Name: 果蝇细胞中的核内高C (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 学习果蝇细胞核内高分辨率Hi-C技术，用于分析染色质相互作用和拓扑关联结构域边界。该方法结合CRISPR基因编辑，可研究基因组三维结构调控机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由墨西哥国立自治大学（UNAM）技术创新与研究支持计划（PAPIIT）资助，项目编号为 IN207319，以及由国家科学技术委员会（CONACyT-FORDECyT）资助，项目编号为 303068。A.E.-L. 是由国家科学技术委员会（CONACyT）资助的硕士研究生，CVU 编号为 968128。

1. 固定
<ol>
	<li>从1000万Schneider's S2R+细胞开始，在室温下用含10%胎牛血清（FBS）的Schneider培养基制备17.5 mL细胞悬液。</li>
	<li>加入无甲醇甲醛，使其终浓度为 2%。混匀后室温孵育 10 分钟，期间每分钟轻柔混匀一次。 
	注意：甲醛是一种危险化学品。请遵循相应的健康与安全规定，并在通风橱中操作。</li>
	<li>通过加入甘氨酸使终浓度达到 0.125 M 来终止反应，并混匀。室温孵育 5 分钟，随后冰上孵育 15 分钟。</li>
	<li>离心 400 × g 室温孵育5分钟，然后4 °C孵育10分钟；弃去上清液。将沉淀物小心重悬于25 mL冷的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	<li>400 × g 离心 g 4 °C下离心10分钟，弃上清液。 
	注意：如果继续进行实验方案，请进入步骤 2.1 进行裂解；否则，将沉淀物在液氮中速冻2 并将沉淀物于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
2. 裂解
<ol>
	<li>将细胞重悬于 1 mL 冰冷裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8；0.2% 非离子型表面活性剂（见材料表）；10 mM NaCl；1×蛋白酶抑制剂）中，并用冰冷裂解缓冲液调整体积至 10 mL。调整体积以获得 1 × 106 个细胞/mL 的浓度。冰上孵育 30 分钟，每隔 2 分钟轻轻颠倒离心管混匀。</li>
	<li>在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟收集细胞核，小心弃去上清液。用 1 mL 冷裂解缓冲液洗涤沉淀 1 次，转移至微量离心管中。再用 1 mL 冷的 1.25×限制性缓冲液洗涤沉淀 1 次，并将每份细胞沉淀重悬于 360 µL 的 1.25×限制性缓冲液中。</li>
	<li>每管加入 11 µL 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）（终浓度为 0.3%），用移液器轻轻吹打混匀，在 37 °C 下孵育 45 分钟，同时以 700–950 rpm 振荡。孵育过程中多次上下吹打以破坏团块。</li>
	<li>通过每管加入 75 µL 非离子型表面活性剂（10% 溶液，见材料表）（终浓度为 1.6%）以淬灭 SDS，在 37 °C 下孵育 45 分钟，同时以 950 rpm 振荡。孵育期间多次上下吹打以破坏团块。 
	注意：若团块较大且难以分散，可在 SDS 和表面活性剂处理期间将转速降低至 400 rpm。若通过移液难以解聚团块，可将样品分为两份；相应调整限制性缓冲液、SDS 和表面活性剂的体积，继续进行透化处理。随后以最低转速（200 × g）离心细胞核，小心弃去上清液，将样品合并至&#160;1X&#160;restriction&#160;buffer中，继续进行消化步骤。取 10 µL 作为未消化样品（UD）。</li>
</ol>
3. 酶消化
<ol>
	<li>每管加入 200 单位（U）Mbo I，37 °C 条件下旋转孵育（950 rpm），时间从 4 小时至过夜，以消化染色质。</li>
	<li>次日，每管再加入额外的 50 U Mbo I，37 °C 条件下旋转孵育（950 rpm）2 小时。</li>
	<li>将管置于 60 °C 孵育 20 分钟以灭活酶，随后置于冰上。 
	注意：取 10 µL 作为消化后的样品（D）。</li>
</ol>
4. DNA 末端的生物素标记
<ol>
	<li>为了填补限制性片段的突出末端并将DNA末端用生物素标记，向所有试管中加入1.5 µL的10 mM dCTP、dGTP、dTTP，20 µL的0.4 mM生物素-dATP，17.5 µL的Tris低EDTA（TLE）缓冲液[10 mM Tris-HCl，0.1 mM EDTA，pH 8.0]，以及10 µL的5 U/µL Klenow酶（DNA聚合酶I大片段）。轻轻混匀后，在37 °C孵育75分钟，每10秒振荡一次，每次持续30秒，振荡速度为700 rpm。在配制连接反应混合液时，将所有试管置于冰上。</li>
</ol>
5. 连接
<ol>
	<li>将每份消化后的染色质混合物转移至分别含有连接反应液的1 mL离心管中（100 µL 10倍连接缓冲液、10 µL 10 mg/mL牛血清白蛋白、15 U T4 DNA连接酶和425 µL双蒸水[ddH2O]）。用移液器轻轻吹打充分混匀，并在16 °C下孵育过夜。</li>
</ol>
6. 交联逆转与DNA纯化
<ol>
	<li>每管加入 50 µL 浓度为 10 mg/mL 的蛋白酶 K 以降解蛋白质，在 37 °C 下孵育 2 小时。通过将温度升至 65 °C 并过夜孵育，逆转交联。</li>
	<li>加入 20 µL 浓度为 10 mg/mL 的 RNase A 以降解 RNA，在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
	<li>进行苯酚:氯仿抽提，随后进行乙醇沉淀。
	<ol>
		<li>加入 1 体积苯酚-氯仿，通过倒置充分混匀，获得均一的白色相。 
		注意：苯酚为危险化学品，请遵守相应的健康与安全规定，在通风橱中操作。</li>
		<li>在 15,000 × g 下离心 15 分钟，将水相转移至新的 2 mL 微离心管中。用 100 µL TLE 缓冲液对下层进行反向抽提，并将水相转移至同一 2 mL 管中。</li>
		<li>加入 2 体积 100% 乙醇（EtOH）、0.1 体积 3 M 醋酸钠和 2 µL 浓度为 20 mg/mL 的糖原以沉淀 DNA。在 -20 °C 下孵育 2 小时至过夜。</li>
		<li>在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 30 分钟，用预冷的 70% EtOH 洗涤沉淀物两次。在室温下干燥沉淀，加入 100 µL TLE 缓冲液重悬。根据制造商说明书，使用可特异性结合 DNA 的荧光染料和荧光计对 DNA 进行定量（材料表）。 
		注意：本方案可在此处暂停。连接产物可短期储存于 4 °C，或长期储存于 -20 °C。取 100 ng 样品作为连接样本（L）用于质量控制。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7.&#160;评估 Hi-C 模板质量
<ol>
	<li>消化与连接的定性对照
	<ol>
		<li>通过逆转交联从 UD 和 D 分装样品中纯化 DNA，并按上述方法进行苯酚:氯仿抽提和乙醇沉淀。</li>
		<li>在1.5%琼脂糖凝胶中各上样100 ng的UD、D和L样品。观察D样品中是否出现中心约在500 bp的弥散条带，而L样品则应显示高分子量条带（参见代表性结果）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化效率的定量对照 
	注意：为更准确地评估消化效率，可使用UD和D样品作为模板，采用以下设计的引物进行定量聚合酶链式反应（qPCR）。
	<ol>
		<li>设计一对引物，用于扩增包含所用消化酶识别位点的DNA片段（本方案中为Mbo I），该片段在步骤7.2.3的公式中称为R。</li>
		<li>设计另一对引物，用于扩增一个不含该消化酶识别位点的对照DNA片段（本方案中为Mbo I），该片段在步骤7.2.3的公式中称为C。</li>
		<li>利用扩增所得的循环阈值（Ct值），根据下述公式计算限制性酶切效率： 
		% 酶切率 = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD} 
		其中CtR表示样品D和样品UD中片段R的Ct值，CtC表示相应样品中片段C的Ct值。 
		注意：酶切百分比反映了限制性内切酶对含有酶切位点（R）的DNA片段的切割效率，相对于不含该位点的对照（C）片段而言。建议酶切效率应≥ 80%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>已知相互作用的检测
	<ol>
		<li>通过PCR扩增一个内部连接对照，以检测短程和/或中程至长程的染色质相互作用（参见代表性结果）。</li>
		<li>或者，设计引物以扩增连接产物，其中引物位于相邻限制性片段的正向-正向或反向-反向方向。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>末端补平与生物素标记对照
	<ol>
		<li>通过扩增并消化基因组中已知相互作用或相邻限制性片段之间的连接产物，验证Hi-C标记和连接效率，方法如上所述。 
		注意：Mbo I位点（GATC）成功完成末端补平和连接后，会在连接处生成一个新的限制性内切酶Cla I识别位点（ATCGAT），同时恢复原有的Mbo I位点。</li>
		<li>用Mbo I、Cla I或两者共同消化PCR产物。将样品在1.5–2%琼脂糖凝胶上电泳后，通过定量分析被切割和未被切割条带的强度，估算3C和Hi-C连接位点的相对数量26。 
		注意：期望效率达到&#62; 70%（参见代表性结果）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 超声处理
<ol>
	<li>超声处理样品以获得200-500 bp的DNA片段。对于本实验方案所用仪器（见材料表），每管中将样品（5至10 µg）溶于130 µL的ddH2O中，并将仪器设置为产生400 bp片段的条件：液面高度：10；占空比：10%；峰值入射功率（w）：140；每脉冲循环数：200；时间（s）：80。</li>
</ol>
9. 生物素去除/末端修复
注意：以下步骤已针对 5 µg 的 Hi-C DNA 进行调整。
<ol>
	<li>为进行生物素去除，将样品（130 µL）转移至新的微量离心管中。加入16 µL 10x连接缓冲液、2 µL 10 mM dATP、5 µL T4 DNA聚合酶（15U）和7 µL ddH2O（总体积为160 µL）。在20 °C孵育30分钟。</li>
	<li>加入5 µL 10 mM dNTPs、4 µL 10x连接缓冲液、5 µL T4多核苷酸激酶（10 U/µL）、1 µL Klenow酶和25 µL ddH2O（总体积为200 µL）。在20 °C孵育30分钟。</li>
</ol>
10. 大小筛选
<ol>
	<li>为选择主要在250-550 bp大小范围内的片段，首先按照制造商说明书进行连续的固相可逆固定（SPRI）大小筛选，先用0.6倍体积，再用0.90倍体积，最后使用100 µL TLE洗脱DNA。</li>
</ol>
11. 生物素下拉/A加尾/接头连接
注意：&#160;通过涡旋重悬磁珠进行洗涤，将样品在旋转轮上旋转 3 分钟，然后短暂离心，将样品置于磁力架上。待磁珠吸附至磁铁后，弃去上清液，并进行下一步洗涤操作。洗涤步骤可在 55 °C 的温控金属块上结合旋转操作进行，以替代旋转轮。
<ol>
	<li>用TLE将每个样本的终体积补至300 µL用于下拉实验。配制磁珠洗涤缓冲液：1x Tween缓冲液（TB）（TB：5 mM Tris-HCl pH 8.0，0.5 mM EDTA，1 M NaCl，0.05% Tween）、0.5x TB、1x无Tween缓冲液（NTB）（5 mM Tris-HCl pH 8.0，0.5 mM EDTA，1 M NaCl）、2x NTB。</li>
	<li>每文库使用150 µL链霉亲和素连接的磁珠（参见材料表）。用400 µL 1x TB将磁珠洗涤2次。&#160;然后将磁珠重悬于300 µL 2x NTB中。</li>
	<li>将磁珠与300 µL Hi-C材料混合，在旋转仪上室温孵育30分钟，使生物素与链霉亲和素磁珠结合。</li>
	<li>用400 µL 0.5x TB洗涤磁珠，在55 °C孵育3分钟，同时以750 rpm旋转。再用200 µL 1x限制性内切酶缓冲液洗涤磁珠。</li>
	<li>将磁珠重悬于100 µL dATP加尾反应体系中（含5 µL 10 mM dATP、10 µL 10x限制性内切酶缓冲液、5 µL Klenow exo- 和80 µL ddH2O）。37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>去除上清液，用400 µL 0.5x TB洗涤磁珠2次，每次在55 °C孵育3分钟并以750 rpm旋转。</li>
	<li>用400 µL 1x NTB洗涤磁珠，然后用100 µL 1x连接缓冲液洗涤。</li>
	<li>将磁珠重悬于50 µL 1x连接缓冲液中，并将悬液转移至新管。加入4 µL预退火的PE接头（15 µM母液）和2 µL T4 DNA连接酶（400 U/µL，即每管800 U），室温孵育2小时。 
	注意：通过等体积混合PE 1.0和PE 2.0接头（30 µM母液），室温孵育10分钟进行预退火（参见材料表）。</li>
	<li>去除上清液，用400 µL TB洗涤磁珠2次以重新捕获磁珠。再用200 µL 1x NTB洗涤，接着用100 µL 1x限制性内切酶缓冲液洗涤，最后将磁珠重悬于40 µL 1x限制性内切酶缓冲液中。</li>
</ol>
12. PCR 扩增
<ol>
	<li>设置25 µL反应体系的PCR，循环数分别为5、6、7和8个循环。每个PCR反应使用以下组分：
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
		<tbody>
			<tr>
				<td colspan="2">反应体系配方</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>Hi-C磁珠</td>
				<td>2.5 µL</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>10 µM PE PCR引物1（材料表）</td>
				<td>0.75 µL</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>10 µM PE PCR引物2（材料表）</td>
				<td>0.75 µL</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>10 mM dNTP</td>
				<td>0.6 µL</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>5x反应缓冲液</td>
				<td>5 µL</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>DNA聚合酶</td>
				<td>0.3 µL</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>ddH2O</td>
				<td>14.65 µL</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>总计</td>
				<td>25 µL</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
		<tbody>
			<tr>
				<td>循环数</td>
				<td>温度</td>
				<td>时间</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>1</td>
				<td>98 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
			<tr>
				<td rowspan="3">n个循环</td>
				<td>98 °C</td>
				<td>10 s</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>65 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>72 °C</td>
				<td>30 s</td>
			</tr>
			<tr>
				<td>1</td>
				<td>72 °C</td>
				<td>7 min</td>
			</tr>
		</tbody>
	</table>
	</li>
</ol>
13. 最终PCR扩增
<ol>
	<li>使用与上述相同的条件以及选定的循环次数进行最终PCR扩增。以5 µL Hi-C磁珠作为模板，在50 µL反应体系中分装样品。</li>
	<li>收集所有PCR反应产物并转移至一个新的离心管中。使用磁力架去除链霉亲和素磁珠，回收上清液（PCR产物）。将磁珠转移至新的离心管中，按照步骤11.2.9所述方法洗涤磁珠，并保存于1×限制性酶切缓冲液中，置于4 °C备用。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用等体积0.85倍的SPRI磁珠纯化PCR产物。用30 µL TLE缓冲液洗脱。</li>
	<li>使用荧光定量仪对Hi-C文库进行定量，并通过基于芯片的毛细管电泳确认文库质量。</li>
	<li>作为最后的质量检测步骤，取1 µL Hi-C文库作为模板，在与步骤12.1所述相同条件下进行10个循环的PCR扩增。将PCR产物均分至两个微量离心管中：其中一份用Cla I进行消化，另一份不作处理作为对照。将产物在1.5–2%琼脂糖凝胶中电泳（参见代表性结果）。</li>
	<li>在合适的测序平台上进行50 bp或75 bp的双端测序。</li>
</ol>

<ol><li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+territories%2C+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).</li>
<li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li>
<li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485, 376-380 (2012).</li>
<li>Sexton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+folding+and+functional+organization+principles+of+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.</a> Cell. 148 (3), 458-472 (2012).</li>
<li>Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+domains%3A+the+unit+of+chromosome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin domains: the unit of chromosome organization.</a> Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).</li>
<li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+function+of+the+3D+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).</li>
<li>Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+TADs%3A+how+alterations+of+chromatin+domains+result+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease.</a> Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).</li>
<li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%3A+master+weaver+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li>
<li>Hong, S., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+characterization+of+chromatin+domain+boundary-associated+genomic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements.</a> Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).</li>
<li>Zuin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+and+CTCF+differentially+affect+chromatin+architecture+and+gene+expression+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+inversion+of+CTCF+sites+alters+genome+topology+and+enhancer%2Fpromoter+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function.</a> Cell. 162, 900-910 (2015).</li>
<li>Lupiáñez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161, 1012-1025 (2015).</li>
<li>Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).</li>
<li>Merkenschlager, M., Nora, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+and+cohesin+in+genome+folding+and+transcriptional+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genomics+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).</li>
<li>Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+and+cohesin+regulate+chromatin+loop+stability+with+distinct+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics.</a> Elife. 6, 1-10 (2017).</li>
<li>Van Bortle, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulator+function+and+topological+domain+border+strength+scale+with+architectural+protein+occupancy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy.</a> Genome Biology. 15, 82(2014).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189(2018).</li>
<li>Ulianov, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+chromatin+and+transcription+play+a+key+role+in+chromosome+partitioning+into+topologically+associating+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains.</a> Genome Research. 26, 70-84 (2016).</li>
<li>Rowley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionarily+conserved+principles+predict+3D+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization.</a> Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).</li>
<li>Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actual+ligation+frequencies+in+the+chromosome+conformation+capture+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure.</a> PLoS One. 8, 60403(2013).</li>
<li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disclosure+of+a+structural+milieu+for+the+proximity+ligation+reveals+the+elusive+nature+of+an+active+chromatin+hub%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub.</a> Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li>
<li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+map+of+the+human+genome+at+kilobase+resolution+reveals+principles+of+chromatin+looping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li>
<li>Nagano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Hi-C+results+using+in-solution+versus+in-nucleus+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation.</a> Genome Biology. 16, 175(2015).</li>
<li>Arzate-Mejía, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+dissection+of+domain+boundaries+affect+genome+topology+and+gene+transcription+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila.</a> Nature Communications. 11, 894(2020).</li>
<li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter+capture+Hi-C%3A+high-resolution%2C+genome-wide+profiling+of+promoter+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).</li>
<li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiC-Pro%3A+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing.</a> Genome Biology. 16, 259(2015).</li>
<li>Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiQC%3A+Summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 10, 1093(2016).</li>
<li>Wingett, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiCUP%3A+pipeline+for+mapping+and+processing+Hi-C+data%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Research%22%5BJournal%5D)">HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data.</a> F1000 Research. 4, 1310(2015).</li>
<li>Imakaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+correction+of+Hi-C+data+reveals+hallmarks+of+chromosome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization.</a> Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).</li>
<li>Akdemir, K. C., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiCPlotter+integrates+genomic+data+with+interaction+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biolog%22%5BJournal%5D)">HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices.</a> Genome Biolog. 16, 198(2015).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> Nature Communications. 9, 189(2018).</li>
<li>Ando-Kuri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+and+promoter-centric+3D+genome+organization+temporally+resolved+during+a+circadian+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Cuellar-Partida, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+priors+for+identifying+active+transcription+factor+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites.</a> Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biology. 9, 137(2008).</li>
<li>Ong, C. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribosyl%29ation+regulates+insulator+function+and+intrachromosomal+interactions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila.</a> Cell. 155 (1), 148-159 (2013).</li>
<li>Fresán, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulator+protein+CTCF+regulates+Drosophila+steroidogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis.</a> Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).</li>
<li>Quinodoz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+promotes+the+formation+of+spatial+compartments+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus.</a> Cell. 174, 744-757 (2018).</li>
<li>Olivares-Chauvet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+pairwise+and+multi-way+chromosomal+conformations+using+chromosomal+walks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks.</a> Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).</li>
<li>Beagrie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+multi-enhancer+contacts+captured+by+genome+architecture+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping.</a> Nature. 543, 519-524 (2017).</li>
<li>Redolfi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamC+reveals+principles+of+chromatin+folding+in+vivo+without+crosslinking+and+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).</li>
<li>Maxwell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HiChIP%3A+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13, 919-922 (2016).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-BERST%3A+Defining+subnuclear+proteomic+landscapes+at+genomic+elements+with+dCas9-APEX2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2.</a> Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本文介绍的细胞核内Hi-C方法使得能够在高分辨率下深入探究黑腹果蝇（Drosophila）基因组的拓扑结构，从而在不同基因组尺度上观察基因组相互作用，从启动子与增强子等调控元件之间的染色质环，到拓扑关联结构域（TADs）以及大尺度区室的鉴定25。相同技术经过部分修改后也已高效应用于哺乳动物组织33。例如，在处理组织样本而非单细胞悬液时，需将组织通过70 µm滤网过滤，并在使用Dounce匀浆器匀浆的同时进行裂解步骤。此外，由于哺乳动物基因组大小是果蝇基因组的25倍，因此构建1–5 kb分辨率矩阵所需的有效读段对数量更多。细胞核内Hi-C方法与原始Hi-C方法2的主要区别在于：前者在连接反应前避免使用1% SDS在65 °C条件下裂解细胞核，从而保持细胞核的完整性；并且连接反应体积为1 mL，而非7 mL23,24。
该实验方...

在真核生物中，基因组被划分为染色体，在间期占据细胞核空间中的特定区域1。构成染色体的染色质可分为两种主要状态：一种是可接近的、允许转录的染色质，另一种是致密的、抑制转录的染色质。这两种染色质状态在细胞核空间中相互分离，极少混合，从而在细胞核内形成两个不同的区室2。在亚兆碱基尺度上，存在分隔高频染色质相互作用区域的边界，这些区域被称为拓扑关联结构域（TADs），标志着染色体的高级结构3,4,5。在哺乳动物中，TAD边界通常由黏连蛋白复合物（cohesin）和CCCTC结合因子（CTCF）占据6,7,8。黏连蛋白复合物可推动染色质外推，并在基因组序列中呈会聚方向排列的CTCF结合位点处停止，从而形成稳定的染色质环结构9,10,13,14。若TAD边界处的CTCF DNA结合位点发生遗传破坏，或CTCF与黏连蛋白的蛋白丰度降低，将导致调控元件之间出现异常相互作用、TAD结构丧失以及基因表达失调9,10,11,13,14。
在果蝇中，拓扑关联结构域（TAD）的边界区域被多种锚定蛋白（AP）占据，包括与边界元件相关的32 kDa蛋白（BEAF-32）、基序1结合蛋白（M1BP）、中心体蛋白190（CP190）、hairy-wing抑制因子（SuHW）以及CTCF，并且这些区域富集了活跃的组蛋白修饰和RNA聚合酶II16,17,18。有研究提出，在果蝇中TAD的形成可能是转录活动的结果13,17,19，而各个独立的锚定蛋白在边界形成及绝缘功能中的确切作用仍在深入研究之中。因此，果蝇中的结构域形成究竟是转录状态相似区域聚集的唯一结果，还是包括CTCF在内的锚定蛋白也参与了边界建立，目前尚未完全阐明。通过染色质构象捕获技术结合下一代测序的发展，现已能够以高分辨率探索基因组间的相互作用。Hi-C实验方案最初采用在溶液中进行连接步骤&#34;in solution&#34;2，旨在避免染色质片段之间产生非特异性连接产物。然而，多项研究指出，数据中有用的信号实际上来源于部分裂解细胞核内、而非完全处于溶液中的染色质片段所形成的连接产物20,21。
随后，该实验方案经过修改，将连接反应在细胞核内进行，作为单细胞Hi-C实验的一部分22。核内Hi-C方案随后被引入群体细胞Hi-C实验中，以在全基因组距离范围内获得更一致的覆盖度，并减少技术性噪声23,24。本文详细描述的实验方案基于群体核内Hi-C方案23,24，并被用于研究在果蝇Notch基因位点的结构域边界上，遗传性删除CTCF和M1BP的DNA结合基序所产生的影响25。结果表明，在边界处改变转录因子结合基序会对Notch结构域的形成产生显著影响，导致Notch位点周围区域出现更大的拓扑结构缺陷，并引起基因表达失调。这表明，结构域边界处的遗传元件在维持果蝇基因组拓扑结构和基因表达中具有重要作用25。

<table><tbody><tr><td>16% (vol/vol) 多聚甲醛溶液</td><td>Agar Scientific</td><td>R1026</td><td></td></tr><tr><td>生物素-14-dATP</td><td>Invitrogen</td><td>CA1524-016</td><td></td></tr><tr><td>ClaI 酶</td><td>NEB</td><td>R0197S</td><td></td></tr><tr><td>COVARIS 超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td>LE220-M220</td><td></td></tr><tr><td>Cut Smart 缓冲液</td><td>NEB</td><td>B72002S</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）1x</td><td>Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1 磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>65002</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），无菌过滤</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Klenow DNA 聚合酶 I 大片段</td><td>NEB</td><td>M0210L</td><td></td></tr><tr><td>Klenow exo(-)</td><td>NEB</td><td>M0210S</td><td></td></tr><tr><td>连接缓冲液</td><td>NEB</td><td>B020S</td><td></td></tr><tr><td>MboI 酶</td><td>NEB</td><td>R0147M</td><td></td></tr><tr><td>NP40-Igepal</td><td>SIGMA</td><td>CA-420</td><td>用于裂解缓冲液中的非离子型表面活性剂</td></tr><tr><td>PE 接头 1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG&lt;br/&gt; GAATGCCGAG-3'</td><td></td></tr><tr><td>PE 接头 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT&lt;br/&gt; CTTCCGATCT-3'</td><td></td></tr><tr><td>PE PCR 引物 1.0</td><td>Illumina</td><td>5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT&lt;br/&gt; CTACACTCTTTCCCTACACGACG&lt;br/&gt; CTCTTCCGATCT-3'</td><td></td></tr><tr><td>PE PCR 引物 2.0</td><td>Illumina</td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG&lt;br/&gt; ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA&lt;br/&gt; ACCGCTCTTCCGATCT-3'</td><td></td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇 25:24:1</td><td>SIGMA</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>引物 1（已知互作，图 2A）</td><td>Sigma</td><td>5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'</td><td></td></tr><tr><td>引物 2（已知互作，图 2A）</td><td>Sigma</td><td>5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Roche</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>SPRI 磁珠</td><td>Beckman</td><td>B23318</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Invitrogen</td><td>15224-025</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 聚合酶</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶（PNK）&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>TaqPhusion</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>DNA 聚合酶</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>用于淬灭 SDS 的非离子型表面活性剂</td></tr></tbody></table>

果蝇细胞核内hi-c技术

In-Nucleus Hi-C in Drosophila Cells

基因组被组织成由边界分隔的拓扑关联结构域（TAD），这些边界将不同结构域之间的相互作用隔离开来。在果蝇（Drosophila）中，TAD 的形成机制及其边界的特性仍在研究之中。本文所述的细胞核内 Hi-C 方法的应用有助于解析位于隔离 Notch 基因的 TAD 边界处的结构蛋白（AP）结合位点的功能。对导致结构蛋白丢失的结构域边界进行基因改造，会引起 TAD 融合、转录异常以及远距离拓扑结构的改变。这些结果提供了证据，表明遗传元件在果蝇中参与了结构域边界的形成以及基因表达的调控。本文详细描述了细胞核内 Hi-C 方法，该方法提供了评估实验质量的重要质控节点，并附有完整的实验流程。同时展示了在不同基因组尺度上分析基因组互作所需的测序读段数量和有效 Hi-C 配对数量。利用 CRISPR/Cas9 介导的调控元件基因编辑，结合本细胞核内 Hi-C 方案进行高分辨率的基因组互作分析，可能成为研究遗传元件结构功能的有力组合策略。

下文描述了一次成功的 Hi-C 实验方案的结果（Hi-C 实验流程的概要见图1A）。在细胞核内进行的 Hi-C 实验过程中包含多个质量控制检查点。在染色质限制性酶切之前（UD）和之后（D），以及连接反应后（L），分别采集了样品。随后逆转交联，并纯化 DNA，进行琼脂糖凝胶电泳。当使用 Mbo I 酶切成功时，可观察到大小为 200–1000 bp 的弥散条带（图1B）。预期的片段大小取决于所选用的限制性内切酶。若连接反应成功，则在凝胶顶部可见一条高分子量的条带（图1B）。如实验方案中详细所述，还可通过 qPCR 确认酶切效率。可接受的酶切效率应达到 80% 或更高（图1C）。
为了详细评估 Hi-C 连接效率，可以设计引物以扩增内部连接产物对照，其中引物位于相邻限制性片段上的正向-正向或反向-反向方向。或者，也可以设计引物以扩增已知的相互作用区域...

基因组在细胞核空间内以不同的结构形式组织，这些结构可通过染色体构象捕获技术揭示。细胞核内Hi-C方法可获得果蝇细胞系中全基因组范围的染色质相互作用数据，从而生成可在限制性酶切片段水平上以兆碱基分辨率进行分析的接触图谱。

果蝇细胞核内Hi-C技术

基因组被组织成由边界分隔的拓扑关联结构域（TADs），这些边界可隔离结构域之间的相互作用。在黑腹果蝇（Drosophila）中，……

细胞核 Hi-C 实验方案可用于在不同分辨率下探索染色体构象，以表征染色质环、结构域及基因组区室的组织方式。该方案可在不同尺度上实现基因组互作的高分辨率分析，对全范围的基因组距离提供更一致的覆盖，并减少技术噪声。将该方案与基因编辑技术相结合，是验证遗传元件结构功能的有力策略。该方法还可用于表征导致疾病的结构变异。核内Hi-C实验方案可用于研究任意真核生物基因组的基因组结构。通过移液进行SDS和Triton处理，可使核团块解聚，因为聚集物会干扰酶促反应效率，并且在测序前务必进行适当的质量控制检测。首先，将无甲醇的甲醛加入到17.5毫升含10%胎牛血清（FBS）的Schneider培养基中的1×10⁷个Schneider 2 Plus果蝇细胞中，使甲醛终浓度为2%。室温孵育10分钟，每60秒混匀一次，或在旋转仪上持续旋转孵育。随后加入甘氨酸至终浓度为0.125 mol/L，并混匀。室温反应5分钟后，置于冰上15分钟，通过离心收集细胞，并用25毫升预冷的PBS小心重悬细胞沉淀，再次离心收集细胞。离心结束后，将细胞重悬于1毫升冰预冷的裂解缓冲液中进行细胞计数，并调整细胞浓度至1×10⁶个细胞/毫升。将细胞置于冰上孵育30分钟，每隔两分钟倒置离心管一次以混匀，并通过另一次离心收集细胞。将沉淀重悬于1毫升新鲜的预冷裂解缓冲液中。离心后，用1毫升1.25倍浓度的限制性缓冲液洗涤裂解物。再次离心以收集裂解液。用360 µL新鲜限制性缓冲液和11 µL 10% SDS通过小心移液重悬沉淀，在37°C、7–950 ×g条件下孵育45分钟，期间偶尔移液。孵育结束后，加入75 µL非离子型表面活性剂终止透化反应，将离心管放回孵育器，在950 ×g条件下继续振荡孵育45分钟，期间偶尔移液。进行染色质消化时，向离心管中加入 200 单位的 Mbo1，在 37 摄氏度下旋转孵育 4 至 16 小时。孵育结束后，于 60 摄氏度孵育 20 分钟以灭活酶活性。为填补限制性片段的突出末端并将生物素标记到 DNA 末端，向管中依次加入 1.5 微升 10 毫摩尔的 dCTP、dGTP、dTTP，20 微升 0.4 毫摩尔的生物素-dATP，17.5 微升低 EDTA 浓度的 Tris 缓冲液，以及 10 微升浓度为每微升 5 单位的 DNA 聚合酶 I 大片段，轻轻混匀。将反应在37摄氏度孵育75分钟，每10秒以700转/分钟振荡30秒。孵育结束后，将连接混合物加入染色质中，并用轻柔混匀的方式调整终体积至1毫升，于16摄氏度过夜孵育。为降解样品中的蛋白质，向管中加入50 µL浓度为10 mg/mL的蛋白酶K，于37摄氏度孵育2小时。孵育结束后，将温度升至65摄氏度过夜，以逆转样品的交联。次日早晨，加入10微升浓度为10毫克/毫升的RNA酶A以降解RNA。在37摄氏度下反应一小时后，向管中加入等体

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

果蝇细胞中的核内高C

本方案演示了如何对解剖后的黑腹果蝇幼虫进行免疫组织化学染色。...

Drosophila 幼虫神经肌肉接头免疫组织化学

本文展示了一种利用快速扫描共聚焦显微镜透过蛹壳直接成像细胞行为的方法。通过保持蛹壳完整，该方法能够在果蝇发育的某一难以直接研究的阶段，实现对动态细胞过程的观察与测量。...

透过黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）蛹壳进行成像

基于亲和力的标记细胞核分离 果蝇 用于基因表达分析的组织样本

所描述的RNA 原位 杂交方案可实现对完整组织中RNA的检测 果蝇...

高分辨率荧光 原位 杂交 果蝇 使用酪酰胺信号放大法的胚胎与组织检测

伤口诱导的多倍体现象是一种保守的组织修复策略，细胞通过增大体积而非分裂来补偿细胞损失。本文详细介绍了如何利用果蝇作为模型，检测上皮伤口修复过程中多倍体化及其遗传调控的实验方案。...

一种用于研究伤口诱导多倍体化的 Drosophila 模型

本实验方案的目的是将罗丹明标记的球状肌动蛋白注射到Drosophila胚胎中，并在热应激后观察细胞核内肌动蛋白棒状结构的组装过程。...

活细胞热应激下核内肌动蛋白杆状结构的成像 果蝇 胚胎

本方案旨在可视化Drosophila多线细胞中的异染色质聚集体。...

用于可视化异染色质相关蛋白的免疫荧光染色 果蝇 唾液腺

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和磷酸化组蛋白H3（pH3）标记进行细胞周期分析是一种多步骤实验流程，可能需要进行大量优化。本文提供了一个详细方案，描述了该流程的全部步骤，包括图像分析和定量方法，以区分处于不同细胞周期阶段的细胞。...

5-乙炔基-2'-脱氧尿苷/磷酸化组蛋白 H3 双标记细胞周期进程分析方案 果蝇 神经干细胞

在 果蝇卵母细胞核在卵子发生过程中会发生微管依赖性迁移。本文介绍了一种通过卵室活体成像来追踪该迁移过程的实验方案...

Drosophila 卵母细胞中的核迁移

该方案描述了进行杂交链式反应荧光检测所需的步骤 原位 杂交（HCR-FISH）在 黑腹果蝇...

杂交链式反应FISH在发育过程中的应用 果蝇 视叶

学习果蝇细胞核内高分辨率Hi-C技术，用于分析染色质相互作用和拓扑关联结构域边界。该方法结合CRISPR基因编辑，可研究基因组三维结构调控机制。

果蝇细胞核内Hi-C技术

探索更多视频