫克I3C加入微量离心管中。向微量离心管中加入200微升2摩尔的氢氧化锂。可在40至60摄氏度加热并涡旋以促进溶解。1摩尔的碘化锂I3C储备液应呈棕色。将I3C加入蛋白储备液中有两种方法。可将碘化锂I3C直接加入蛋白储备液中。可将3.75微升至30微升的I3C加入150微升蛋白质中，使终浓度达到5至14毫摩尔。某些蛋白质在接触高浓度I3C时可能发生沉淀。在此情况下，可将碘化锂（lithium I3C）加入与样品蛋白质缓冲液相匹配的蛋白质稀释缓冲液中，终浓度为10至80毫摩尔。向150微升蛋白质样品中加入150微升蛋白质稀释缓冲液。用于压碎晶体的玻璃探针由玻璃巴斯德吸管制成。使用本生灯的蓝色火焰，加热巴斯德吸管的中部位置。使用一对镊子，将巴斯德移液管的末端拉成直径小于0.3毫米的细管。将该部分置于火焰中加热，使移液管在此处断开，并将末端烧圆，以完成玻璃探针的制作。此图为玻璃移液管应有的外观示例。也可从第三方供应商处订购晶种悬液，以替代自行制备。通过研碎蛋白质晶体或晶状沉淀物来制备微晶原液。将五个1.5 mL微量离心管置于冰上。在光学显微镜下，挑选出形态最佳且可用于牺牲的晶体或晶状沉淀物。对于96孔结晶板，通过切割塑料密封带打开孔。对于悬滴板，可用镊子取下盖玻片，并将其倒置在平坦表面上。转移70 µL储液至其中一个微量离心管中，并置于冰上冷却。向其余的离心管中转移 90 微升储液溶液，并放回冰上冷却。如果储液体积不足，可通过混合相应的试剂配制结晶储液，并替代使用。使用玻璃探针搅动结晶液滴中的晶体，彻底将其碾碎。可在显微镜下监测反应进程，直至观察不到任何晶体或结晶物质。将液滴中的全部液体转移至含有 70 µL 储液的微量离心管中。通过上下吹打混匀。将两到三微升混合液转移回孔中，通过上下移液冲洗孔。再将混合液转移回微量离心管中。此冲洗步骤应再重复一次。从此时起，应始终保持微型离心管处于低温状态，以避免微晶融化。将离心管在4°C下以最大速度涡旋震荡约3分钟，并定期将管子置于冰上冷却，以防止过热。通过将10 µL依次转移至预冷的储存液中，对晶种储备液进行10倍系列稀释。在稀释种子储备液之间，应将试管涡旋振荡。不立即使用的种子储备液应保存在-80 °C超低温冰箱中。可使用液体分配机器人设置96孔随机微晶种子矩阵筛选实验。将种子储备液、添加了I3C的蛋白储备溶液以及结晶筛选试剂放入机器人系统中。使用机器人从结晶筛选试剂中转移75微升至96孔板，其中1微升加入到结晶液滴中，74微升加入到储液池中。将1微升添加了I3C的蛋白质溶液转移至结晶液滴中。将0.1微升的晶种储备液转移至该结晶液滴中。使用封板膜密封板孔。可在24孔悬滴结晶板中设置悬滴筛。将悬滴孔的边缘涂抹油脂。向储液池中转移500微升结晶溶液。在玻璃盖玻片中心附近放置一微升结晶溶液液滴。向此液滴中加入一微升含有碘化锂I3C的蛋白质溶液以及0.1微升的晶种储备液。将盖玻片翻转，通过将盖玻片压入油脂中密封结晶孔。悬滴法和密封滴法的培养板需在恒定温度下孵育，以促进晶体形成。应定期在显微镜下检查晶体生长情况。在按照随附书面实验方案完成衍射数据的采集、积分与标度处理后，可使用 Auto-Rickshaw 自动化晶体结构解析流程来解决相位问题并建立蛋白质模型。在 Auto-Rickshaw 登录页面，点击“继续”按钮。在 Auto-Rickshaw 网络表单中输入您的机构邮箱，然后点击“继续运行 Auto-Rickshaw”。对于没有同源性模型模板的蛋白质，请以高级模式运行 Auto-Rickshaw 的 SAD 协议。输入所需的参数。选择蛋白质作为分子类型。以埃为单位输入数据收集波长。因此，选择碘原子作为亚结构元素。选择 I3C 亚结构类型以表明 I3C 是用于定相的分子。选择 sub_direct 作为亚结构测定方法。选择每个单体预期的子结构数量为三。将子结构搜索的保留阈值设为一。这将允许 Auto-Rickshaw 自动确定合适的分辨率截断值。输入单个单体中的残基数、数据集的空间群以及根据马修斯系数确定的非对称单元中的分子数。选择适合您需求的X射线数据公开级别。将反常数据输入为空的数据集文件。请以 SEQ、PIR 或 TXT 文件格式输入您的蛋白质序列。请输入您的机构邮箱地址。结果将通过发送至您提供邮箱的网页链接传送给您。如果Auto-Rickshaw未能解析结构，可通过验证其确定的子结构来辅助排查结构解析问题。从Auto-Rickshaw结果页面下载重原子位点列表，该列表为一个名为“heavy atom sites”的超链接。这将下载一个包含重原子位点的文本文件。将文件的扩展名从 txt 更改为 pdb。在 Coot 中打开该 pdb 文件。打开对称性以查看来自相邻不对称单元的所有重原子。测量重原子之间的距离，包括跨越不对称单元的距离。I3C 将呈现为边长六埃的等边三角形。出现具有这些尺寸的三角形表明这些重原子的位置是正确的。如果 Auto-Rickshaw 运行得到的子结构不正确，可按照书面实验方案中所述测试其他 Auto-Rickshaw 参数设置。I3C RMMS 方法已在两种蛋白质上进行了测试：一种是使用 Hampton Research 的高通量筛选法获得的鸡蛋清溶菌酶，另一种是来自噬菌体 P68 的 Orf11 溶菌蛋白结构域。为每种蛋白质设置了完整的筛选板，分别对应不含I3C或微晶种的对照筛选板、添加微晶种的筛选板、添加I3C的筛选板，以及同时添加I3C和微晶种的筛选板。在结晶筛选中加入I3C似乎并未增加结晶成功的条件数量。对于溶菌酶（hen egg white lysozyme），成功结晶的条件数从31种减少至26种。在对照筛选中，Orf11结构域仅发现一个结晶条件。在筛选中加入I3C后，相同条件下也仅得到一个结晶条件。向孔中加入微晶种子后，结晶条件的数量显著增加，分别使溶菌酶和Orf11结构域的结晶条件数量增加了2.1倍和6倍。该结果与其他测试RMMS的研究一致。最重要的是，在筛选中加入I3C和微晶种子后，相较于对照筛选，鸡蛋清溶菌酶和Orf11结构域的命中条件数量分别增加了2.3倍和七倍。这表明I3C RMMS方法能够高效地为衍生化晶体产生新的结晶条件。通过这些条件获得的晶体可用于解析晶体结构。利用I3C RMMS筛选法对晶体进行成功衍生化后，可通过Auto-Rickshaw流程中的SAD相位法解析出鸡卵清溶菌酶Orf11结构域的结构。本文展示了一种简单高效的方案，用于制备高质量且与相位分子I3C衍生化的晶体。它减少了筛选用板和晶体操作步骤的数量，因此对于研究新型蛋白质的结构生物学家尤为适用。我们强烈建议通过测试在制备晶种储备液过程中配制的不同稀释度的晶种储备液来优化晶体尺寸。此步骤在完成初步筛选后进行。I3C 广泛可得，且购买成本低廉，因此我们认为该方法适用于大多数结构生物学实验室。

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生物化学

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