Name: 观察活胰腺组织切片中的胰岛功能和胰岛-免疫细胞相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 学习活胰腺组织切片技术，用于研究胰岛功能及胰岛与免疫细胞的相互作用。该方法保留组织天然微环境，有助于深入理解胰腺炎、I型和II型糖尿病的发病机制。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R01 DK123292、T32 DK108736、UC4 DK104194、UG3 DK122638 和 P01 AI042288。本研究在胰腺器官捐献者糖尿病网络（nPOD；RRID:SCR_014641）的支持下完成，nPOD 是由 JDRF（nPOD：5-SRA-2018-557-Q-R）和 Leona M. &amp; Harry B. Helmsley 慈善信托基金（资助编号 #2018PG-T1D053）资助的协作型 1 型糖尿病研究项目。文中所述内容与观点由作者负责，不一定代表 nPOD 的官方立场。与 nPOD 合作提供研究资源的器官获取组织（OPO）名单请见 http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/。特此感谢佛罗里达大学的 Kevin Otto 博士提供用于制备小鼠脑片的振动切片机。&#160;

<ol><li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li>
<li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li>
<li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+diabetes%3A+etiology+and+reversibility%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li>
<li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li>
<li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li>
<li>Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+the+study+of+islet+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology.</a> Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).</li>
<li>Panzer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), 134525(2020).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatitis-induced+depletion+of+syntaxin+2+promotes+autophagy+and+increases+basolateral+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis.</a> Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+SNAP23+depletion+prevents+pancreatitis+by+attenuating+pathological+basolateral+exocytosis+and+formation+of+trypsin-activating+autolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes.</a> Autophagy. , 1-14 (2020).</li>
<li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265(2020).</li>
<li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+persisting+%CE%B2+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).</li>
<li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+in+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li>
<li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li>
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<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li>
<li>Gál, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).</li>
<li>Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638(2013).</li>
<li>Stožer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923(2013).</li>
<li>Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136(2021).</li>
<li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li>
<li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706(2013).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本实验方案的目的是阐明胰腺切片的制备方法，以及在功能和免疫学研究中使用这些切片所需的步骤。使用活体胰腺切片具有多种优势。然而，在所述实验流程中，有几个关键步骤对于保持组织的活性和可用性至关重要。操作必须迅速进行，从胰腺注射到在振动切片机上完成切片的时间应尽可能缩短，以维持组织的活性。将胰腺在切片前置于低温ECS溶液中而非室温ECS中，也有助于提高其活性。重要的是，切片绝不能置于不含蛋白酶抑制剂的培养基中。若在孵育过程中缺乏蛋白酶抑制剂，切片的活性将显著下降。
当切片在染料加载过程中短暂地未添加抑制剂时，尽管切片中仍可见基础活性，但已无法记录到高葡萄糖和KCl诱导的Ca2+流。所有用于活体切片的溶液，包括含3 mM D-葡萄糖的KRBH静息溶液、抗体孵育溶液以及任何培养基，都必须含有浓度为每毫升0.1毫克的蛋白酶抑制剂。用于切片成像的指示面板可根据实验目的和显微镜激光器的可用性进行调整。有多种不同颜色的细胞活力染料可替代本实验中使用的SYTOX Blue&#160;（参见材料表）。在Ca2+实验中，Fluo...

胰腺受累是胰腺炎、1型糖尿病（T1D）和2型糖尿病（T2D）等疾病的特征性表现1,2,3。对分离胰岛功能的研究通常需要将胰岛从其周围环境中移除4。活体胰腺组织切片技术的开发旨在研究胰腺组织的同时，保持胰岛微环境的完整性，并避免使用对胰岛造成应激的分离操作5,6,7。来自人类供体组织的胰腺组织切片已成功用于T1D研究，揭示了β细胞丢失与功能障碍过程以及免疫细胞浸润现象8,9,10,11,12,13。活体胰腺组织切片技术可应用于小鼠和人类的胰腺组织5,6,8。来自器官捐献者的人类胰腺组织切片通过与糖尿病胰腺器官捐献者网络（nPOD）合作获得。小鼠组织切片则可由多种不同品系的小鼠制备。
本方案将重点介绍非肥胖型糖尿病-重组激活基因1缺失型（NOD.Rag1-/-）和T细胞受体转基因（AI4）（NOD.Rag1-/-.AI4α/β）小鼠品系。由于重组激活基因1（Rag1）发生功能缺失，NOD.Rag1-/-小鼠无法发育生成T细胞和B细胞14。NOD.Rag1-/-.AI4α/β小鼠被用作加速型1型糖尿病的研究模型，因其仅产生一种特异性识别胰岛素表位的T细胞克隆，从而导致胰岛一致性的免疫细胞浸润和快速的疾病进展15。本文所述方案介绍了利用活体人和小鼠胰腺组织切片，结合共聚焦显微镜技术进行功能学与免疫学研究的实验方法。所涉及的技术包括细胞活力评估、胰岛的识别与定位、胞质Ca2+记录，以及免疫细胞群体的染色与鉴定。

<table><tbody><tr><td>#3 型手术刀柄</td><td>Fisherbrand</td><td>12-000-163</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td>HEPES 缓冲液，1M 溶液</td></tr><tr><td>10 cm 未处理培养皿</td><td>Corning</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 鲁尔锁注射器</td><td>BD</td><td>301029</td><td>BD 鲁尔锁头注射器</td></tr><tr><td>27 G 针头</td><td>BD</td><td>BD 305109</td><td>BD 通用型和 PrecisionGlide 皮下注射针头</td></tr><tr><td>35 mm 玻片底培养皿</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td>&amp;micro;-Dish 35 mm，高型</td></tr><tr><td>50 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>8 孔玻片腔室</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>&amp;micro;-Slide 8 孔</td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 CD8a 抗体</td><td>Biolegend</td><td>100712</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific</td><td>199898</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（二水合物）</td></tr><tr><td>紧凑型数字摇床</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88880020</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Leica</td><td>SP8</td><td>针孔&amp;thinsp;= 1.5–2 艾里单位；使用 10x/0.40 数值孔径 HC PL APO CS2 干镜和 20x/0.75 数值孔径 HC PL APO CS2 干镜在 512&amp;thinsp;&amp;times;&amp;thinsp;512 像素分辨率下采集图像</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>ddiH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>双硫腙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130-10G</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td>二甲基亚砜</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Decon Laboratories</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm 组织培养皿</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>Falcon 易握型组织培养皿</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Feather No. 10 外科刀片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>7204410</td><td></td></tr><tr><td>fluo-4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>可穿透细胞膜的 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 指示剂</td></tr><tr><td>Gel Control 超强胶</td><td>Loctite</td><td>45198</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>硬化精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>Hanks 平衡盐溶液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>C&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;S</td></tr><tr><td>冰桶</td><td>Fisherbrand</td><td>03-395-150</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Patterson Veterinary</td><td>NDC 14043-704-05</td><td></td></tr><tr><td>约翰·霍普金斯 Bulldog 夹</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-7440</td><td>&amp;nbsp;直型；压力 500–900 克；长度 1.5&quot;</td></tr><tr><td>Kimwipes 纸巾</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34705</td><td>Kimtech Science&amp;trade; Kimwipes&amp;trade; 精细作业擦拭纸，双层</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 活性/细胞毒性检测试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>该试剂盒包含钙黄绿素-AM 活细胞染料</td></tr><tr><td>低葡萄糖 DMEM</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;（六水合物）</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Sigma</td><td>M2773</td><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（七水合物）</td></tr><tr><td>磁力加热平台</td><td>Warner Instruments</td><td>PM-1</td><td>用于动态刺激记录的成像腔室平台</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>GE</td><td>JES1460DSWW</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 注射器滤器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>726-2520</td><td></td></tr><tr><td>4 号画笔</td><td>Michaels</td><td>10269140</td><td></td></tr><tr><td>开放式钻石浴成像腔室</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td>用于动态刺激记录的成像腔室</td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1-AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>可穿透细胞膜的 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 指示剂</td></tr><tr><td>过夜成像腔室</td><td>Okolab</td><td>H201-LG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20012050</td><td>用于制备切片用琼脂糖</td></tr><tr><td>PE 标记胰岛素四聚体</td><td>Emory Tetramer Research Core</td><td>序列 YAIENYLEL</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71998</td><td>用于振动切片机；双刃不锈钢，未涂层</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque 低熔点琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50101</td><td>用于制备切片用琼脂糖</td></tr><tr><td>切片固定锚</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1421</td><td></td></tr><tr><td>切片固定锚（动态成像）</td><td>Warner Instruments</td><td>640253</td><td>用于动态成像腔室的切片固定锚</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;（一水合物）</td></tr><tr><td>大豆胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma</td><td>T6522-1G</td><td>来源于大豆（Glycine max）的胰蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>载物台适配器</td><td>Warner Instruments</td><td>SA-20MW-AL</td><td>用于将动态刺激记录成像腔室固定在显微镜载物台上</td></tr><tr><td>载物台培养箱</td><td>Okolab</td><td>H201</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>IC90 E MSV266</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue 死细胞染色剂</td><td>Invitrogen</td><td>S34857</td><td>蓝色荧光核酸染色剂</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Falcon</td><td>357575</td><td>Falcon&amp;trade; 塑料一次性移液管</td></tr><tr><td>阀门控制系统</td><td>Warner Instruments</td><td>VCS-8</td><td>用于动态刺激记录的系统</td></tr><tr><td>振动切片机 VT1000 S</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD02</td><td>Fisherbrand Isotemp 通用豪华型水浴锅 GPD 02</td></tr></tbody></table>

观察活体胰腺组织切片中的胰岛功能及胰岛-免疫细胞相互作用

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

活体胰腺组织切片可用于在完整胰岛微环境背景下研究胰岛的生理学特性与功能。该切片通过将活体人源和小鼠胰腺组织包埋于琼脂糖中，再使用振动切片机进行切割制备而成。此方法不仅能够维持组织的活性与功能，还能保留潜在的病理特征，例如1型糖尿病（T1D）和2型糖尿病（T2D）。该切片技术通过保持胰腺内分泌和外分泌组织所依赖的复杂结构及多种细胞间相互作用，为胰腺研究开辟了新的方向。本实验方案展示了如何对胰腺切片内源性活体免疫细胞进行染色和延时显微成像，同时评估胰岛的生理功能。此外，该方法还可结合主要组织相容性复合物多聚体试剂，进一步优化以识别针对胰岛细胞抗原的特异性免疫细胞亚群。

该方案将获得适用于功能研究和免疫细胞记录的活体胰腺组织切片。明场和反射光下的切片外观如图所示。 图1A，B如前所述，由于胰岛含有胰岛素而具有更高的颗粒密度，因此可在切片中通过反射光发现胰岛图1C）在使用反射光时，与背景组织相比可被清晰观察到。应在切片制备完成后评估细胞活性，若胰岛中超过20%的区域失去活性，则不应进行记录。图中显示了一个高活性的胰岛。 图1D，而处理不佳的切片示例如下所示 补充图1活力较低的胰岛会呈现强烈的SYTOX Blue染色，组织表面将布满死细胞的染色细胞核。此外，钙黄绿素-AM和Ca2+ 指示剂（如本实验所用的 Oregon Green 488 BAPTA-1, AM 和 Fluo-4-AM）在死细胞中难以有效加载。应选择胰岛进行 Ca2+ 如果胰岛具有活性且指示剂已充分加载至整个胰岛，则进行记录。Ca2+</sup...

本研究介绍了活体胰腺组织切片在胰岛生理学及胰岛-免疫细胞相互作用研究中的应用。

活体胰腺组织切片可实现对完整胰岛微环境中的胰岛生理学与功能的研究。切片制备……

本实验方案将有助于阐明免疫细胞相互作用对胰岛功能的影响。活体胰腺组织切片法可在保留组织原有病理特征及天然微环境的前提下，研究胰岛的生理特性与功能。该方法可为胰腺疾病（如胰腺炎、1型糖尿病和2型糖尿病）的发病机制提供新的认识。首先，将组织块排列在样品托上，确保其宽度不超过刀片范围，从而使振片机缓慢移动时刀片前进的距离尽可能小。在样品托上涂抹一滴超级胶水，并用胶水瓶的尖端将其铺成一层薄层，然后将组织块翻转贴到胶水上，使靠近组织的一侧朝上。轻轻按压组织块，并静置胶水干燥三分钟。接下来，用螺丝将切片板固定到振动切片机上，并调整刀片的高度和移动距离，使刀片刚好在组织块上方通过并覆盖其整个长度。用镊子轻轻推动组织块，检查胶水是否已完全干燥，然后向振动切片机的托盘中加入冰冷的细胞外溶液，直至完全浸没刀片。将振动切片机设置为切出厚度为120 µm的切片，启动设备，随后观察组织块上切片的分离情况。当切片从包埋块上浮起时，用毛笔或镊子将其轻轻托起，并放入含有3毫摩尔D-葡萄糖和胰蛋白酶抑制剂的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液中。将装有切片的培养板置于摇床上，在室温下以25 RPM的转速孵育1小时。如果需要更长时间保存切片，则将切片转移至15毫升切片培养基中，并将培养板放入培养箱内。将制备好的脑片在37摄氏度下孵育，用于当天实验；或将已置于24摄氏度培养过夜的脑片转移至37摄氏度环境中至少孵育1小时后再进行实验。记录开始前至少1小时打开显微镜，并将载物台顶部培养箱平衡至37摄氏度。将含有脑片的玻璃底培养皿固定在载物台上。通过将10倍物镜设置为明场模式来聚焦显微镜，并在切片中寻找橙棕色的椭圆形结构，以明场模式定位胰岛。按下显微镜触摸屏控制器上的CS按钮，将显微镜切换至共聚焦成像模式。若需利用反射光观察胰岛，请开启638激光探测器和PMT探测器。将激光功率设置在1%至2%之间，并关闭陷波滤光片。使用405纳米激光和PMT检测器观察核酸染料，使用混合检测器检测CD8抗体，并使用488纳米激光和混合检测器观察胰岛素四聚体。使用载物台控制器的 X 和 Y 调节旋钮，将视野中感兴趣的胰岛置于中心位置。找到感兴趣的胰岛后，切换至 20X 物镜并放大，使胰岛占据视野的大部分区域。对胰岛采集 z 轴层扫图像，然后选择细胞状态良好且周围任何免疫细胞均清晰对焦的最佳光学切片。将显微镜设置为XYZT模式，并优化参数，以在数小时内每隔20分钟对选定步骤采集一次z轴层扫图像。使用明场和反射光显微镜观察胰腺组织切片中的胰岛。胰岛中的胰岛素会增加颗粒度，并吸收大量反射光，从而增强胰岛的可见性。通过染色评估了活体人胰腺组织切片的活性。活细胞显示为绿色，死细胞显示为蓝色。另一个反映活性的良好指标是可观测到的基础活动。当活体胰腺切片加载了可穿透细胞的钙离子指示剂后，在小鼠和人胰腺切片中均观察到葡萄糖刺激引起的反应。同时对葡萄糖刺激过程中单个细胞的荧光强度进行了定量分析。使用二甲苯腙染色和反射光显微镜观察了完整和病变的胰岛。由于免疫细胞浸润和细胞死亡，病变的胰岛开始失去颗粒感。可使用CD8抗体和胰岛素四聚体染色来鉴定免疫细胞群体。共染色表明这些细胞是特异性靶向胰岛素抗原的效应T细胞。在此操作过程中，最关键的是必须始终将切片保存在含有蛋白酶抑制剂的溶液中。按照本方案操作后，可开展多种免疫细胞实验功能分析，从而研究免疫细胞相互作用对胰岛功能的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

观察活胰腺组织切片中的胰岛功能和胰岛-免疫细胞相互作用

本文描述了用于大规模获取和分析免疫组织化学染色胰腺标本的新型计算机辅助方法：（1）整张切片的虚拟切片采集；（2）大规模数据的批量分析；（3）二维虚拟切片的重建；（4）胰岛的三维定位绘图；以及（5）数学分析。...

计算机辅助的大规模胰岛质量、大小分布及结构的可视化与定量分析

本文介绍了一种从2型糖尿病小鼠模型Leprdb中分离胰岛的实验方案，以及一种利用双光子显微镜检测完整胰岛活细胞胰岛素分泌的实时细胞检测方法的详细步骤。...

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本胰岛分离方案描述了一种新型的胶原酶注射途径，用于消化外分泌组织，并采用简化的梯度步骤从小鼠中纯化胰岛。该方法包括酶消化、梯度分离/纯化以及人工挑选胰岛。成功分离可每只小鼠获得250–350个高质量且功能完整的胰岛。...

一种简单高效的小鼠胰岛分离方案

离体胰岛研究对糖尿病研究具有重要意义。目前用于研究在天然三维结构中培养的胰岛的技术耗时长、效率低，且很少被使用。本研究介绍了一种简单、高效的新方法，可用于制备高质量的全培养胰岛石蜡切片。...

胰岛组织石蜡切片包埋

本方案概述了一种针对人原代胰岛样本中β细胞的线粒体自噬蛋白复合物形成进行定量分析的方法。该技术因而能够利用有限的生物材料进行线粒体自噬分析，这对于珍贵的人胰腺β细胞样本至关重要。...

利用邻近连接技术原位可视化人胰岛β细胞中的内源性线粒体自噬复合物

本文介绍了一种用于成像和定量分析异质性细胞群体（如胰岛细胞）中钙动力学的实验方案。将荧光报告分子递送至胰岛外周层细胞，随后对胰岛进行固定并成像，进而对单个细胞的荧光强度动力学进行分析。...

小鼠胰岛细胞亚群中钙动力学的成像

本方案的目的是持续监测人胰岛移植过程的动力学变化以及宿主细胞与供体细胞的贡献情况。通过将人胰岛移植到NOD.(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-小鼠受体的眼前房（ACE），随后进行多次双光子成像，即可实现该目标。...

活体纵向成像与定量分析人胰岛移植物及前房眼内微环境宿主细胞的贡献

我们介绍了急性胰腺组织切片的制备方法及其在共聚焦激光扫描显微镜中的应用，用于在长时间内以高时空分辨率同时研究大量活细胞中的钙动力学。...

急性小鼠胰腺组织切片中钙动力学的共聚焦激光扫描显微成像

利用胰腺活体成像窗实现了对胰腺的体内高分辨率成像。...

在小鼠模型中通过胰腺活体成像窗口实现胰腺的稳定纵向体内细胞水平可视化

本方案描述了如何利用已故器官捐献者的胰腺制备人胰腺切片，以在接近生理条件下研究细胞功能。这一创新方法能够实现对正常及结构受损胰岛的检测，并深入探究内分泌与外分泌区域之间的复杂相互作用。...

生成人胰腺组织切片以研究内分泌和外分泌胰腺生理学

学习活胰腺组织切片技术，用于研究胰岛功能及胰岛与免疫细胞的相互作用。该方法保留组织天然微环境，有助于深入理解胰腺炎、I型和II型糖尿病的发病机制。

观察活体胰腺组织切片中的胰岛功能及胰岛-免疫细胞相互作用

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