Name: 研究蛋白质精氨酸甲基转移酶1-9细胞活性的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学习利用定量荧光蛋白质印迹技术检测细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶家族成员的酶活性。该方法通过测量精氨酸甲基化水平，为研究PRMT功能提供标准化方案。

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结构基因组学联盟是一个注册慈善机构（编号：1097737），其资金来自艾伯维（AbbVie）、拜耳公司（Bayer AG）、勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）、基因泰克（Genentech）、通过安大略基因组研究所 [OGI-196] 获得的加拿大基因组中心资助、欧盟和欧洲制药工业协会联合会通过创新药物计划2联合企业 [EUbOPEN 资助号 875510]、强生旗下杨森（Janssen）、默克公司（Merck KGaA，在加拿大和美国称为 EMD）、辉瑞（Pfizer）、武田制药（Takeda）以及惠康基金会 [106169/ZZ14/Z]。

1. 细胞培养与接种
注意：使用推荐的培养基培养细胞，并定期检测支原体污染。选择 HEK293T、MCF7 和 C2C12 细胞作为示例，因为这些细胞系已在 PRMT 检测中成功应用。
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U mL−1）和链霉素（100 µg mL−1）的DMEM培养基中，于10 cm组织培养处理（TC）培养皿中培养HEK293T、MCF7和C2C12细胞。</li>
	<li>对于PRMT8检测，将可诱导PRMT1敲低的HEK293T细胞在含有强力霉素（2 µg/mL）的培养基中培养3天，然后开始检测。</li>
	<li>接种细胞时，从培养皿中移除并弃去原有培养基。</li>
	<li>加入10 mL不含Ca+2和Mg+2离子的PBS洗涤细胞，随后弃去溶液。</li>
	<li>加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在室温（RT）孵育1分钟，然后弃去溶液。继续孵育直至细胞变圆并从培养皿表面脱落。如有需要，轻敲培养皿以帮助细胞脱落。对于较难消化的细胞（如C2C12），可在37 °C孵育1–2分钟。 
	注意：避免细胞长时间暴露于胰蛋白酶溶液中（&#62;10分钟），以免降低细胞活力。</li>
	<li>向培养皿中加入1 mL预热的培养基，轻轻吹打细胞以分散细胞团块。将细胞转移至15 mL离心管中，并加入3–5 mL培养基。</li>
	<li>为测定细胞数量，取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，取10 µL混合液加入血细胞计数板，或采用其他细胞计数方法进行计数。</li>
	<li>将细胞稀释至推荐的细胞密度，每孔加入500 µL至24孔组织培养板（表1）。对于内源性检测（PRMT1、PRMT4、PRMT5、PRMT7和PRMT9），进入步骤3.1。</li>
</ol>
2. 细胞转染
<ol>
	<li>对于外源性检测（PRMT3、PRMT6、PRMT8），使用推荐量的DNA（表2）转染HEK293T细胞。HEK293T细胞易于转染，因此可使用任何转染试剂，并遵循制造商的说明进行操作。</li>
</ol>
3. 化合物处理
注意：培养基中最终二甲基亚砜（DMSO）浓度不得超过0.1%。每个孔中的DMSO浓度应保持一致。选择性PRMT抑制剂（化学探针）及其密切相关的无活性类似物见表3。
<ol>
	<li>对于内源性检测（PRMT1、PRMT4、PRMT5、PRMT7 和 PRMT9），移除细胞培养基，并替换为含化合物或仅含 DMSO（对照）的 500 µL 培养基。 
	注意：通常需要 2 天时间才能观察到 R 甲基化水平下降超过 80%。</li>
	<li>对于外源性检测（PRMT3、PRMT6、PRMT8），转染后 4 小时移除培养基，加入含化合物或仅含 DMSO（对照）的 500 µL 培养基，并继续培养 20–24 小时。</li>
</ol>
4. 细胞裂解液的制备
<ol>
	<li>吸去各孔中的全部培养基，用 100 µL PBS 洗涤以去除残留的培养基，然后每孔加入 60 µL 裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8，150 mM NaCl，1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），10 mM MgCl2，0.5% Triton X-100，12.5 U mL−1 苯甲酸酶，不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物），进行裂解。
	<ol>
		<li>室温孵育不超过 1 分钟，轻轻摇动培养板使裂解缓冲液均匀覆盖细胞。然后加入 3 µL 20% w/v 十二烷基硫酸钠（SDS），使终浓度为 1%，并通过轻柔振荡混匀。将裂解液转移至微量离心管中，并置于冰上保存。 
		注意：苯甲酸酶和蛋白酶抑制剂混合物需在使用前新鲜加入。苯甲酸酶的加入可快速水解核酸，从而降低细胞裂解液的黏度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 BCA 蛋白定量检测试剂盒或其他可耐受溶液中 1% SDS 的方法测定样品的蛋白浓度。
	<ol>
		<li>取 2 µL 裂解液及蛋白标准品（在裂解缓冲液中配制的 0、1、2、4 和 8 µg/mL BSA）加入 96 孔透明板的各孔中。</li>
		<li>将试剂 A 与试剂 B 按 50:1 的比例混合，每孔加入 200 µL。在 37 °C 孵育 20 分钟后测定吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用裂解缓冲液调整各样品的蛋白浓度，使其保持一致。</li>
	<li>向 60 µL 细胞裂解液中加入 20 µL 4x 上样缓冲液，在 95 °C 加热 5 分钟。热变性处理后，裂解液可保存于 -20 °C。</li>
</ol>
5. 蛋白质印迹分析
<ol>
	<li>将5-20 µg总细胞裂解液用于组蛋白分析，20-100 µg用于其他蛋白质分析，上样至4-12% Bis-Tris蛋白凝胶中。</li>
	<li>在MOPS SDS电泳缓冲液（50 mM MOPS，50 mM Tris碱，0.1% w/v SDS，1 mM EDTA，pH 7.7）中以100 V电压电泳约2小时，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。</li>
	<li>若进行湿转法，需在冰冻的Tris-甘氨酸转膜缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，20% v/v 甲醇，0.05% w/v SDS）中组装转膜“三明治”结构。
	<ol>
		<li>按照制造商说明放置海绵、滤纸、PVDF膜和凝胶。使用前将PVDF膜浸入甲醇中活化，并将凝胶在转膜缓冲液中平衡30秒。 
		注意：建议使用推荐的PVDF Western印迹膜，因其具有低自发荧光特性，并适用于组蛋白等低分子量蛋白质（材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在冰上以70 V电压，在Tris-甘氨酸转膜缓冲液中将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜，持续1.5小时。</li>
	<li>用封闭缓冲液（含5% w/v脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液PBS）封闭膜30分钟。用洗涤缓冲液（PBST：含0.1% v/v Tween-20的PBS）冲洗后，在牛血清白蛋白（BSA）溶液&#160;（含5% BSA的PBST）中加入一抗，4 °C孵育过夜（表3）。 
	注意：如需长期保存，应对BSA溶液进行过滤除菌，添加0.02% w/v叠氮化钠，并于4 °C保存。</li>
	<li>用PBST洗涤膜3次，每次5分钟。随后在推荐的封闭缓冲液中加入山羊抗兔（IR800）和驴抗小鼠（IR680）二抗，在室温下孵育30分钟，再用PBST洗涤3次，每次5分钟（材料表，表3）。</li>
	<li>使用荧光Western印迹成像仪在800 nm和700 nm波长下读取信号。建议选用能够以高灵敏度和宽动态范围清晰成像强弱信号条带、具备高信噪比、在图像饱和时发出警告，并支持在同一蛋白条带中进行两种荧光颜色多重检测的仪器。</li>
	<li>使用适用于荧光Western印迹成像的软件分析条带强度。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益或其他冲突性利益。

本文描述了使用荧光 Western 印迹方法检测 PRMT 家族成员的详细细胞检测方案。选择了独特的底物，这些底物在单个 PRMT 缺失或催化活性被抑制后，其精氨酸甲基化水平的变化可被清晰检测，且不会被家族其他成员所代偿。某些蛋白质可被多种 PRMT 甲基化21,23，表明底物特异性存在重叠，其中某些 PRMT 仅对特定蛋白底物的细胞甲基化修饰贡献少量修饰量24,25,26,27，例如 PRMT8 和 PRMT1 均参与 EWS 蛋白的甲基化。因此，每项检测均需通过基因敲低和/或过表达实验对底物和抗体进行充分验证，并进一步使用特征明确的选择性抑制剂进行验证。我们鉴定了 PRMT 特异性的底物，其甲基化修饰水平在 PRMT 缺失或抑制后的 2–3 天内即可检测到变化，以避免因细胞活力和增殖能力下降带来的间接影响，从而干扰甲基化精氨酸修饰水平的判断。尽管已成功为 PRMT1、PRMT4、PRMT5、PRMT7 和 PRMT9 找到特异性底物，但对于 PRMT3、PRMT6 和 PRMT8，则必须采用功能获得性策略。我们测试了多种针对不同细胞靶标的精氨酸甲基化特异性抗体，但在 PRMT3 和 PRMT6 敲低后 3 天内均未能检测到显著变化；因此，我们开发了生物标志物检测方法，通过共表达外源酶及其催化失活突变体，后者用于控制底物基础甲基化水平。PRMT8 是 PRMT1 的近源同源物，且具有相似的底物偏好性。由于未能鉴定出 PRMT8 特异性的生物标志物，我们建立了在 PRMT1 敲低细胞中的检测体系，其中同时共表达 PRMT8 和 EWS。PRMT1 也是介导组蛋白 H4 第3位精氨酸（H4R3）不对称二甲基化的主要酶。因此，在将 H4R3me2a 用作 PRMT3 和 PRMT6 细胞检测的生物标志物时，我们选择基础 H4R3me2a 水平较低的细胞，并使用催化失活突变体作为背景对照。尽管内源性检测更受青睐，但外源性检测在评估多种选择性 PRMT 抑制剂的细胞活性方面具有重要价值7,8,9。随着对 PRMT 生物学认知的不断深入，我们预期将通过发现更多针对 PRMT3、PRMT6 和 PRMT8 的特异性生物标志物蛋白，进一步优化这些检测方法。
使用经过验证的抗体和适当的对照对于PRMT实验的性能至关重要。此处推荐的所有抗体均已通过基因敲低和过表达实验进行了充分验证，但批次间的差异（尤其是多克隆抗体）仍可能影响其性能。因此，必须结合遗传学方法和化学探针及其相应的阴性对照，以确认实验的可靠性。此外，对于需要蛋白过表达的PRMT实验，必须同时使用催化失活突变体和野生型蛋白，以确定基础甲基化水平。
这一系列用于分析细胞中PRMT活性的定量检测方法，由于仅需基本的细胞培养和荧光Western印迹技术，且可在最少设备和有限技术条件下快速、简便地实施，因此可广泛适用于科学界。推荐的PRMT抗体和化学探针还可用于基于活性的蛋白质谱分析（ABPP）实验，以评估特定ABPP探针的适用性、监测靶标结合情况，并通过竞争性ABPP模式评估脱靶效应。本文讨论的检测方法开发策略也可推广至其他酶家族，如蛋白质赖氨酸甲基转移酶和乙酰转移酶。

精氨酸甲基化是一种重要的翻译后修饰，可调控蛋白质-蛋白质和蛋白质-RNA相互作用，因此在多种细胞过程中发挥关键作用，如前体mRNA剪接、DNA损伤、转录应答以及生长因子介导的信号转导1,2。精氨酸由蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）催化发生甲基化，生成单甲基精氨酸（Rme1）、不对称二甲基精氨酸（Rme2a）或对称二甲基精氨酸（Rme2s）3。根据甲基化类型的不同，PRMTs可分为三类：I型（PRMT1、2、3、4、6和8），催化单甲基化和不对称二甲基化；II型（PRMT5和PRMT9），催化单甲基化和对称二甲基化；III型（PRMT7），仅能催化精氨酸的单甲基化3。
由于市面上可获得的精氨酸甲基化特异性抗体数量不断增加，因此可以通过蛋白质印迹法（Western blotting）检测PRMT活性。与化学发光检测相比，基于荧光的蛋白质印迹技术具有更宽的动态范围和更好的线性、更高的灵敏度，并支持多重检测，因此更受青睐4。为了定量蛋白质甲基化水平，需要将甲基化信号归一化至总蛋白水平。通过选择针对总蛋白和甲基化蛋白、且由不同宿主物种产生的抗体（例如小鼠源和兔源抗体），可使用不同荧光标记的二抗，从而在同一蛋白条带中同时检测两种抗体的信号。开发甲基化精氨酸抗体的目的是识别和表征单甲基化、不对称二甲基化或对称二甲基化的蛋白质，其中甲基化精氨酸出现在特定序列背景下。由于大多数PRMTs在其底物中甲基化富含甘氨酸和精氨酸的基序5，因此已研制出多种针对含有单甲基精氨酸或不对称、对称二甲基精氨酸-甘氨酸重复序列的多肽的抗体，例如D5A12、ASYM24或ASYM25以及SYM11。此外，还有一些甲基化精氨酸抗体是基于包含在重复序列背景下的不对称二甲基、对称二甲基及单甲基精氨酸的多肽文库而制备的，有助于在特定序列环境中检测甲基化精氨酸6。目前还出现了越来越多能够识别单一蛋白质上特定精氨酸修饰位点的抗体，从而实现对特定甲基化事件的选择性检测，例如组蛋白H4R3me2a或BAF155-R1064me2a。
目前有多种市售的PRMT抑制剂，可作为PRMT细胞实验的工具。然而，并非所有抑制剂的选择性和脱靶效应都经过充分表征，部分抑制剂应谨慎使用。结构基因组联盟（Structural Genomic Consortium）与学术实验室及制药合作伙伴共同开发了一系列特性明确、高效、具有选择性且可穿透细胞膜的PRMT抑制剂（化学探针），可供科学界无限制地使用。有关这些抑制剂的信息可参见 https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics 和 https://www.chemicalprobes.org/。&#160;化学探针是一类小分子抑制剂，其&#160;体外 IC50 或 Kd &#60; 100 nM，对同一家族蛋白具有30倍以上的选择性，并在1 µM浓度下表现出显著的细胞活性。此外，每种化学探针均配有一个结构相近但对目标蛋白无活性的化学类似物7,8,9,10,11,12。
本实验方案的目的是利用荧光 Western blot 方法测定各个 PRMT 家族成员的细胞活性。本文提供了经过验证的检测生物标志物、抗体、强效细胞活性抑制剂的详细信息，以及成功实施该检测的宝贵策略。

<table><tbody><tr><td>10 cm 细胞培养皿</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>24 孔细胞培养板</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;ndash;12% Bis-Tris 蛋白质凝胶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0323BOX, NP0322BOX, NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hybond P PVDF 膜</td><td>Millipore-Sigma</td><td>10600021</td><td></td></tr><tr><td>抗 Asym 24 抗体</td><td>Millipore-Sigma</td><td>07-414</td><td></td></tr><tr><td>抗 Asym 25 抗体</td><td>Millipore-Sigma</td><td>09-814</td><td></td></tr><tr><td>抗 B-actin 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>抗 BAF155 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-32763</td><td></td></tr><tr><td>抗 BAF155-R1064me2a 抗体</td><td>Millipore-Sigma</td><td>ABE1339</td><td></td></tr><tr><td>抗 FLAG 抗体（#，1:5000）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>抗 GFP 抗体</td><td>Clontech</td><td>632381</td><td></td></tr><tr><td>抗 H3 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab10799</td><td></td></tr><tr><td>抗 H3R2me2a 抗体</td><td>Millipore-Sigma</td><td>04-848</td><td></td></tr><tr><td>抗 H3R8me2a 抗体</td><td>Rockland</td><td>600-401-I67</td><td></td></tr><tr><td>抗 H4 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab174628</td><td></td></tr><tr><td>抗 H4R3me2a 抗体</td><td>Active Motif</td><td>39705</td><td></td></tr><tr><td>抗 Hsp/Hsc70 抗体</td><td>Enzo</td><td>ADI-SPA-820</td><td></td></tr><tr><td>抗 PRMT1 抗体</td><td>Millipore-Sigma</td><td>07-404</td><td></td></tr><tr><td>抗 PRMT3 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab191562</td><td></td></tr><tr><td>抗 PRMT4 抗体</td><td>Bethyl</td><td>#A300-421A</td><td></td></tr><tr><td>抗 PRMT5 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab109451</td><td></td></tr><tr><td>抗 PRMT6 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab47244</td><td></td></tr><tr><td>抗 PRMT7 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab179822</td><td></td></tr><tr><td>抗 Rme1 抗体</td><td>CST</td><td>8015</td><td></td></tr><tr><td>抗 Rme2a 抗体</td><td>CST</td><td>13522</td><td></td></tr><tr><td>抗 Rme2s 抗体</td><td>CST</td><td>13222</td><td></td></tr><tr><td>抗 Rme2s (ASYM25), Millipore, 1:2000</td><td></td><td>09-814</td><td></td></tr><tr><td>抗 SAP145 抗体 (Abcam, #, 1:1000)</td><td>Abcam</td><td>ab56800</td><td></td></tr><tr><td>抗 SAP145-R508me2s 抗体</td><td></td><td></td><td>由希望之城贝克曼研究所 Yanzhong Yang 博士惠赠</td></tr><tr><td>抗 SmBB&amp;rsquo; 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-130670</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸酶（benzonase）</td><td></td><td></td><td>实验室自制</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>C2C12 细胞系</td><td></td><td></td><td>由麦吉尔大学 Stephane Richard 博士惠赠</td></tr><tr><td>cOmplete 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Millipore-Sigma</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Bioshop</td><td>DMS666.100</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠 IgG-IR680 抗体</td><td>Licor</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>多西环素（doxycycline）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Wisent</td><td>80150</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸（glycine）</td><td>Bioshop</td><td>GLN002.5</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG-IR800 抗体</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 细胞系</td><td></td><td></td><td>由约克大学 Sam Benchimol 博士惠赠</td></tr><tr><td>Image Studio 软件 版本 5.2</td><td>Licor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液：NuPAGE LDS 样品缓冲液（4x）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>MCF7 细胞系</td><td></td><td>ATCC&amp;reg; HTB-22&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey 封闭缓冲液（用 PBST 稀释 4 倍）</td><td>Licor</td><td>927-40000</td><td>也可使用 Intercept (PBS) 封闭缓冲液 # 927-70001</td></tr><tr><td>Odyssey CLX 成像系统</td><td>Licor</td><td>型号 9140</td><td></td></tr><tr><td>PBS（组织培养用）</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>PBS（Western blot 用）</td><td>Bioshop</td><td>PBS405.4</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（penstrep）</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; BCA 蛋白定量试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Bioshop</td><td>SDS001.1</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td></td></tr><tr><td>TC20 自动细胞计数仪</td><td>Biorad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Wisent</td><td>325-043-EL</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Bioshop</td><td>TRS003.5</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100（Triton X-100）</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝（trypan blue）</td><td>GIBCO</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20（Tween-20）</td><td>Bioshop</td><td>TWN510.500</td><td></td></tr></tbody></table>

研究细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶1-9活性的定量方法

Quantitative Methods to Study Protein Arginine Methyltransferase 1-9 Activity in Cells

蛋白质甲基转移酶（PRMTs）催化甲基基团转移到底物蛋白的精氨酸残基上。PRMT家族包含九个成员，能够对精氨酸残基进行单甲基化或对称性/非对称性二甲基化。目前已有多种可识别不同蛋白精氨酸甲基化类型的抗体，为开发PRMT活性生物标志物检测方法提供了工具。由于底物存在重叠以及抗体识别具有序列基序特异性，基于PRMT抗体的检测方法面临挑战。本文讨论了这些技术难题以及用于研究各单个PRMT所介导精氨酸甲基化的实验设计。通过精心选择可作为九种PRMT中八种代表性生物标志物的底物，设计出一套PRMT活性检测 panel。本文报道了在细胞中定量测定PRMT家族各成员酶活性的细胞检测方案。所述方法的优势在于，任何具备细胞培养和荧光Western印迹能力的实验室均可简便地开展这些实验。通过基因敲低和过表达策略，已充分验证了所选底物的特异性和抗体的可靠性。除详细说明检测所用生物标志物和抗体外，本文还提供了PRMT抑制剂工具化合物库的使用信息。

这些方案提供了在细胞中评估蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）家族各个成员酶活性的方法学。文中详细描述了利用内源性和外源性生物标志物、识别甲基化精氨酸的抗体以及抑制剂工具化合物来评估PRMT活性的具体操作指南。

蛋白甲基转移酶（PRMTs）催化甲基基团转移至底物蛋白的精氨酸残基上。PRMT家族包含九个成员……

本实验的目的是测定细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶家族各个成员的酶活性。通过定量荧光Western印迹法检测其精氨酸甲基化水平以及生物标志物蛋白的总表达水平，从而评估酶活性。该方法的优势在于，任何具备细胞培养和荧光Western印迹技术条件的实验室均可简便地开展。本文提供了有关生物标志物、抗体和两种抑制剂化合物的详细指南。此外，我们描述了实验步骤中的关键环节。本实验流程以24孔板格式为例进行展示。首先，配制裂解缓冲液，使用前新鲜加入苯甲酸酶和蛋白酶抑制剂混合物。吸除孔板中的全部培养基，用 100 微升 PBS 洗涤，然后向每孔加入 60 微升裂解缓冲液。室温孵育1分钟，轻轻摇动培养板，使裂解缓冲液均匀覆盖细胞。然后加入3 µL 20% SDS，使终浓度为1%，通过轻柔振荡混匀。将裂解液转移至Eppendorf管中，置于冰上保存。使用BCA蛋白检测试剂盒测定样品的蛋白浓度，或采用其他可耐受溶液中1% SDS的方法。用裂解缓冲液调整各样品的蛋白浓度，使其一致，每60微升细胞裂解液中加入20微升4倍上样缓冲液，然后在95摄氏度加热5分钟。在裂解缓冲液中加入苯并核酸酶可快速水解核酸，从而降低细胞裂解液的黏度。加入苯甲酸酶的裂解液不粘稠。未加苯甲酸酶的裂解液含有大量粘性DNA团块，离心时无法沉淀。对于组蛋白，上样量为5至20微克总细胞裂解液；对于其他蛋白质，上样量为20至100微克，在4至12%的Bis-Tris梯度蛋白凝胶中进行电泳。将电泳胶置于含缓冲液的电泳槽中，在100伏电压下电泳约两小时，或直至蓝色上样染料迁移至凝胶底部。若进行湿转，需在冰冻的Tris-甘氨酸转移缓冲液中组装转膜“三明治”结构。使用前将PVDF膜浸入甲醇中活化，并将凝胶在转移缓冲液中平衡30秒后再进行组装。根据制造商说明书放置海绵、滤纸、PVDF膜和凝胶。在冰上以70伏电压在Tris-甘氨酸转移缓冲液中转移蛋白1至1.5小时。转移后，将膜在封闭缓冲液中孵育30分钟。用洗涤缓冲液冲洗，并在4摄氏度下与一抗孵育过夜。次日，用洗涤缓冲液洗涤膜三次，每次五分钟；室温下与荧光标记的二抗孵育30分钟，再用洗涤缓冲液洗涤三次，每次五分钟。将膜正面朝下放置于荧光Western印迹成像仪的玻璃板上。用橡胶片覆盖，并去除所有气泡。在 700 和 800 纳米处读取信号。扫描完成后，进入图像界面，调节 700 和 800 通道的信号以清晰显示条带。此处，以红色显示的700通道信号代表总蛋白水平，以绿色显示的800通道信号代表甲基化蛋白水平。接下来，进入分析菜单，选择顶部和底部的中位数读数。为测量条带强度，请选择绘制矩形工具，并在需要定量的条带周围绘制矩形区域。转到 700 和 800 通道强度所在的位置。名为“信号”的列提供了扣除背景后的强度值。结果可直接复制到 Excel 文件中。以下是使用 PRMT I 型抑制剂 MS023 抑制细胞后分析 PRMT1 活性的示例。PRMT1 活性通过检测组蛋白 H4 第3位精氨酸的不对称二甲基化水平来测定。在此，甲基化水平（绿色条带）随药物剂量增加而降低，而总组蛋白水平（红色条带）保持不变。为确定化合物的IC50值，需绘制抑制剂浓度的对数值与归一化至总组蛋白水平的组蛋白H4精氨酸-3不对称二甲基化水平之间的关系曲线，并进行非线性拟合分析。该方法可实现对细胞内蛋白质甲基转移酶活性可靠且可重复的双重检测。该方法的优势在于采用了学术实验室普遍具备的常规Western印迹技术，且可根据实验室设备条件进行简便的调整与优化。文章中提供了每种PRMT家族成员所涉及的生物标志物蛋白、抗体以及两种化学化合物的检测详细信息。

quantitative-methods-to-study-protein-arginine-methyltransferase-1-9

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

研究蛋白质精氨酸甲基转移酶1-9细胞活性的方法

蛋白质精氨酸甲基化，由一类酶催化 即， 蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）是指在蛋白质中精氨酸残基上通过酶促反应添加一个或多个甲基基团的过程。 体外...

体外 甲基化实验用于研究蛋白质精氨酸甲基化

本方案详细描述了一种用于检测功能同源去泛素化酶活性的方法。特异性探针可共价修饰该酶，从而实现检测。该方法有望用于发现新的治疗靶点。...

细胞系和组织样本中去泛素化酶活性的检测方法

本报告描述了一种 体外 使用酶法测定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活性 利什曼原虫 细胞提取物。该实验基于放射性甲基从 S-[甲基-3H]腺苷-L-甲硫氨酸转移至内源性磷脂酰乙醇胺。...

体外测定磷脂酰乙醇胺甲基转移酶活性的实验方法

本文通过内源性修饰与使用稳定同位素标记酸酐进行定量化学酰化后引入的修饰之间的比率分析，实现了对整个蛋白质组中位点特异性蛋白质乙酰化和/或琥珀酰化占有率（化学计量比）的无偏定量。结合高灵敏度的数据非依赖性采集质谱技术，可获得准确的位点占有率测量结果。...

使用数据非依赖性采集质谱法定量位点特异性蛋白质赖氨酸乙酰化与琥珀酰化化学计量比

在本研究中，我们通过监测蛋白质稳定性的变化并估算蛋白质-配体相互作用的亲和力，增强了DARTS实验的数据分析能力。这些相互作用可绘制成两条曲线：一条为蛋白水解曲线，另一条为剂量依赖曲线。我们以mTOR与雷帕霉素的相互作用作为示例案例。...

一种用于研究雷帕霉素/mTOR 相互作用的半定量药物亲和反应靶标稳定性（DARTS）实验

本文描述了一种无需抗体的体外检测方法，用于直接分析甲基转移酶在合成RNA或体外转录RNA上的活性。...

无需抗体的RNA甲基转移酶活性分析检测法

蛋白质精氨酸（R）甲基化是一种广泛存在的翻译后修饰，可调控多种生物通路。当与修饰肽富集的生物化学方法相结合时，质谱技术是全局分析R-甲基化蛋白质组的最佳手段。本文描述了在人类细胞中高置信度鉴定全局R-甲基化的实验流程。...

一种基于质谱的蛋白质组学方法用于全局且高置信度的蛋白质精氨酸甲基化分析

DNA甲基转移酶是潜在的抗癌药物靶点。本文介绍了一种评估小分子抑制DNA甲基转移酶活性的实验方案。该检测方法利用一种限制性内切酶将DNA甲基化与荧光信号生成偶联，从而实现对酶活性的实时监测。...

基于连续荧光的核酸内切酶偶联DNA甲基化检测法筛选DNA甲基转移酶抑制剂

本实验方案描述了通过1H-NMR波谱法对游离及蛋白结合的精氨酸和甲基化精氨酸进行制备与定量检测的方法。...

利用核磁共振波谱技术探索精氨酸甲基化修饰组

快速且准确的化学检测方法用于筛选特异性抑制剂，是药物开发工具库中的重要手段。本文介绍一种可放大的乙酰化-点击化学检测方法，用于测定HAT1乙酰化活性的抑制情况。...

一种乙酰化-点击化学检测法用于测量组蛋白乙酰转移酶1的乙酰化水平

学习利用定量荧光蛋白质印迹技术检测细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶家族成员的酶活性。该方法通过测量精氨酸甲基化水平，为研究PRMT功能提供标准化方案。

研究细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶1-9活性的定量方法

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