研究细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶1-9活性的定量方法

本实验的目的是测定细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶家族各个成员的酶活性。通过定量荧光Western印迹法检测其精氨酸甲基化水平以及生物标志物蛋白的总表达水平，从而评估酶活性。该方法的优势在于，任何具备细胞培养和荧光Western印迹技术条件的实验室均可简便地开展。

本文提供了有关生物标志物、抗体和两种抑制剂化合物的详细指南。此外，我们描述了实验步骤中的关键环节。本实验流程以24孔板格式为例进行展示。

首先，配制裂解缓冲液，使用前新鲜加入苯甲酸酶和蛋白酶抑制剂混合物。吸除孔板中的全部培养基，用 100 微升 PBS 洗涤，然后向每孔加入 60 微升裂解缓冲液。

室温孵育1分钟，轻轻摇动培养板，使裂解缓冲液均匀覆盖细胞。然后加入3 µL 20% SDS，使终浓度为1%，通过轻柔振荡混匀。将裂解液转移至Eppendorf管中，置于冰上保存。

使用BCA蛋白检测试剂盒测定样品的蛋白浓度，或采用其他可耐受溶液中1% SDS的方法。用裂解缓冲液调整各样品的蛋白浓度，使其一致，每60微升细胞裂解液中加入20微升4倍上样缓冲液，然后在95摄氏度加热5分钟。在裂解缓冲液中加入苯并核酸酶可快速水解核酸，从而降低细胞裂解液的黏度。

加入苯甲酸酶的裂解液不粘稠。未加苯甲酸酶的裂解液含有大量粘性DNA团块，离心时无法沉淀。对于组蛋白，上样量为5至20微克总细胞裂解液；对于其他蛋白质，上样量为20至100微克，在4至12%的Bis-Tris梯度蛋白凝胶中进行电泳。

将电泳胶置于含缓冲液的电泳槽中，在100伏电压下电泳约两小时，或直至蓝色上样染料迁移至凝胶底部。若进行湿转，需在冰冻的Tris-甘氨酸转移缓冲液中组装转膜“三明治”结构。使用前将PVDF膜浸入甲醇中活化，并将凝胶在转移缓冲液中平衡30秒后再进行组装。

根据制造商说明书放置海绵、滤纸、PVDF膜和凝胶。在冰上以70伏电压在Tris-甘氨酸转移缓冲液中转移蛋白1至1.5小时。转移后，将膜在封闭缓冲液中孵育30分钟。

用洗涤缓冲液冲洗，并在4摄氏度下与一抗孵育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤膜三次，每次五分钟；室温下与荧光标记的二抗孵育30分钟，再用洗涤缓冲液洗涤三次，每次五分钟。将膜正面朝下放置于荧光Western印迹成像仪的玻璃板上。

用橡胶片覆盖，并去除所有气泡。在 700 和 800 纳米处读取信号。扫描完成后，进入图像界面，调节 700 和 800 通道的信号以清晰显示条带。

此处，以红色显示的700通道信号代表总蛋白水平，以绿色显示的800通道信号代表甲基化蛋白水平。接下来，进入分析菜单，选择顶部和底部的中位数读数。为测量条带强度，请选择绘制矩形工具，并在需要定量的条带周围绘制矩形区域。

转到 700 和 800 通道强度所在的位置。名为“信号”的列提供了扣除背景后的强度值。结果可直接复制到 Excel 文件中。

以下是使用 PRMT I 型抑制剂 MS023 抑制细胞后分析 PRMT1 活性的示例。PRMT1 活性通过检测组蛋白 H4 第3位精氨酸的不对称二甲基化水平来测定。在此，甲基化水平（绿色条带）随药物剂量增加而降低，而总组蛋白水平（红色条带）保持不变。

为确定化合物的IC50值，需绘制抑制剂浓度的对数值与归一化至总组蛋白水平的组蛋白H4精氨酸-3不对称二甲基化水平之间的关系曲线，并进行非线性拟合分析。该方法可实现对细胞内蛋白质甲基转移酶活性可靠且可重复的双重检测。该方法的优势在于采用了学术实验室普遍具备的常规Western印迹技术，且可根据实验室设备条件进行简便的调整与优化。

文章中提供了每种PRMT家族成员所涉及的生物标志物蛋白、抗体以及两种化学化合物的检测详细信息。