使用液体色谱加上串联质谱法的 糖核 酸菌的定量元细胞学

本协议比目前使用的酵母代谢学有许多优点，因为它具有高特异性、高灵敏度，而且它可以描述许多不同类别的代谢物，包括异位体、同位素、亲水分子和疏水分子。本协议中使用的淬火方法可停止所有酶反应，同时显著减少细胞代谢物的泄漏。此协议中构建的 MS1 库来自各种 MS2 运行。

在每分钟30摄氏度和200转的隔夜培养后，确定每毫升培养物的酵母细胞数量，并在每瓶含有45毫升自体YP介质的两个Erlenmeyer烧瓶中每片加入5毫升经过消毒的20%的葡萄糖库存溶液。使用无菌转移移液器将五倍于第七酵母细胞添加到每个烧瓶中，并在每分钟 200 转的 30 摄氏度下至少再生长酵母细胞 24 小时。对于代谢物提取，培养后，通过离心收集酵母细胞，并迅速去除超高纳特。

将管子放在干冰上，在细胞中加入2毫升零下20摄氏度的氯仿、1毫升零下20摄氏度的甲醇、1毫升冰冷纳米纯净水和200微升425至600微米酸洗玻璃珠。添加珠子后，将覆盖铝箔的管子放入带固定器的泡沫管支架套件中，并在摄氏4度以中等速度将样品涡流30分钟，以方便代谢物提取。接下来，在冰上孵育管15分钟，然后离心样品，使上部的起伏期与中间碎屑、蛋白质和下部有机相分离。

使用微管将上水相的大约 400 微升转移到洗过并标记为 1.5 毫升的管子中，其中包含 800 微升零下 20 摄氏度的丙酮三聚醇。然后离心样品，将超高光子上部的800微升转移到标记的质谱小瓶中，进行零度存储，直到液相色谱串联质谱分析。要分离提取的代谢物，将样品小瓶超声波15分钟，然后在室温下进行三个10秒的漩涡。

涡流后，将小瓶放入液相色谱仪的井板中，将柱子设置为 45 摄氏度，流量为每分钟 0.25 毫升，井板为零摄氏度。然后使用表设置液相色谱梯度进行分析。分离后，在配备加热电喷雾电离的质谱仪中，在电喷电离正和负模式下使用10微升样品量，以识别和量化水溶性代谢物。

在分析结束时，打开适当的复合分析软件程序中的原始数据，并利用质量光谱碎片库匹配质量光谱来注释分析中确定的代谢物。也可以识别MS1和同位素模式的确切质量，以便使用在线数据库对代谢物进行注释。然后使用数据库和光谱库来搜索原始数据的 MS2 光谱。

第二天，在淬火酵母细胞后，用15毫升ABC缓冲器彻底清洗细胞，并通过离心收集细胞。将颗粒重新浸入一毫升新鲜的 ABC 缓冲器中，并在细胞中加入 500 微升碘化物溶液。每个漩涡将样品三次，每次漩涡10秒，并在不受光线保护的冰上孵育细胞10分钟。

在孵化结束时，通过离心收集细胞，每次洗涤用一毫升新鲜ABC缓冲器清洗细胞三次。最后一次洗涤后，将颗粒重新注入 300 微升新鲜 ABC 缓冲器中，并将产生的细胞悬浮物的 10 微升添加到显微镜滑动中。使用荧光显微镜捕捉细胞的微分干扰对比度和荧光显微镜图像，过滤器的激发波长为 593 纳米，发射波长为 636 纳米。

然后使用适当的图像分析程序来计算亮场和荧光图像中的细胞总数，并确定单个细胞染色时的荧光强度。改性细胞淬火法对血浆膜和细胞壁的损伤明显低于零下40摄氏度的无缓冲80%甲醇淬火方法。事实上，几乎所有使用改良方法淬火的细胞都表现出红色荧光发射，这是酵母细胞的特征，其中血浆膜和细胞壁没有损坏。

相比之下，几乎所有使用40摄氏度非缓冲80%甲醇进行淬火的细胞都表现出绿色荧光发射，这是酵母细胞的特征，血浆膜和细胞壁受到显著损伤。改性细胞淬火法也比零下40摄氏度的无缓冲80%甲醇淬火法导致酵母细胞中水溶性代谢物的泄漏显著降低。水溶性代谢物标准的保留时间移位值显著降低，与反向相列相比，zwitterion 相列的峰值形状要清晰得多。

液相色谱串联质谱法的另一个优点是能够使用 zwitterion 相列有效地分离具有不同结构、物理和化学特性的不同水溶性代谢物。确保在黑暗中站立碘化物，并确保收集上相，同时不干扰中间阶段。如果由于 MS2 光谱库的缺乏而无法注释任何 MSP，则使用 NMR 来说明此结构。