收获与分散：被忽视的生物膜研究方法中的关键步骤

这些操作步骤的总体目标是以最佳方式收获并分散生物膜，以提高实验的可重复性。本视频将演示三种技术，每种技术侧重于从不同类型的表面收获和分散生物膜。本视频将展示以下正确操作技术：第一，通过涡旋振荡和超声处理，从硬质非多孔表面（如 CDC 生物膜反应器中的聚碳酸酯试片）上剥离生物膜。

第二，从滴流反应器中常见的硬质非多孔硼硅酸盐玻璃表面刮取并均质化生物膜。第三，从导管模型中常见的多孔硅胶管表面刮取生物膜，并进行涡旋振荡和超声处理。大家好，我是凯利·白金汉（Kelly Buckingham-Meyer），来自标准化生物膜方法实验室。

在我们的实验室中，我们将生物膜研究方法分为四个部分：培养、处理、取样和分析。在同行评审的文献中，关于如何从表面取样或收获生物膜并将其分散的细节通常较为缺乏。这正是本视频的目的所在。

由于我们实验室致力于开发和测试标准化的生物膜方法，我们进行了广泛的文献综述，确定了三种最常用的生物膜收获与分散方法。这些方法包括：从聚碳酸酯试片上通过涡旋和超声处理收集生物膜，从硼硅酸盐玻璃试片上刮取并均质化生物膜，以及从硅胶管上刮取、涡旋和超声处理生物膜。尽管书面方法具有重要价值，但我们希望由我的同事Lindsey Miller和我共同展示技术细节的视频能够提供更直观的帮助。

首先，根据美国材料与试验协会标准 E2562（ASTM Standard E2562），即使用 CDC 生物膜反应器在高剪切力和连续流动条件下培养铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa 15442）生物膜的标准化定量检测方法，培养成熟的生物膜。在 48 小时培养期结束后，按照 ASTM 标准 E2871（即采用单管法测定消毒剂对 CDC 生物膜反应器中培养的生物膜杀灭效果的标准测试方法），准备对生物膜样品片进行处理和取样。随后，使用经火焰灭菌的镊子，将已高压灭菌的防溅罩无菌插入无菌的 50 毫升锥形管中。

对所有需要处理的试管重复此步骤。用于对照组试片的试管无需使用防溅罩。在无菌条件下，从CDC生物膜反应器中取出一根转轴，用30毫升无菌稀释水冲洗。

这将去除生物膜中松散附着的细胞。将金属杆平行于实验台面，悬于带有防溅罩的样品管上方。使用经火焰灭菌的六角扳手，松开固定螺钉，使带有生物膜的试片落入管中。

根据所需数量重复此步骤。取下防溅罩，并将防溅罩放入单独的容器中进行灭菌。使用5 mL血清移液管，缓慢吸取4 mL处理液或对照液加入试管中，使液体沿试管内壁流下。

轻轻旋转管底，使试片下方的任何气泡被排出。每次添加之间间隔30至60秒。在规定的接触时间结束后，按照处理或对照施加的相同顺序，用移液器向各管中加入36毫升中和剂。

将每个试管在最高档位涡旋振荡 30 ± 5 秒，并确保形成完整的涡流。将试管放入试管架中，并将其悬置于已脱气的超声仪内，使水浴中的液面高度与试管内的液面高度一致。在 45 千赫兹、100% 功率、正常功能模式下对样品超声处理 30 ± 5 秒。

重复涡旋和超声处理循环，最后以一次涡旋结束，共进行五个循环。最后，对样品进行连续稀释，将稀释液涂布于R2A琼脂平板上，于36摄氏度培养24小时。根据涂布方法适当计数菌落并记录数据。

接下来的生物膜收获与分散技术适用于滴流反应器中常用的坚硬非多孔试片。根据美国材料与试验协会标准 E2647《采用低剪切连续流滴流生物膜反应器培养铜绿假单胞菌生物膜的定量标准试验方法》，培养成熟的铜绿假单胞菌 15442 生物膜。设置取样工作站，包括取样板、盛有95%乙醇的烧杯、酒精灯、止血钳、试片取出工具、盛有无菌稀释水的烧杯以及用于冲洗试片的稀释管。

关闭泵，取下通道盖，使用无菌试片取出工具和止血钳小心取出试片，注意不要破坏生物膜。将试片浸入盛有45毫升无菌稀释水的50毫升离心管中，轻轻晃动冲洗。随即反向操作取出试片。

将 coupon 置于含有 45 毫升无菌稀释水的烧杯中。使用无菌刮铲或刮刀，沿向下方向刮擦覆盖有生物膜的 coupon 表面，持续约 15 秒。通过在烧杯中搅拌刮铲或刮刀对其进行冲洗。

重复刮取和冲洗过程三到四次，确保试片表面完全覆盖。将试片倾斜60度角置于无菌烧杯上方，用移液器吸取1毫升无菌稀释水冲洗试片表面，进行冲洗。重复操作，共完成五次冲洗。

烧杯中的最终体积现为 50 毫升。在生物安全柜中操作，将刮取的生物膜样品进行匀浆。将无菌匀浆探头连接至匀浆器上。

将探头尖端放入液体中，开启匀浆器并逐渐加速至 20,500 RPM。匀浆样品 30 秒。降低转速，然后关闭匀浆器。

在生物膜样本之间，按照上述方法，将探针在9 mL无菌稀释液中以20,500 RPM均质化30秒以进行消毒。将装有9 mL 70%乙醇的试管以20,500 RPM均质化30秒，然后取下探针并将其置于乙醇试管中静置1分钟。再均质化两管无菌稀释液。

此外，每个样品可使用一支无菌一次性匀浆探针。将匀浆后的样品进行连续稀释，采用适当的涂布方法将稀释液接种于R2A培养基上，于36°C培养24小时。计数菌落并记录数据。

这种最终的生物膜收获与分散技术适用于在多孔管路中生长的生物膜，例如导管模型中使用的硅胶管。开始该操作前，需在硅胶导管管路中培养成熟的 E.coli 53498 生物膜。准备取样材料：清洗过的试管、无菌离心管、无菌空培养皿、经火焰灭菌的不锈钢止血钳、剪刀、计时器和尺子。

暂停泵的运行，使用70%乙醇清洁管路外表面。从管路末端量取两厘米，避开与连接器相连的区域，并在管路上做标记以确定切割位置。使用火焰灭菌的剪刀，在两厘米标记处剪断管路。

用无菌稀释水冲洗管段以去除浮游细胞。用火焰灭菌的镊子将管段轻轻浸入20毫升无菌稀释水中，随即取出。将该管段放入10毫升中和剂中。

用火焰灭菌的镊子夹住管段，用无菌的木质涂药棒刮取，直至刮完管段内所有区域。偶尔将涂药棒在 10 毫升中和剂中冲洗，并将管段重新放回样品管中。此刮取后的管段即为 10⁰ 稀释度或零稀释度样品。

将每个试管在最高档位涡旋振荡30±5秒。将试管放入置于超声波水浴中的试管架内，使水浴中的液面高度与试管内液体高度相等。在45千赫兹、100%功率、正常功能模式下超声处理30±5秒。

重复此涡旋和超声处理循环，最后以一次涡旋结束。用缓冲水对样品进行连续稀释。采用适当的涂布方法将样品接种于胰蛋白胨大豆琼脂平板上，然后将平板置于36 ± 2 °C条件下培养24小时。

根据所用的涂布方法计数菌落，并记录数据以计算算术平均值。Danielle Or 和 Blaine Fritz 拍摄的这四张图像均有助于说明此收获和分散处理的重要性。这四个样品片均用结晶紫染色，以帮助可视化样品片上在涡旋和超声处理前后存在的铜绿假单胞菌生物膜的量。

试片A表面完全被生物膜覆盖，而试片B、C和D表面的生物膜则明显较少。试片B、C和D均经过此前所述的涡旋和超声处理过程。这两幅图像由Lindsey Miller在共聚焦显微镜下以12.5倍放大倍数拍摄，显示的是经背光活/死染色处理的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）生物膜。

左侧图像的样品在 45 千赫兹和 10% 功率下进行了超声处理，而右侧图像的样品在 45 千赫兹和 100% 功率下进行了超声处理。显然，与右侧样品相比，左侧样品表面残留的生物膜要多得多。该最终图示展示了不同超声参数的调节对从样品表面去除铜绿假单胞菌生物膜量的影响。

所有这些 coupon 均在 45 千赫、100% 功率、正常模式下超声处理 30 ± 5 秒。这些图像由 Lindsey Miller 在 12.5 倍放大倍数下拍摄。第一行的 coupon 在稀释水中进行超声处理，而第二行的 coupon 在 DE 中和肉汤中进行超声处理。

在含有表面活性剂的DE肉汤中进行超声处理的试片上，残留的生物膜似乎少于在稀释水中处理的试片。试片A、B、E和F均在10毫升体积中进行超声处理，而试片C、D、G和H则在40毫升溶液中进行超声处理。显然，在较小体积中进行超声处理的试片上的生物膜更少。

同时将三根试管放入水浴超声仪中对A、C、E和G号样本片进行超声处理，而将十二根试管同时放入水浴超声仪中对B、D、F和H号样本片进行超声处理。结果显示，使用较少试管同时超声处理的样本在生物膜收获效果上更优。最终表明，减少试管内液体体积、降低同时超声处理的试管数量，以及使用DE中和肉汤，均有助于提高生物膜的收获效率。

目前尚无一种完美的方法可用于收获和分散生物膜，但针对不同表面和/或应用，某些方法更具优势。本视频展示的技术是根据文献综述总结出的三种最常用方法。这三种技术可为研究人员提供一个良好的起点。

有必要花费时间验证所选的收获和解离方法。所有设备都略有不同，因此即使该方法已经标准化，仍需谨慎确认所用设备的处理流程。研究表明，不当的选择可能导致检测结果出现偏差。

观看本视频后，希望这些信息能够帮助研究人员更明智地选择合适的方法，并为三种表面类型及其配套的收获与解离技术提高可重复性提供指导。