Name: 猪角膜组织外植研究单纯疱疹病毒-1抗病毒药物的功效 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 了解利用猪角膜外植体模型评估单纯疱疹病毒-1抗病毒药物功效的方法。该体外组织模型为传统动物实验提供了成本更低、操作更简便的替代方案，有助于验证体外研究结果向临床应用的转化。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：R01 EY024710、RO1 AI139768 和 RO1 EY029426），资助对象为 D.S.。A.A. 获得了美国国立眼科研究所（National Eye Institute）NIH F30EY025981 项目的资助。本研究使用了来自芝加哥新城区阿什兰大道 4107 号 Park Packing 公司提供的猪角膜。

本研究中使用的所有猪组织均由第三方私营机构提供，中国伊利诺伊大学的人员未参与任何动物操作。
1. 材料
<ol>
	<li>试剂
	<ol>
		<li>使用以下试剂进行噬斑实验：甲基纤维素粉末、杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素（P/S）。</li>
		<li>使用结晶紫片剂和乙醇（分子生物学级）配制噬斑实验用结晶紫溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Vero细胞生长培养基 —— 含血清DMEM完全培养基
	<ol>
		<li>在组织培养超净台内打开DMEM培养基瓶，用移液管移除55 mL培养基并弃去。向瓶中加入50 mL FBS和5 mL P/S，混匀后于4 °C冰箱中保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>噬斑实验培养基 —— 5%甲基纤维素培养基储备液
	<ol>
		<li>在500 mL玻璃瓶中加入2.5 g甲基纤维素粉末，并放入搅拌磁子，随后进行高压灭菌。待瓶冷却至室温后，加入500 mL含50 mL FBS和5 mL P/S的DMEM完全培养基。</li>
		<li>使用磁力搅拌器在4 °C下搅拌2天，然后于4 °C冰箱中保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离体猪角膜培养基的配制
	<ol>
		<li>在组织培养超净台内打开最低必需培养基（MEM）瓶，用移液管弃去10 mL MEM。</li>
		<li>向培养基中加入5 mL胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）和5 mL抗真菌-抗生素混合液（AA），混匀后于4°C冰箱中保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>结晶紫母液与工作液的配制：
	<ol>
		<li>配制结晶紫母液：将1 g结晶紫粉末溶于100 mL 20%水-乙醇溶液中。该母液（1% w/v 结晶紫）可在避光条件下保存，最长可使用一年。</li>
		<li>配制工作液：取50 mL上述母液加入350 mL水中，再加入100 mL乙醇，定容至500 mL，得到0.1% w/v的结晶紫工作液。 
		&#8203;注意：上述两种溶液均需避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验步骤
<ol>
	<li>从完整眼球中分离猪角膜17
	<ol>
		<li>从合适的供应商处收到猪眼球后，若组织处理存在延迟，请将其置于冰上保存，如图1所示。</li>
		<li>确保在操作过程中穿戴个人防护装备，以避免污染以及玻璃体液溢出导致的意外事故。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒工作区域以进行清洁和消毒。为确保工作台面稳定，请铺上实验台保护膜，并将边缘牢固地用胶带固定，如图2所示。</li>
		<li>将猪眼球放置于纱布上（图3）。使用50 mm纱布，用一只手握住猪眼球的后部（图4A），如图4B所示。</li>
		<li>使用30 G针头，在眼球上皮表面中心附近轻轻刺入一次，注意避免对基质层造成损伤（图5）。穿刺应仅限于上皮层（约100–200 µm），以避免累及基质层。</li>
		<li>使用锋利的灭菌刀片，在距离角膜1 mm处的巩膜上做一小切口。用手快速而平稳地旋转切割，切开角膜边缘，确保玻璃体液不泄漏（图6A）。用平头镊子夹住角膜-巩膜交界处，用刀片切断其余连接的眼部膜结构（图6B）。</li>
		<li>取下角膜并将其放入含2 mL角膜培养基的12孔板中。角膜应朝上放置，具体步骤如图7A-D及图8所示。</li>
		<li>在角膜表面清创部位加入5 µL病毒溶液，其中含有5 × 105斑块形成单位（PFU）的17 GFP。将含有感染猪角膜的12孔板置于含5% CO2的培养箱中孵育72小时。</li>
		<li>对实验中未使用的额外眼球喷洒10%次氯酸钠溶液，并安全地丢弃至生物危害袋中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>观察 
	注意：在添加药物前，应每天观察病毒情况。
	<ol>
		<li>打开体视显微镜和LED光源，待灯泡预热后再对角膜进行成像。小心地将角膜板移至仪器上，避免扰动液体。更换滤光片，使用GFP（380–460 nm）通道观察样本。设定曝光时间为500 ms以采集图像。</li>
		<li>首先将角膜板置于体视显微镜下，以最低放大倍数（7.5×）拍摄图像。随后依次提高放大倍数（例如15×、25×、35×），确保清晰观察到病毒扩散和树突状结构的形成。</li>
		<li>务必在拍摄后将感染的角膜放回组织培养箱中，并保存所有采集的图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>病毒感染定量 
	注意：应每天评估猪角膜中的病毒滴度，以分析药物处理的效果。
	<ol>
		<li>为进行病毒定量，若使用6孔板，则在感染前一天以每孔5 × 105个细胞的密度接种Vero细胞（如本实验所示）。将接种后的细胞过夜培养，确保其达到汇合状态以用于病毒定量。</li>
		<li>将500 µL无血清培养基分装至多个微量离心管中。将无菌棉签浸入装有无血清培养基的管中，棉签需在使用前至少浸泡湿润5分钟。</li>
		<li>在不扰动底层培养基的前提下，将感染的猪角膜板转移至生物安全柜中。使用湿润的棉签，在感染猪角膜中心直径5 mm范围内顺时针旋转3圈，再逆时针旋转3圈，避免施加过大压力。</li>
		<li>将棉签重新插入装有无血清培养基的微量离心管中，顺时针和逆时针各旋转5次。应将棉签的金属杆剪短，使其完全能放入微量离心管中，并可盖紧管盖。</li>
		<li>将含有棉签头的微量离心管置于涡旋振荡器上，高速振荡1分钟。</li>
		<li>通过斑块分析法对这些样本进行病毒定量。 
		注意：该定量步骤应在感染后第2、4天进行，第6天可选。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过斑块分析法进行病毒定量 
	注意：进行斑块分析时，需将Vero细胞培养并接种于6孔板中，确保在开始实验前细胞汇合度达到90%。可使用一个汇合的75 cm2培养瓶中的细胞。以下所有步骤均需在生物安全柜内进行。
	<ol>
		<li>吸除培养基后，用10 mL新鲜磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养瓶中的汇合单层Vero细胞。吸除第一遍清洗液后，再用PBS重复清洗一次。</li>
		<li>向细胞单层加入1 mL 0.05%胰蛋白酶溶液。将培养瓶在37 °C孵育5分钟。肉眼观察确认细胞是否已从瓶内表面脱落。若未完全脱落，再等待5分钟后重新检查。当细胞明显脱落时，向单层细胞中加入9 mL全培养基，确保细胞完全从瓶壁脱离。</li>
		<li>将培养瓶中的所有细胞连同全培养基收集至15 mL离心管中。</li>
		<li>对于用于斑块分析的每个6孔板孔，取离心管中的300 µL细胞悬液。每个孔补充2 mL全培养基。将板放入培养箱中过夜，使细胞生长并形成汇合单层。</li>
		<li>为进行斑块分析，在病毒定量前需对样本进行系列稀释。</li>
		<li>使用无血清培养基在微量离心管中对病毒进行log10倍比稀释，直至达到10-8稀释度。当稀释至10-3时，吸除6孔板中细胞的生长培养基后，向细胞单层加入1 mL该稀释液，此为感染步骤。将感染后的板在37 °C培养箱中孵育2小时。</li>
		<li>吸除现有感染液，用PBS轻轻洗涤两次以覆盖细胞，然后向所有6个孔中每孔加入2 mL含甲基纤维素的培养基。孵育72小时，或直至可见斑块形成。斑块可通过细胞单层中出现的小间隙来识别。</li>
		<li>沿每孔边缘缓慢加入1 mL甲醇，利用孔壁作为导流。将6孔板在室温下孵育15分钟。小心吸除各孔内容物，避免扰动或震荡细胞单层。</li>
		<li>向6孔板的每孔加入1 mL结晶紫工作液，确保覆盖所有细胞。将6孔板置于避光条件下孵育30分钟。通过吸除方式弃去结晶紫溶液，并将孔在吸水纸上干燥。</li>
		<li>计数最高稀释度孔中的斑块数量，以量化起始溶液中的总病毒含量。重复该过程两次以确认病毒滴度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Liesegang, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+epidemiology+and+ocular+importance%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus epidemiology and ocular importance.</a> Cornea. 20 (1), 1-13 (2001).</li>
<li>Farooq, A. V., Valyi-Nagy, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediators+and+mechanisms+of+herpes+simplex+virus+entry+into+ocular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Mediators and mechanisms of herpes simplex virus entry into ocular cells.</a> Current Eye Research. 35 (6), 445-450 (2010).</li>
<li>Farooq, A. V., Shah, A., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+herpesviruses+in+ocular+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Adaptation+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">The role of herpesviruses in ocular infections.</a> Virus Adaptation and Treatment. 2 (1), 115-123 (2010).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+and+coinfection+with+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+in+the+United+States%2C+1988-1994%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence and coinfection with herpes simplex virus type 1 and type 2 in the United States, 1988-1994.</a> Journal of Infectious Diseases. 185 (8), 1019-1024 (2002).</li>
<li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+herpes+simplex+virus+type+1+and+type+2+seroprevalence+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States.</a> Journal of the American Medical Association. 296 (8), 964-973 (2006).</li>
<li>Koganti, R., Yadavalli, T., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+emerging+therapies+for+ocular+herpes+simplex+virus+type-1+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Current and emerging therapies for ocular herpes simplex virus type-1 infections.</a> Microorganisms. 7 (10), (2019).</li>
<li>Lobo, A. -, Agelidis, A. M., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+herpes+simplex+keratitis%3A+The+host+cell+response+and+ocular+surface+sequelae+to+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Ocular+Surface%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of herpes simplex keratitis: The host cell response and ocular surface sequelae to infection and inflammation.</a> Ocular Surface. 17 (1), 40-49 (2019).</li>
<li>Koujah, L., Suryawanshi, R. K., Shukla, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+processes+activated+by+herpes+simplex+virus-1+%28HSV-1%29+infection+in+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pathological processes activated by herpes simplex virus-1 (HSV-1) infection in the cornea.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (3), 405-419 (2019).</li>
<li>Lass, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+medications+and+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Antiviral medications and corneal wound healing.</a> Antiviral Research. 4 (3), 143-157 (1984).</li>
<li>Burns, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterisation+of+resistant+Herpes+simplex+virus+after+acyclovir+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterisation of resistant Herpes simplex virus after acyclovir therapy.</a> Lancet. 1 (8269), 421-423 (1982).</li>
<li>Crumpacker, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antiviral+drugs+of+herpes+simplex+virus+isolated+from+a+patient+treated+with+Acyclovir%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Resistance to antiviral drugs of herpes simplex virus isolated from a patient treated with Acyclovir.</a> New England Journal of Medicine. 306 (6), 343-346 (2010).</li>
<li>Yildiz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+kidney+injury+due+to+acyclovir%5BTitle%5D)+AND+%22CEN+Case+Report%22%5BJournal%5D)">Acute kidney injury due to acyclovir.</a> CEN Case Report. 2 (1), 38-40 (2013).</li>
<li>Fleischer, R., Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyclovir+nephrotoxicity%3A+a+case+report+highlighting+the+importance+of+prevention%2C+detection%2C+and+treatment+of+acyclovir-induced+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Case+Rep+Med%22%5BJournal%5D)">Acyclovir nephrotoxicity: a case report highlighting the importance of prevention, detection, and treatment of acyclovir-induced nephropathy.</a> Case Rep Med. 2010, 1-3 (2010).</li>
<li>Thakkar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+corneas+show+dendritic+spread+and+restrict+herpes+simplex+virus+infection+that+is+not+observed+with+cultured+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Report%22%5BJournal%5D)">Cultured corneas show dendritic spread and restrict herpes simplex virus infection that is not observed with cultured corneal cells.</a> Science Report. 7, 42559(2017).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+Histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">et al Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: Histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104, 63-71 (2015).</li>
<li>Jaishankar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-target+effect+of+BX795+blocks+herpes+simplex+virus+type+1+infection+of+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">An off-target effect of BX795 blocks herpes simplex virus type 1 infection of the eye.</a> Science Translational Medicine. 10, 5861(2018).</li>
<li>Duggal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+tetrapods+inhibit+herpes+simplex+virus+infection+of+cultured+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide tetrapods inhibit herpes simplex virus infection of cultured corneas.</a> Molecular Vision. 23, 26-38 (2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突，且无竞争性经济利益。

既往研究表明，BX795 作为一种抗病毒药物在对抗 HSV-1 感染方面具有良好的前景，其作用机制为抑制 TANK 结合激酶 1（TBK1）16。TBK1 和自噬均在抑制 HSV-1 感染过程中发挥作用，这一点已在人角膜上皮细胞中得到证实。研究显示，BX795 在浓度为 10µM 时抗病毒活性达到最大，并通过关键病毒蛋白的 Western 印迹分析和病毒蚀斑分析表明，其抑制 HSV-1 感染的效果与 TFT 相当16。在猪角膜上的研究采用了相同的分析方法，并获得了与上述相似的结果：BX795 抑制感染的效果与 TFT 相当——在感染第 4 天和第 6 天拍摄的猪角膜图像显示，TFT 和 BX795 两组结果相近。用于定量分泌病毒颗粒的蚀斑实验也进一步支持了这些发现16。此外，BX795 在体外已显示出抗病毒作用，而在小鼠模型中局部应用 BX795 的体内实验也证实其可抑制角膜 HSV-1 感染16。
<p class="jove_conte...

患有眼部感染的人常出现视力丧失1。单纯疱疹病毒（HSV）在全球范围内血清阳性率较高，感染者常反复发生眼部感染，导致角膜瘢痕、基质性角膜炎和新生血管形成2,3,4,5。HSV感染还可能较少见地引起免疫功能低下且未经治疗的患者出现脑炎和全身性并发症等严重病症6,7,8。阿昔洛韦（Acyclovir, ACV）及其核苷类似物在抑制HSV-1感染以及控制其再激活方面已显示出持续疗效，但长期使用这些药物可能与肾功能衰竭、胎儿异常以及无法有效遏制病毒耐药株的出现有关9,10,11,12,13。HSV-1眼部感染的复杂性此前已在体外通过人角膜细胞的单层和三维培养模型，以及在体内通过小鼠或兔的眼部感染模型进行研究。尽管这些体外模型为HSV-1感染的细胞生物学机制提供了重要数据，但它们无法模拟角膜组织的复杂结构，对病毒树突状扩散过程的揭示也十分有限14。相比之下，体内模型虽然能更深入地展示HSV-1感染在角膜中的传播过程及免疫激活反应，但其局限性在于需要经过培训的研究人员以及大规模的动物饲养设施来支持实验的开展。
本研究采用猪角膜作为离体模型，用于研究单纯疱疹病毒1型（HSV-1）感染所诱导的损伤体系。通过组织外植体培养，可同时探讨特定药物的潜在药理作用以及感染所致损伤体系的细胞与分子生物学机制。该模型亦可经适当修改后用于其他病毒或细菌感染的研究。在本项研究中，我们利用猪角膜评估了一种临床前小分子化合物BX795的抗病毒效果。选择猪角膜的原因在于其易于获取且成本较低。此外，猪角膜模型是人眼的良好替代模型，其角膜易于分离，尺寸适中，便于感染操作与观察，且结构坚固、易于操作15。在跨角膜渗透性和系统吸收方面，猪角膜模型的复杂性也与人角膜模型具有可比性15。通过应用该模型开展研究，我们阐明了BX795作为HSV-1病毒感染有效抑制剂的潜力，进一步支持将其归类为潜在的小分子抗病毒化合物，丰富了相关文献资料16。

<table><tbody><tr><td>30 G皮下注射针头</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 玻璃瓶</td><td>托马斯科学公司</td><td>844027</td><td></td></tr><tr><td>抗真菌剂与抗生素（AA）</td><td>GIBCO</td><td>15240096</td><td>分装至5 mL离心管中，冷冻保存备用</td></tr><tr><td>台式涡旋混合器</td><td>BioDot</td><td>BDVM-3200</td><td></td></tr><tr><td>具有生物安全二级（BSL-2）认证的生物安全柜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Herasafe 2030i</td><td></td></tr><tr><td>Calgiswab 6&quot; 无菌海藻酸钙标准拭子</td><td>普尔itan</td><td>22029501</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀 - 25 cm</td><td>Biologix BE</td><td>70-1180 70-1250</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6158</td><td>将粉末存放在避光处</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良的 Eagle&amp;rsquo;s 培养基 - DMEM</td><td>GIBCO</td><td>41966029</td><td>4°C 保存 &amp;deg;直至使用前均保存于 C</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 -FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>分装至50 mL离心管中，冻存备用</td></tr><tr><td>平口镊子 &amp;ndash; 2.</td><td>Harward Instruments</td><td>72-8595</td><td></td></tr><tr><td>-80 冰箱 &amp;deg;C. -</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13 100 790</td><td></td></tr><tr><td>全新的刀片盒</td><td>托马斯科学公司</td><td>TE05091</td><td></td></tr><tr><td>瓜子</td><td>Johnson &amp;安普与约翰逊</td><td></td><td>108平方英寸文件夹，12层</td></tr><tr><td>HSV-1 17GFP</td><td>自培</td><td>-</td><td>原始毒株由美国西北大学 Patricia Spears 博士提供。表达 GFP 的 HSV-1 毒株 17</td></tr><tr><td>胰岛素、转铁蛋白、硒 - ITS</td><td>GIBCO</td><td>41400045</td><td>分装至5 mL离心管中，冻存备用</td></tr><tr><td>磁力搅拌器。</td><td>Thomas Scientific</td><td>H3710-HS</td><td></td></tr><tr><td>金属剪刀</td><td>Harward Instruments</td><td>72-8400</td><td></td></tr><tr><td>1 至 1000 微量移液器 &amp;micro;L.</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159M37</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基 - MEM</td><td>GIBCO</td><td>11095080</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C，直至使用</td></tr><tr><td>OptiMEM&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985047</td><td>4°C 下保存 &amp;deg;C 保存至使用</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td>分装至5 mL离心管中，冻存备用</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 - PBS</td><td>GIBCO</td><td>10010072</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>猪角膜</td><td>Park Packaging Co.，芝加哥，IL</td><td></td><td>根据要求特别订购</td></tr><tr><td>实验台防护罩——根据需要使用。</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S42400</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>托马斯科学公司</td><td>P7132, P7127, P7128, P7129, P7137</td><td></td></tr><tr><td>血清移液设备</td><td>托马斯科学公司</td><td>Ezpette Pro</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>卡尔·蔡司</td><td>SteREO Discovery V20</td><td></td></tr><tr><td>搅拌磁子</td><td>托马斯科学公司</td><td>F37120</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶，T175 cm²。</td><td>托马斯科学公司</td><td>T1275</td><td></td></tr><tr><td>可维持5% CO₂和37℃的组织培养孵育箱 &amp;deg;C 温度。</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Forma 50145523</td><td></td></tr><tr><td>组织培养处理板（6孔）</td><td>Thomas Scientific</td><td>T1006</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红</td><td>GIBCO</td><td>25-300-062</td><td>分装至10 mL离心管中，冻存备用</td></tr><tr><td>Vero 细胞</td><td>美国典型培养物保藏中心 ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr></tbody></table>

利用猪角膜组织外植体研究单纯疱疹病毒-1抗病毒药物的疗效

Porcine Corneal Tissue Explant to Study the Efficacy of Herpes Simplex Virus-1 Antivirals

病毒和细菌可通过角膜感染引起多种眼表缺损和退行性病变，例如伤口和溃疡。单纯疱疹病毒1型（HSV-1）在全球的血清流行率介于60%至90%之间，常引起口面部区域的黏膜皮肤病变，并可表现为病变及与感染相关的失明。尽管目前的抗病毒药物具有一定疗效，但耐药性的出现以及毒副作用的持续存在，促使人们需要开发针对这种普遍病原体的新型抗病毒药物。虽然体外评估可为新型抗病毒药物提供部分功能数据，但其无法体现眼组织在体内的复杂性。然而，体内研究成本高昂，且需要经过培训的专业人员，尤其是在处理病毒因子时。因此，离体模型是进行抗病毒测试的一种高效且经济的中间步骤。本文介绍了一种利用猪角膜离体研究HSV-1感染的实验方案，以及使用现有和新型抗病毒药物进行局部治疗的方法。我们还展示了使用HSV-1进行空斑实验的技术。文中详述的方法可用于开展类似实验，以研究与HSV-1病原体相似的感染过程。

为了评估实验性抗病毒药物的疗效，在将其推进至体内人体临床试验之前，必须进行广泛的测试。为此，需要设立阳性对照组、阴性对照组和实验组。三氟胸苷（Trifluorothymidine, TFT）长期以来被用作治疗单纯疱疹性角膜炎的首选局部用药16。作为阳性对照，经TFT处理的角膜组显示出较低的病毒感染扩散水平。阴性对照则采用溶解于PBS中的DMSO或溶剂对照。实验性临床前药物BX795作为测试组。每组分配4个角膜，药物每天添加3次。我们利用体视荧光成像的结果显示，BX795在抑制病毒扩散方面的抗病毒效果与TFT相似。在体视显微镜下通过绿色荧光通道成像可直观观察病毒的扩散情况。我们观察到，仅使用溶剂处理的阴性对照组角膜在初次病毒感染后第6天时，病毒已从中央感染区扩散至周边区域；而使用两种药物（BX795和TFT）处理的角膜在第4至第6天的图像中均显示感染已被清除（图9A）。同样，在感染后第2天和第4天采集的眼部拭子结果显示，阳性对照组和BX795处理样本中的病毒被完全抑制，而阴性对照组中则观察到感染性病毒滴度显著升高（<strong c...

我们描述了使用猪角膜来测试实验性药物抗病毒功效的方法。

病毒和细菌可通过角膜感染引起多种眼表缺损和变性，例如角膜伤口和溃疡。

了解药物在动物模型中的有效性需要耗费大量成本和人力。我们采用离体组织外植体模型的方案，显著降低了研究所需的成本和科研人员投入。该技术的主要优势在于使用猪眼，其解剖结构和生理特性与人眼非常相似，而不同于其他一些小型动物模型。在体外进行药物测试时，药物可能表现出在动物或人体模型中并不存在的疗效。离体组织系统是评估体外实验结果能否转化为动物及人体试验的最佳方法。猪角膜系统虽然劳动强度较低，但需要经过培训的技术来完成角膜的分离、维持、感染以及药物处理；尤其是从完整的猪眼球中分离角膜的过程，文字描述难以准确表达，必须通过视觉演示才能清晰呈现。从合适的供应商处收到猪眼后，将组织置于冰上保存直至处理，并穿戴适当的个人防护装备。使用70%乙醇对工作区域进行消毒，并在工作台面上铺好防护垫。当工作区域准备就绪后，将眼球放置在一块50毫米见方的纱布上，用纱布包裹住眼球后部，单手握持固定。使用30号针头，在眼球上皮表面的近中心位置小心地进行单次穿刺，注意不要损伤基质层；然后使用锋利且已灭菌的刀片，在距离角膜1毫米处的巩膜上做一小切口。用手迅速而平稳地旋转操作，注意避免玻璃体液泄漏，沿角膜边缘切割，再用平头镊子夹住角膜-巩膜交界处固定角膜，用刀片切断剩余的牵连膜组织。每分离出一个角膜，即将其组织正面朝上放入含有2毫升角膜培养基的12孔板的独立孔中，并在每片角膜表面清创部位加入5微升浓度为5×10⁵空斑形成单位的17 GFP病毒溶液。当所有角膜收集完毕后，将培养板放入37°C、5%二氧化碳的培养箱中孵育72小时，并对实验中未使用的额外眼球喷洒10%次氯酸钠溶液，随后将其安全地置于生物危害袋中处理。每天在添加药物之前，将角膜培养板置于体视显微镜下，选择GFP滤光片和500微秒的曝光时间，在最低放大倍数下采集图像，然后依次增加放大倍数进行成像，直至病毒扩散和树突形成的图像均能清晰可见。完成所有角膜的成像后，将培养板放回组织培养孵育箱中。感染前一天，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗一片汇合的Vero细胞培养物，每次清洗使用10毫升PBS，共清洗两次；然后在37摄氏度条件下，每孔加入1毫升0.05%胰蛋白酶处理5至10分钟。当细胞脱落后，加入9毫升完全培养基，确保细胞完全从培养瓶表面脱离，并将所得的细胞悬液转移至15毫升离心管中。向新的六孔板的每个孔中加入300微升细胞，随后向每个孔中加入2毫升培养基，然后将该板置于细胞培养箱中孵育过夜。次日早晨，为从每只角膜收集病毒以进行定量，需在生物安全柜中将无菌棉签头浸泡于多个微量离心管内，每根棉签加入500微升无血清培养基，浸泡时间不少于5分钟。孵育结束后，小心地将感染的猪角膜培养物放入生物安全柜中。使用湿润的棉签，在每只感染的猪角膜中心周围距中心五毫米处，顺时针旋转三圈，逆时针旋转三圈，注意不要施加过大压力。完成旋转操作后，将每根棉签在装有无血清培养基的

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免疫学与感染

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