Name: 使用液体色谱加上串联质谱法的 糖核 酸菌的定量元细胞学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学习使用液相色谱串联质谱法对酿酒酵母进行水溶性代谢物提取与定量分析的高灵敏度方案。该方法通过优化淬灭技术减少代谢物泄漏，可鉴定超过370种代谢物。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Titorenko实验室现任和前任成员的讨论。我们感谢康考迪亚大学的质谱生物学应用中心、基因组结构与功能中心以及显微镜与细胞成像中心提供的卓越服务。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）的资助（项目编号：RGPIN 2014-04482 和 CRDPJ 515900 - 17）。K.M. 获得了康考迪亚大学Armand C. Archambault博士后奖学金以及康考迪亚大学文理学院优秀奖的支持。

1. 酵母培养基的制备与灭菌
<ol>
	<li>制备 180 mL 完全酵母提取物-蛋白胨（YP）培养基。完全 YP 培养基含有 1%（w/v）酵母提取物和 2%（w/v）蛋白胨。</li>
	<li>将 180 mL YP 培养基均分至四个 250 mL 锥形瓶中。每个锥形瓶中含有 45 mL YP 培养基。</li>
	<li>将装有 YP 培养基的锥形瓶在 15 psi/121 °C 条件下高压灭菌 45 分钟。</li>
</ol>
2. 野生型酵母菌株
<ol>
	<li>使用 BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) 菌株。</li>
</ol>
3. 在含有2%葡萄糖的YP培养基中培养酵母
<ol>
	<li>将20% (w/v) 葡萄糖储备液在15 psi/121 °C条件下高压灭菌45分钟。</li>
	<li>向两个装有45 mL灭菌YP培养基的锥形瓶中，各加入5 mL已高压灭菌的20% (w/v) 葡萄糖储备液。YP培养基中葡萄糖的终浓度为2% (w/v)。</li>
	<li>使用微生物接种环将酵母细胞接种至两个含有2%葡萄糖YP培养基的锥形瓶中。</li>
	<li>在30 °C、200 rpm转速的摇床中过夜培养酵母细胞。</li>
	<li>取一份酵母培养液的等分试样，测定每毫升培养液中的酵母细胞总数，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
</ol>
4. 细胞转移至含2%葡萄糖的YP培养基并进行培养
<ol>
	<li>向其余两个装有高压灭菌 YP 培养基的锥形瓶中，各加入 5 mL 已灭菌的 20% (w/v) 葡萄糖储备液。葡萄糖的终浓度为 2% (w/v)。</li>
	<li>用无菌移液管将过夜培养的酵母菌液（YP 培养基含 2% 葡萄糖）转移至两个含有 2% 葡萄糖 YP 培养基的锥形瓶中，每瓶接种量应含有总数为 5.0 × 107 个细胞。</li>
	<li>将酵母细胞在 30 °C、200 rpm 的摇床中培养至少 24 小时（或根据实验需要更长时间）。</li>
</ol>
5. 配制试剂、准备实验器具及设置细胞淬灭设备
<ol>
	<li>准备以下物品：1）淬灭溶液（60% 高纯度（&#62;99.9%）甲醇溶于 155 mM 碳酸氢铵（ABC）缓冲液中，pH = 8.0）；2）预冷的 ABC 溶液（pH = 8.0）；3）可测量至 -20 °C 的数字温度计；4）500 mL 大容量离心瓶；5）预冷的高速离心机，配备预冷转子及适用于该转子的预冷 500 mL 离心瓶，所有设备均置于 -5 °C；6）代谢物提取管（15 mL 高速玻璃离心管，带聚四氟乙烯衬垫盖）；以及 7）干冰。</li>
</ol>
6. 细胞淬灭
<ol>
	<li>使用血细胞计数板测定含2%葡萄糖的YP培养基中每毫升的酵母细胞数量。</li>
	<li>将含有5.0 × 108个细胞的含2%葡萄糖YP培养基培养物转移至预冷的500 mL离心管中。</li>
	<li>迅速向含有细胞的离心管中加入-20 °C预冷的淬灭溶液，定容至200 mL。</li>
	<li>在高速离心机中以11,325 × g于-5 °C离心3分钟。</li>
	<li>迅速而轻柔地从离心机中取出离心管，缓慢旋开盖子，并移除上清液，避免扰动沉淀。</li>
	<li>将细胞沉淀迅速重悬于10 mL冰冻ABC缓冲液中，然后将悬液转移至带有聚四氟乙烯衬垫盖子的15 mL高速玻璃离心管中，用于代谢物提取。</li>
	<li>在临床离心机中以3,000 × g于0 °C离心3分钟收集细胞。</li>
	<li>迅速吸除上清液，将离心管置于干冰上以开始代谢物提取，或暂时存放于-80 °C直至提取。</li>
</ol>
7. 代谢物提取所需试剂、实验耗材和设备的准备
<ol>
	<li>准备以下物品：1）液相色谱-质谱级氯仿；2）液相色谱-质谱级甲醇；3）液相色谱级纳米纯水；4）液相色谱-质谱级乙腈（ACN）；5）玻璃珠（经酸洗，425–600 µm）；6）配有带固定装置的泡沫管架的涡旋振荡器；7）带聚四氟乙烯衬垫盖的15 mL高速玻璃离心管；8）质谱小瓶；9）干冰；以及10）经乙醇、乙腈和纳米纯水各清洗一次的1.5 mL离心管。 
	&#8203;注意：仅使用由耐有机溶剂的聚丙烯材料制成的移液器吸头和离心管。</li>
</ol>
8. 代谢物提取
<ol>
	<li>向步骤6.7中保存在干冰上或-80 °C冰箱中的代谢物样品管中加入以下试剂：1）2 mL 保存在-20 °C的氯仿；2）1 mL 保存在-20 °C的甲醇；3）1 mL 冰冷的纳米纯水；以及 4）200 µL 经酸洗处理的425–600 µm玻璃珠。</li>
	<li>用铝箔封住并盖紧管口。将样品管放入带固定夹的泡沫管架中，在4 °C条件下以中等速度涡旋振荡30分钟（即设定速度为6，其中12为涡旋振荡器的最大速度），以促进代谢物的提取。</li>
	<li>将样品管置于冰上孵育15分钟（切勿使用干冰！），以促进蛋白质沉淀，并使上层水相与下层有机相分离。</li>
	<li>在临床离心机中以3,000 × g、4 °C离心10分钟。此离心步骤可分离出上层水相（含有水溶性代谢物）、中间层（含有细胞碎片和蛋白质）以及下层有机相（主要含有脂类）。</li>
	<li>使用微量移液器将上层水相（400 µL）转移至一个已清洗并标记好的1.5 mL离心管中，该离心管内含有800 µL保存在-20 °C的乙腈（ACN）。 
	注：将上层水相加入-20 °C保存的乙腈后，会出现白色云状沉淀。</li>
	<li>将含有样品的离心管在台式离心机中以13,400 × g、4 °C离心10分钟。 
	&#8203;注：离心后白色云状沉淀将消失。</li>
	<li>从离心管中液体的上层取800 µL转移至标记好的质谱小瓶中。将样品储存在0 °C，直至进行LC-MS/MS分析。</li>
</ol>
9. 液相色谱试剂、实验器具和设备的准备
<ol>
	<li>准备以下物品：1）涡旋振荡器；2）超声波破碎仪；3）MS 玻璃小瓶；4）配备二元泵、脱气装置和自动进样器的液相色谱系统；5）两性离子色谱柱（5 µm 聚合物，150 x 2.1 mm），名称见材料表；6）柱温箱；以及 7）流动相，包括 A 相（乙腈:水（v/v）= 5:95，含 20 mM 乙酸铵，pH = 8.0）和 B 相（100% 乙腈）。</li>
</ol>
10. 通过液相色谱分离提取的代谢物
<ol>
	<li>将质谱小瓶中的内容物进行超声处理15分钟。</li>
	<li>在室温（RT）下涡旋振荡质谱小瓶，每次10秒，共3次。</li>
	<li>将质谱小瓶放入孔板中。</li>
	<li>色谱分析过程中，保持色谱柱温度为45 °C，流速为0.250 mL/min。样品在孔板中保持0 °C。色谱分析时所用的液相梯度参见表1。 
	注意：图1展示了从野生型菌株BY4742细胞中提取的水溶性代谢物的代表性总离子流色谱图。通过质谱分析在正离子化模式[ESI (+)]下对液相色谱分离的代谢物进行鉴定和定量，具体步骤如步骤11所述。</li>
</ol>
11. 通过液相色谱分离代谢物的质谱分析
<ol>
	<li>使用配备加热电喷雾电离（HESI）的质谱仪，对经液相色谱分离的水溶性代谢物进行鉴定和定量。使用质谱仪的分析器检测MS1离子，使用质谱仪的检测器检测MS2离子。分别采用表2和表3中提供的参数设置进行MS1和MS2离子的数据依赖性采集。</li>
	<li>在ESI(+)和ESI(-)两种模式下，进样体积均为10 µL。</li>
</ol>
12. 通过处理LC-MS/MS原始数据鉴定和定量不同代谢物
<ol>
	<li>使用材料表中列出的软件，对原始LC-MS/MS文件中的不同水溶性代谢物进行鉴定和定量。该软件使用MS1进行代谢物定量，使用MS2进行代谢物鉴定。该软件利用经过最广泛人工审编的质谱碎片图谱数据库，通过匹配质谱图，利用LC-MS/MS原始数据对代谢物进行注释。该软件还结合MS1的精确质量数和同位素模式匹配，利用在线数据库对代谢物进行注释。详见图2。</li>
	<li>使用可免费在线获取的数据库与谱图库（https://www.mzcloud.org），搜索原始数据的MS2谱图。</li>
</ol>
13. 通过碘化丙啶（PI）染色和荧光显微镜检测膜完整性
<ol>
	<li>按照步骤6所述进行细胞淬灭后，用15 mL ABC缓冲液彻底洗涤淬灭后的细胞，以去除淬灭溶液。在0 °C下以3,000 × g离心5 min收集细胞。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于1 mL ABC缓冲液中，并加入0.5 mL PI溶液（0.5 mg/mL）。</li>
	<li>将样品管涡旋振荡3次，每次10 s，然后在冰上避光孵育10 min。</li>
	<li>将样品管在台式离心机中于4 °C下以13,400 × g离心10 min。</li>
	<li>弃去上清液，并将沉淀重悬于1 mL ABC缓冲液中。</li>
	<li>在4 °C下以13,400 × g离心10 min，弃去上清液。重复此步骤2次，以去除与细胞表面结合的PI。</li>
	<li>将沉淀重悬于300 µL ABC缓冲液中。取10 µL悬液滴加至显微镜载玻片表面。</li>
	<li>使用荧光显微镜采集微分干涉差（DIC）和荧光显微图像。激发波长和发射波长分别设置为593 nm和636 nm的滤光片组。</li>
	<li>使用软件统计总细胞数（DIC模式下）以及荧光染色细胞的数量。同时利用该软件测定单个细胞的染色强度。</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

要成功使用此处所述的实验方案，请遵循以下预防措施。氯仿和甲醇会从实验室塑料器皿中提取多种物质，因此需谨慎操作。在涉及接触这两种有机溶剂的步骤中，应避免使用塑料制品。这些步骤应使用硼硅酸盐玻璃移液管，并在使用前用氯仿和甲醇冲洗这些移液管。仅使用由耐有机溶剂的聚丙烯材料制成的微量移液器吸头和离心管。在进行 LC-MS/MS 样品制备时，将玻璃小瓶插入孔板前，务必彻底排除其中的所有气泡。
此处使用的两性离子相色谱柱在每次运行后均需进行充分的再平衡处理，以最大限度减少保留时间漂移。对于色谱柱的再平衡，建议使用相当于色谱柱体积约20倍的再平衡溶液。色谱柱需在0.4 mL/min的较高流速下，用初始流动相冲洗15分钟。为避免在再平衡过程中对色谱柱造成任何损伤，应使柱压保持在制造商建议的最高压力限值以下。
值得注意的是，某些在反相模式下运行的混合分离色谱柱能够分离带电代谢物40,41。这些混合分离色谱柱基于本实验所用的反相色...

水溶性代谢物是参与细胞基本生命活动的低分子量代谢中间产物和终产物。这些在进化上保守的生物学过程包括将营养物质转化为可利用的能量、大分子物质的合成、细胞生长与信号转导、细胞周期调控、基因表达调控、应激反应、代谢的翻译后调控、线粒体功能的维持、细胞囊泡运输、自噬、细胞衰老以及程序性细胞死亡1,2,3。
许多水溶性代谢物的重要功能是通过芽殖酵母 S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22 的研究发现的。这种单细胞真核生物因其适用于先进的生物化学、遗传学和分子生物学分析，成为解析水溶性代谢物如何参与细胞过程机制的有用模式生物23,24,25,26。尽管非靶向代谢组学的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法已被用于研究水溶性代谢物在芽殖酵母中的作用3,18,22,27，但此类分析仍需提高其通用性、稳健性、灵敏度，以及区分这些代谢物不同结构异构体和立体异构体形式的能力。
近年来，非靶向代谢组学中的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法在体内水溶性代谢物谱分析方面取得了显著进展。然而，该方法的应用仍面临诸多挑战2,28,29,30,31,32,33,34,35,36。这些挑战包括以下方面。第一，许多水溶性代谢物的胞内浓度低于当前方法的检测灵敏度阈值。第二，现有方法对代谢活性的淬灭效率较低，且淬灭过程中细胞内代谢物的泄漏程度较高，导致当前方法低估了水溶性代谢物的胞内浓度。第三，现有方法无法区分特定代谢物的结构异构体（即具有相同化学式但原子连接方式不同的分子）或立体异构体（即具有相同化学式和原子连接方式，但原子空间排列不同的分子），从而阻碍了当前方法对某些代谢物的正确注释。第四，现有的母离子（MS1）和二级离子（MS2）质谱在线数据库尚不完整，这影响了利用当前方法产生的原始LC-MS/MS数据对特定代谢物进行准确鉴定与定量。第五，现有方法无法通过单一类型的代谢物提取方法回收全部或大多数类别的水溶性代谢物。第六，现有方法无法使用单一类型的液相色谱柱实现全部或大多数类别的水溶性代谢物之间的有效分离。
本研究优化了酿酒酵母（S. cerevisiae）细胞内代谢活性淬灭的条件，可在提取前最大限度地将水溶性代谢物保留在细胞内，并从酵母细胞中提取出大多数类别的水溶性代谢物。我们建立了一种通用、稳健且灵敏的方法，基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对从酿酒酵母（S. cerevisiae）细胞中提取的超过370种水溶性代谢物进行鉴定和定量。该非靶向代谢组学方法可用于评估细胞内多种能量载体分子、核苷酸、氨基酸、单糖、糖酵解中间产物以及三羧酸循环中间产物的浓度。所建立的LC-MS/MS方法能够对具有不同结构、物理和化学性质的水溶性代谢物的不同结构异构体和立体异构体形式进行鉴定与定量。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Fisher Scientific</td><td>A9554</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11450</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-2</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific</td><td>C297-4</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>L-组氨酸</td><td>Sigma</td><td>H8125</td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Sigma</td><td>L8912</td><td></td></tr><tr><td>L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4564</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4564</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Thermo Scientific</td><td>R37108</td><td></td></tr><tr><td>尿嘧啶</td><td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;硬件设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 ml 离心瓶</td><td>Beckman</td><td>355664</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 1100 系列液相色谱系统</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1312A</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter 离心机</td><td>Beckman</td><td>6254249</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter 离心机转子</td><td>Beckman</td><td>JA-10</td><td></td></tr><tr><td>Centra CL2 临床离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>数字温度计</td><td>Omega</td><td>HH509</td><td></td></tr><tr><td>带固定夹的泡沫管架套装</td><td>Thermo Scientific</td><td>02-215-388</td><td></td></tr><tr><td>SeQuant ZIC-pHILIC 两性离子相色谱柱（5&amp;micro;m 聚合物，150 x 2.1 mm）</td><td>Sigma Milipore</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Orbitrap Velos 质谱仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>ETD-10600</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>15337416</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX Bonus-RP 色谱柱，80&amp;Aring;，2.1 x 150 mm，5 &amp;micro;m</td><td>Agilent Technologies</td><td>883725-901</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;实验室耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-mL 玻璃样品瓶，带聚四氟乙烯衬垫瓶盖</td><td>Fisher Scientific</td><td>60180A-SV9-1P</td><td></td></tr><tr><td>玻璃珠（酸洗，425-600 &amp;mu;m）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>15-mL 高速玻璃离心管，带聚四氟乙烯衬垫瓶盖</td><td>PYREX</td><td>05-550</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compound Discoverer 3.1</td><td>Fisher Scientific</td><td>V3.1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;酵母菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母菌株 BY4742</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1049</td><td></td></tr></tbody></table>

使用液相色谱串联质谱法对saccharomyces cerevisiae进行定量代谢组学分析

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

代谢组学是一种用于鉴定和定量细胞、组织、器官、生物液体或生物体内多种低分子量代谢中间产物和终产物的方法。传统上，代谢组学主要关注水溶性代谢物。水溶性代谢组是整合了多种基因组、表观基因组、转录组、蛋白质组及环境因素的复杂细胞网络的最终产物。因此，代谢组学分析可直接评估这些因素在各种生物体多种生物过程中共同作用的结果。其中一种研究对象是芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae，这是一种基因组已完全测序的单细胞真核生物。由于S. cerevisiae适用于全面的分子分析，它被广泛用作解析真核细胞中多种生物学过程机制的模式生物。一种能够对水溶性代谢组进行稳健、灵敏且准确的定量分析的多功能分析方法，将为深入解析这些机制提供必要的技术手段。本文介绍了一种优化的芽殖酵母S. cerevisiae细胞代谢活性淬灭及水溶性代谢物提取的实验方案。该方案还描述了使用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）对提取的水溶性代谢物进行定量分析的方法。此处所述的非靶向代谢组学LC-MS/MS方法具有良好的通用性和稳健性，能够鉴定和定量超过370种具有不同结构、物理和化学性质的水溶性代谢物，包括这些代谢物的不同结构异构体和立体异构体形式。这些代谢物涵盖多种能量载体分子、核苷酸、氨基酸、单糖、糖酵解中间产物以及三羧酸循环中间产物。该非靶向代谢组学LC-MS/MS方法灵敏度高，可检测浓度低至0.05 pmol/µL的某些水溶性代谢物。该方法已成功应用于在不同培养条件下生长的野生型和突变型酵母细胞水溶性代谢组的分析。

为改进酵母细胞内水溶性代谢物的定量评估，我们优化了用于代谢物检测的细胞淬灭条件。该目的下的细胞淬灭涉及迅速终止细胞内的所有酶促反应31,33,37,38细胞代谢活动的这种抑制是定量水溶性代谢物的任何方法中的关键步骤 体内 因为它可以防止低估其细胞内浓度31,33,37,38细胞淬灭用于代谢物检测时总会破坏质膜（PM）的完整性（如果存在细胞壁（CW），也会破坏其完整性）；这会导致细胞内代谢物泄漏31<s...

我们提出了一种用于鉴定和定量酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中主要类别的水溶性代谢物的实验方案。该方法具有多功能性、稳健性和高灵敏度，能够实现水溶性代谢物中结构异构体与立体异构体之间的有效分离。

使用液相色谱串联质谱法对Saccharomyces cerevisiae进行定量代谢组学分析

代谢组学是一种用于鉴定和定量生物体内多种低分子量代谢中间物和代谢产物的方法学……

与目前使用的酵母代谢组学方法相比，本方案具有多种优势：高特异性、高灵敏度，并且能够对多种不同类别的代谢物进行分析，包括异构体、同量异位体、亲水性和疏水性分子。本方案所采用的淬灭方法可终止所有酶促反应，同时显著减少代谢物从细胞中的泄漏。本方案构建的MS1谱图库来源于多次不同的MS2运行结果。在30摄氏度、200转/分钟条件下过夜培养后，测定每毫升培养液中的酵母细胞数量，并向两个锥形瓶中各加入5毫升灭菌的20%葡萄糖储备液，每个锥形瓶中含有45毫升经高压灭菌的YP培养基。使用无菌移液管向每个锥形瓶中加入5×10⁷个酵母细胞，并在30摄氏度、200转/分钟条件下继续培养至少24小时。进行代谢物提取时，培养结束后通过离心收集酵母细胞，并迅速移除上清液。将离心管置于干冰上，向细胞中加入 2 毫升 -20 摄氏度的氯仿、1 毫升 -20 摄氏度的甲醇、1 毫升冰冻的纳米纯水以及 200 微升 425 至 600 微米经酸洗处理的玻璃珠。加入玻璃珠后，用铝箔包裹离心管，放入带有固定夹的泡沫管架装置中，在 4 摄氏度下以中等速度涡旋振荡 30 分钟，以促进代谢物的提取。随后，将离心管在冰上孵育 15 分钟，然后进行离心，使上层水相与中间的碎片和蛋白质以及下层有机相分离。使用微量移液器将约 400 微升上层水相转移至已清洗并标记的 1.5 毫升离心管中，该离心管内含有 800 微升 -20 摄氏度的乙腈。然后离心样品，并将上清液上层的 800 微升转移至标记好的质谱小瓶中，在 0 摄氏度下保存，直至进行液相色谱-串联质谱分析。为分离提取的代谢物，先将样品小瓶超声处理 15 分钟，随后在室温下进行三次每次 10 秒的涡旋振荡。涡旋后，将小瓶放入液相色谱仪的孔板中，设置色谱柱温度为45摄氏度，流速为0.25毫升每分钟，孔板温度为0摄氏度。然后根据表格设定液相色谱梯度用于分析。分离后，在配备加热电喷雾离子源的质谱仪中，分别采用电喷雾离子化正离子和负离子模式，注入10微升样品体积，用于鉴定和定量水溶性代谢物。分析结束后，在合适的化合物分析软件中打开原始数据，并利用质谱碎片图谱库匹配质谱，以注释分析中鉴定出的代谢物。还可通过鉴定一级质谱（MS1）的精确质量和同位素模式，利用在线数据库对代谢物进行注释。然后使用数据库和谱图库搜索原始数据的二级质谱（MS2）图谱。第二天，在淬灭酵母细胞后，用15毫升ABC缓冲液彻底洗涤细胞，并通过离心收集细胞。将沉淀重悬于1毫升新鲜ABC缓冲液中，向细胞中加入500微升碘化丙啶溶液。涡旋混匀样品三次，每次10秒，并将细胞置于冰上避光孵育10分钟。孵育结束后，通过离心收集细胞，并用一毫升新鲜ABC缓冲液洗涤细胞三次，每次洗涤使用一毫升。最后一次洗涤后，将沉淀重悬于300微升新鲜ABC缓冲液中，取10微升所得细胞悬液加入载玻片。使用荧光显微镜，在激发波长593纳米、发射波长636纳米的滤光片条件下，采集细胞的微分干涉差（DIC）和荧光显微图像。然后使用适当的图像分析程序，对明场和荧光图像中的细胞进行总细胞数计数，并测定单个细胞染色的荧光强度。改进的细胞淬灭方法对细胞质膜和细胞壁造成的损伤显著低于在负40摄氏度下使用非缓冲80%甲醇的淬灭方法。事实上，几乎所有采用改进方法进行淬灭的细胞均表现出红色荧光发射，这是质膜和细胞壁未受损伤的酵母细胞的典型特征。相比之下，几乎所有采用在40摄氏度条件下使用非缓冲80%甲醇淬灭的细胞均显示出绿色荧光发射，这是细胞质膜和细胞壁严重受损的酵母细胞的典型特征。与在负40摄氏度条件下使用非缓冲80%甲醇淬灭的方法相比，改进后的细胞淬灭方法导致酵母细胞中水溶性代谢物的泄漏显著减少。与反相色谱柱相比，两性离子相色谱柱的水溶性代谢物标准品的保留时间漂移值显著更低，且峰形明显更尖锐。液相色谱串联质谱法的另一个优势在于能够使用两性离子相色谱柱，有效分离具有不同结构、物理和化学性质的多种水溶性代谢物。进行碘化丙啶染色时务必避光操作，同时在收集上层相时注意不要扰动中间相。若由于缺乏MS2谱图库而无法对某些MSP进行注释，则可使用核磁共振（NMR）来解析其结构。

quantitative-metabolomics-saccharomyces-cerevisiae-using-liquid

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用液体色谱加上串联质谱法的 糖核 酸菌的定量元细胞学

本文介绍了一种用于鉴定酿酒酵母（Saccharomyces...

酿酒酵母中利用定量蛋白质组学鉴定蛋白质复合物

利用低温裂解、尿素溶解、HILIC分级和IMAC富集磷酸化肽段的定量磷酸化实验方案描述。...

脂肪酸刺激下的定量磷酸化蛋白质组学 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

我们介绍一种新的定量脂质组学方法，利用全扫描电喷雾电离质谱法（ESI/MS）鉴定酵母中的多种脂质种类。该方法在分辨各类脂质分子形式的能力、灵敏度和检测速度方面均优于目前可用的脂质鉴定与定量方法。...

利用电喷雾电离质谱法对酵母脂质组进行定量分析

来源： Samuels, D. J., 等 一种基于串联液相色谱-质谱法的代谢物分析方法 金黄色葡萄球菌. 视频实验杂志 (2017)本视频演示了使用液相色谱-质谱联用技术鉴定和定量金黄色葡萄球菌（S.

基于液相色谱-质谱联用技术的代谢物分析方法 S. aureus

代谢物谱分析在健康与疾病状态下的代谢研究中具有重要价值。本文介绍了一种利用正相液相色谱联用高分辨率质谱、极性切换及快速循环周期的技术方案，可对生物材料中的极性代谢物组成进行高灵敏度、高准确性和高分辨率的分析。...

一种用于高灵敏度、大规模定量代谢组学的策略

我们介绍一种采用液相色谱串联质谱法鉴定和定量酿酒酵母（Saccharomyces...

使用液相色谱串联质谱法对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞脂质组进行定量分析

本文介绍了一种对小麦籽粒代谢物和脂质进行非靶向分析的方法。该方案包括乙腈代谢物提取法以及反相液相色谱-质谱分析法，并在正离子和负离子电喷雾电离模式下进行检测。...

基于液相色谱-质谱的非靶向小麦籽粒代谢组学分析

本方案描述了高效液相色谱法，结合折光指数检测或质谱检测，用于研究基于复杂裂解液的无细胞系统中的代谢反应。...

液相色谱联用折射率或质谱检测用于基于裂解液的无细胞体系中的代谢物分析

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

本文介绍了一种从金黄色葡萄球菌（Staphylococcus...

一种基于串联液相色谱-质谱法的代谢物分析方法 金黄色葡萄球菌

学习使用液相色谱串联质谱法对酿酒酵母进行水溶性代谢物提取与定量分析的高灵敏度方案。该方法通过优化淬灭技术减少代谢物泄漏，可鉴定超过370种代谢物。

使用液相色谱串联质谱法对Saccharomyces cerevisiae进行定量代谢组学分析

探索更多视频