Name: 温缺血/再灌注损伤的大鼠肺移植模型:改善结局的优化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 了解大鼠肺移植的标准化套囊技术，通过基于体重的套囊选择优化手术流程，提高移植模型的可重复性和安全性，为缺血再灌注损伤的分子机制研究提供可靠基础。

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雄性Sprague-Dawley大鼠（体重180-270 g）购自商业供应商（例如Envigo），并饲养于俄亥俄州立大学动物实验中心的无病原体环境中。所有实验操作均依照美国国立卫生研究院（NIH）和国家研究委员会《实验动物人道照护与使用指南》的规定进行，并经俄亥俄州立大学机构动物照护与使用委员会（IACUC方案编号：2012A00000135-R2）批准。
1. 初始设置
<ol>
	<li>设置手术器械。 
	注意：此&#160;为非存活手术。若需进行存活手术，则必须使用无菌器械并采取屏障防护措施。&#160;
	<ol>
		<li>打开心率/血氧饱和度监测设备，并将加热板预热至 42 °C。</li>
		<li>打开通风和麻醉机，预热异氟烷蒸发器。 
		注意：使用7.2 mL/kg的潮气量（Td），呼气末正压（PEEP）为2 cmH₂O280 次/分钟的呼吸频率。</li>
		<li>用10 mL液态异氟烷填充麻醉注射器，并将注射器安装到通气与麻醉机上。</li>
		<li>打开手术显微镜，并根据显微外科医生的偏好调整高度和焦距。</li>
		<li>打开电灼装置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备并摆放手术器械（图1). 
	注意：所有手术器械均在121 °C下高压灭菌30分钟。</li>
	<li>收集并记录供体和受体大鼠的体重。</li>
	<li>使用 表1 并根据大鼠的体重确定使用何种规格的血管套管（20、18、16、14 或 12 G）来制作套管袖套。</li>
	<li>根据体重使用尺寸指南制备肺动脉（PA）、支气管（Br）和肺静脉（PV）的套环表1 和 图2).
	<ol>
		<li>放置20 G、18 G、16 G、14 G或12 G规格的血管导管（angio-catheter）图2A-在手术显微镜下的无菌表面上。</li>
		<li>然后使用#11号反向手术刀片（图2F）以90°角切割套管针，制成一段长度为2 mm的袖套主体，并在袖套主体顶端形成一个1 mm × 1 mm（宽×高）的标签状凸起。图2G).</li>
		<li>将套管保存在无菌生理盐水中，直至使用前。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制溶液。
	<ol>
		<li>在无菌注射瓶中，加入1 mL 赛拉嗪（100 mg/mL）和10 mL 氯胺酮（100 mg/mL），配制成氯胺酮与赛拉嗪混合溶液。 
		注意：该混合液的有效期至 确定&#160;使用所用组分中最早的过期日期.</li>
		<li>用注射器吸取适合大鼠剂量的药物（每100 g大鼠体重注射0.1 mL的氯胺酮/赛拉嗪混合液；例如，对于200 g的大鼠，应给予0.2 mL的氯胺酮/赛拉嗪混合液）。 
		注意：此剂量可使大鼠接受91 mg/kg的氯胺酮和9.1 mg/kg的赛拉嗪，能够维持大鼠镇静状态60–80分钟。</li>
		<li>准备肝素，给药剂量为1,000 U/kg。</li>
		<li>将生理盐水、PBS 和保存液置于冰上（材料表).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 供体大鼠的准备
<ol>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪混合物，诱导供体大鼠麻醉，并等待约10分钟，直至达到手术麻醉深度，可通过夹捏脚趾无反应来评估。</li>
	<li>使用电子剪刀剃除切口区域的毛发。</li>
	<li>将供体大鼠仰卧位放置于手术加热板上，用浸有聚维酮碘的无菌纱布擦拭切口区域，随后用70%异丙醇棉签擦拭该区域。&#160;重复3次。</li>
	<li>使用剪刀在颈部中线处做3至4厘米长的皮肤切口，用镊子仔细分离皮下组织和肌肉（避免使用剪刀以减少出血）。</li>
	<li>进行气管插管时，用4-0丝线围绕气管穿线，并将16 G套管针插入气管内；用双结牢固结扎丝线，再以单结加固，以固定套管针位置。</li>
	<li>将套管针连接至呼吸机，并通过1–2%异氟烷维持大鼠的手术麻醉深度。</li>
	<li>使用剪刀采用中线与横向切口结合的方式进行胸腹联合切开术（laparo-sternotomy）。</li>
	<li>通过下腔静脉（IVC）使用胰岛素注射器注射肝素（1,000 U/kg），并等待10分钟使其全身循环。 
	注意：此步骤中肝素的使用可防止供体肺内形成血栓。</li>
	<li>沿胸弓剪开膈肌，小心分离，随后沿胸骨向颈部方向打开胸腔。</li>
</ol>
3. 供体肺的热缺血与获取
<ol>
	<li>通过切断下腔静脉处死供体大鼠。</li>
	<li>在肺仍处于通气状态时，使用显微解剖弹簧剪刀剪开左右心耳，并利用重力将悬挂于28 cmH2O高度的注射器中的20 mL保存液经连接管路和直接插入肺动脉的18 G套管针进行肺灌注冲洗。</li>
	<li>断开呼吸机与气管插管的连接，将其连接至一个装有根据体重计算所需空气体积的5 mL注射器。 
	注：肺膨胀所需空气体积可根据潮气量的两倍计算（Td = 7.2 mL/kg），例如，一只200 g的大鼠其潮气量为1.44 mL，乘以2后即得肺膨胀所需空气量为2.88 mL。</li>
	<li>膨胀供体肺脏。</li>
	<li>在气管上夹上Yasargil夹以维持肺膨胀状态，并用无菌棉纱布覆盖肺和心脏。用生理盐水润湿纱布，将供体大鼠包裹在垫巾中，置于加热手术板上1小时，以诱导肺脏产生热缺血（图3）。</li>
	<li>热缺血1小时后，使用显微解剖弹簧剪刀和镊子切除心肺组织块，并将其放置于冰上无菌培养皿中预先用预冷PBS润湿的无菌纱布上。 
	注：后续所有操作均应在肺组织置于冰上培养皿期间完成。</li>
	<li>使用显微解剖弹簧剪刀小心切开肺韧带，以分离左肺与食管及下腔静脉后叶。</li>
	<li>使用Vannas-Tubingen弹簧剪刀仔细修整左肺门区域，并获取左肺静脉（PV）、肺动脉（PA）和支气管（Br）。</li>
	<li>在肺静脉（PV）、肺动脉（PA）或支气管（Br）上安装套管（图4A-C）。
	<ol>
		<li>使用蚊式止血钳夹住套管标签。</li>
		<li>使用精细镊子通过相应套管本体夹住肺静脉、肺动脉或支气管的远端，将周围多余组织翻转包绕于套管上，并用8-0尼龙缝线固定。使用Vannas-Tubingen弹簧剪刀修剪多余的组织以及套管本体周围的套管部分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将供体肺保存于冰上培养皿中，并用生理盐水润湿的纱布覆盖，直至准备移植至受体大鼠体内（图4D）。 
	&#8203;注：平均冷缺血时间为84分钟 ± 11分钟标准差。</li>
</ol>
4. 受体大鼠的准备
<ol>
	<li>以与供体大鼠相同的方式，通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪混合物（每100 g大鼠注射0.1 mL）使受体大鼠麻醉，并等待10分钟，直至达到手术麻醉深度，可通过夹捏足趾无反应来判断。</li>
	<li>使用电动剃须刀剃除切口区域的毛发。</li>
	<li>将供体大鼠置于仰卧位，用浸有聚维酮碘的无菌纱布擦拭切口区域，随后用70%异丙醇棉签擦拭该区域。&#160;重复3次。</li>
	<li>在将大鼠固定到呼吸机之前，先在大鼠胸部画线，以备定位第4th 肋间隙
	<ol>
		<li>从胸骨上切迹至剑突测量胸部长径，并画一条线（图 5A).</li>
		<li>在该线的中点，沿胸部左侧画一条线，其长度为胸骨上窝至剑突距离的一半（图 5A 和 B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用喉镜插管包中连接LED光源的光纤导管，通过可视化方法，利用16 G血管导管对受体进行插管。</li>
	<li>将血管导管连接至呼吸机，并使用1-2%异氟烷维持外科麻醉深度。</li>
	<li>要找到 4th 肋间隙，寻找胸壁上可触及明显心尖搏动的区域（图5C，红色圆圈）。</li>
	<li>在此位置，使用剪刀切开皮肤，用显微解剖弹簧剪剪开肌肉，并使用牵开器撑开切口th 尽可能广泛地分离肋间隙（图 5D 和 E). 
	注意：在肌肉解剖过程中使用电灼术以避免或止血。</li>
	<li>当肋间间隙充分打开后，使用Vannas-Tubingen弹簧剪仔细分离受体左肺周围的韧带，并用无菌棉签和镊子将肺组织从胸腔区域轻轻拉出。</li>
	<li>用无菌纱布包裹左侧肺，并用迪芬巴赫止血钳夹住。</li>
	<li>在左侧肺门区域尽可能靠近近端的位置放置一个 Yasargil 钳。</li>
</ol>
5. 吻合
<ol>
	<li>肺静脉（PV）吻合
	<ol>
		<li>在受体的 PV 周围放置 7-0 尼龙缝线。</li>
		<li>使用 Vannas-Tubingen 弹簧剪刀横向切断受体 PV 远端尽可能远的上下段静脉，并用胰岛素注射器注入 0.2 mL 肝素化生理盐水（1 U/mL）冲洗血液。</li>
		<li>将供体肺仍包裹在冰冷的湿无菌纱布中放入胸腔。</li>
		<li>将供体带套袖的 PV 插入受体的 PV 中，然后用预先放置的 7-0 尼龙缝线固定（图 6）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>支气管（Br）吻合
	<ol>
		<li>在受体的 Br 周围放置 7-0 尼龙缝线。</li>
		<li>使用 Vannas-Tubingen 弹簧剪刀横向切断受体 Br 远端尽可能远的上下段气道。</li>
		<li>将供体带套袖的 Br 插入受体的 Br 中，并用预先放置的 7-0 尼龙缝线固定（图 6）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肺动脉（PA）吻合：
	<ol>
		<li>在受体的 PA 周围放置 7-0 尼龙缝线。</li>
		<li>从 PA 的外膜鞘分离，用 Vannas-Tubingen 弹簧剪刀切开血管周长的一半，然后用胰岛素注射器注入 0.2 mL 肝素化生理盐水（1 U/mL）冲洗 PA 内的血液。</li>
		<li>将供体带套袖的 PA 插入受体的 PA 中，并用预先放置的 7-0 尼龙缝线固定（图 6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 再灌注
<ol>
	<li>移除肺门处的Yasargil夹，以允许移植供体肺再灌注和通气图7).</li>
	<li>使用显微解剖弹簧剪和镊子分离受体的原位左肺。</li>
	<li>将移植的左肺小心地重新置入受体的胸腔内。</li>
	<li>使用6-0尼龙缝线缝合胸廓切口。
	<ol>
		<li>在第四肋上方的肋骨处放置三根6-0尼龙缝线，采用简单的双结固定th 肋骨及第5肋骨下方th 肋（图8A).</li>
		<li>使用止血钳将三条缝线聚拢在一起（图8B).</li>
		<li>将呼气末正压（PEEP）增加至6 cmH₂O2O 在通气设置中。</li>
		<li>同时拉紧并打结三个结，以闭合伤口（图8C).</li>
		<li>将呼气末正压（PEEP）降至2 cmH₂O2立即进行 O。</li>
		<li>使用6-0尼龙缝线缝合皮肤。 
		&#8203;注意：本实验室研究移植后的急性期，因此在该模型中，受体大鼠在移植术后于通气和麻醉状态下存活3小时，随后采集样本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 实验样本（血浆、肺组织）的采集
<ol>
	<li>对于对照样本，在开始3小时再灌注期后，采集供体的右肺叶。
	<ol>
		<li>迅速冷冻上肺叶和腔静脉后肺叶，用于蛋白质或RNA表达分析；保留中肺叶用于组织学检查；下肺叶用于湿重-干重比测定（图9A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在3小时再灌注时间结束前10分钟，准备采集受体样本：使用胰岛素注射器向颈静脉注射肝素（1,000 U/kg）。 
	注意：此步骤中的肝素注射可防止肺部血液凝固，便于在取材时更彻底地灌洗。</li>
	<li>血浆采集
	<ol>
		<li>在3小时再灌注期结束时，通过下腔静脉（IVC）用注射器采集1 mL血液。</li>
		<li>将血液置于冰上保存，随后以2,000 × g离心10分钟，收集血浆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过切断下腔静脉使受体大鼠失血致死，实施安乐死。</li>
	<li>沿胸骨弓切开膈肌，并通过解剖胸廓暴露胸腔。</li>
	<li>如需，可采集原位肺或移植肺的支气管肺泡灌洗液（BAL）（可选步骤）。 
	注意：若需对肺组织进行湿重-干重比或组织学分析，则不应采集BAL液，因其可能影响实验结果。
	<ol>
		<li>在气管周围穿入4-0丝线缝合线，并在气管与插管周围打紧双结，防止液体泄漏。</li>
		<li>计算从右肺叶和左肺叶采集BAL液所需的冰冷磷酸盐缓冲液（PBS）体积。 
		注意：右肺体积占比为63%，左肺体积占比为37%16。因此，确定每侧灌注PBS体积时，应以潮气量（Td = 7.2 mL/kg）的两倍乘以右肺63%、左肺37%进行计算。</li>
		<li>在左肺门区域放置Yasargil夹（图10A），通过连接至血管套管的注射器，将计算量的冰冷PBS注入右肺（受体原位肺叶），并轻轻回抽注射器活塞以收集BAL液。重复操作一次。 
		注意：预期回收率为灌注液体积的70–80%。</li>
		<li>移除左肺门处的Yasargil夹，并将夹子置于右肺门区域（图10B）。</li>
		<li>以与右肺相同的方法采集移植左肺叶的BAL液，随后移除右肺门区域的夹子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用显微解剖弹簧剪剪开左右心耳，通过连接于导管和注射器的18 G血管套管，利用位于28 cmH2O高度的20 mL预冷保存液，经肺动脉（PA）重力灌洗肺脏。</li>
	<li>采集受体肺组织样本。
	<ol style="margin-left: 40px;">
		<li>迅速冷冻上肺叶和腔静脉后肺叶，用于蛋白质或RNA表达分析；保留中肺叶用于组织学检查；下肺叶用于湿重-干重比测定（图9A）。</li>
		<li>将移植的左肺叶分为三部分：上部用于速冻保存，中部用于组织学检查，下部用于湿重-干重比测定（图9B）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Akateh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+Delivery+of+Pegylated+Catalase+Is+Protective+in+a+Rat+Ischemia%2FReperfusion+Injury+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic Delivery of Pegylated Catalase Is Protective in a Rat Ischemia/Reperfusion Injury Model.</a> Journal of Surgical Research. 238, 152-163 (2019).</li>
</ol>

BAW、YGL 和 JLK 获得美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 R01HL143000 的支持。BAW 还获得美国国防部（DOD）资助项目 W81XWH1810787 的支持。SMB 获得 NIH 资助项目 R01DK123475 的支持。JM 获得 NIH 资助项目 AR061385、AR070752、DK106394 和 AG056919 以及 DOD 资助项目 W81XWH-18-1-0787 的支持。

在本报告中，我们对大鼠肺移植方案的多个关键步骤进行了干预，以优化该操作流程。&#160;尽管已有多种大鼠肺移植的套管技术被报道1,2,3,4,5,6,7,8,9,15该过程仍可能具有主观性，且难以被显微外科医生应用。我们强调应使用合适尺寸的套管分别用于肺静脉（PV）和肺动脉（PA），以向移植肺提供血液，或用于支气管（Br）以向移植肺提供空气，并提供了基于大鼠体重确定最佳套...

三十多年来，研究人员一直在不断改进大鼠肺移植模型，以使所获得的数据更加一致，并更真实地反映实际的临床状况。在本实验室开展该模型研究的过程中，我们确定了四个需要改进的方面：吻合口的套管技术、受体的第4支气管的识别、供体肺的保护策略，以及术后管理方案。th 肋间隙、肺膨胀及受体手术中的伤口闭合，以及样本采集用于分析。
对吻合术中的套管技术进行改良，可通过缩短供体肺的处理时间，并使显微外科医生的操作更加快速、简便，从而改善整个移植手术过程1,2,3,4,5,6。尽管选择合适尺寸的套管对于保障移植肺所需的血液和气流供应至关重要，但目前关于如何为肺静脉（PV）、肺动脉（PA）或支气管（Br）选择套管尺寸的指导极为有限5,7,8,9。由于PV、PA和Br的直径与供体及受体大鼠的体重相关，我们建议根据体重来确定套管尺寸。本报告提供了一份基于大鼠体重（180 g 至 270 g 以上）的套管尺寸指南，以优化移植肺的血液和通气供应（表 1）。
尽管初学者级别的显微外科医生在供体手术过程中能够成功且轻松地获取供体肺脏，但在受体手术过程中进行肺移植则更为复杂，且高度依赖于显微外科医生的经验。试图寻找4th 肋间隙以进入受体左肺是较为困难的步骤之一，该操作具有一定主观性，可能延长手术时间。因此，我们介绍一种简单且客观的方法，以辅助确定第4肋间隙th 通过胸部测量和心尖搏动触诊确定正确的肋间间隙位置以进行胸壁解剖4,5,6,10,11,12.
我们还提出了一种改进供体肺膨胀的方法，因为肺膨胀是可能导致器官损伤的一个潜在来源。供体肺在再灌注开始前保持萎陷状态。在缝合4th 肋间隙，通常通过将呼气末正压（PEEP）从2 cmH₂O逐步增加来使供体肺膨胀2O 至 6 cmH₂O2O. 为尽量减少因过度膨胀导致的肺损伤，我们提出一种技术：在4周围放置三根6-0尼龙缝线th 第5肋下方的肋骨th 用简单的双结打结。缝合伤口时，用止血钳分别夹住三根缝线的两端，双手同时向上牵拉两侧缝线，一次性关闭伤口，并立即将呼气末正压（PEEP）降至2 cmH₂O。2O。通过这种方式，使肺部扩张的时间尽可能短10.
实验结束后，研究者通常希望从每个移植组织中收集多种类型的样本，用于进行多种分析。例如，速冻组织、福尔马林固定组织、用于湿重-干重比以评估肺水肿的组织，以及支气管肺泡灌洗（BAL）液，均可用于评估移植手术的效果。传统的BAL液采集方法所获得的样本通常混合了受体自身肺叶与供体移植肺叶的灌洗液13,14,15。为克服这一局限，本文介绍一种夹闭肺门区域的方法，可更精确地分别评估移植肺与自体肺的状态。此外，用于从肺部两侧采集BAL液的PBS体积也需仔细考虑，因为BAL液中含有多种可溶性因子（如细胞因子和趋化因子），其浓度测定结果受灌注液体积的影响。将灌注液体积标准化为肺容量的估计值，有助于不同样本间的比较。大鼠右侧有四个肺叶，左侧有一个肺叶，五个肺叶各自的体积和表面积均不相同16。根据Backer等人此前关于肺叶体积测量的研究，全肺总体积中，右侧肺叶占63%（4400 mm3），左侧肺叶占37%（2500 mm3）。因此，我们建议用于采集BAL液的PBS体积应按潮气量（7.2 mL/kg）的两倍乘以63%计算右侧肺，乘以37%计算左侧肺。采用此方法，可更好地控制体重和时间等变量的影响10,16。
总之，本报告将介绍对大鼠肺移植标准实验模型的几项改进，这些改进可使手术过程更加高效，并提高每次实验获取数据的准确性和丰富性。

<table><tbody><tr><td>12 号血管导管</td><td>BD</td><td>382277</td><td></td></tr><tr><td>14 号血管导管</td><td>B. Braun</td><td>4251717-02</td><td></td></tr><tr><td>16 号血管导管</td><td>B. Braun</td><td>4252586-02</td><td></td></tr><tr><td>18 号血管导管</td><td>B. Braun</td><td>4251679-02</td><td></td></tr><tr><td>20 号血管导管</td><td>B. Braun</td><td>4252527-02</td><td></td></tr><tr><td>4-0 丝线缝合线</td><td>Surgical Specialties Corp.</td><td>SP116</td><td></td></tr><tr><td>6-0 尼龙缝合线</td><td>AD Surgical</td><td>S-N618R13</td><td></td></tr><tr><td>7-0 尼龙缝合线</td><td>AD Surgical</td><td>S-N718SP13</td><td></td></tr><tr><td>8-0 尼龙缝合线</td><td>AD Surgical</td><td>XXS-N807T6</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘喷雾剂</td><td>Avrio Health L.P</td><td>UPC 367618160039</td><td></td></tr><tr><td>剃毛剪</td><td>VWR</td><td>MSPP-023326</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 显微解剖弹簧剪</td><td>Roboz 外科器械公司</td><td>RS-5668</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>电凝器</td><td>Macan</td><td>MV-7A</td><td></td></tr><tr><td>气管插管套件</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-蚊式止血钳</td><td>Roboz 外科器械公司</td><td>RS-7112</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Fresnius Medical Care</td><td>C504701</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>Life Technologies</td><td>B328446</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal Critical Care</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇棉片</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Hikma Pharmaceuticals PLC</td><td>NDC 0413-9505-10</td><td></td></tr><tr><td>Dieffenbach 血管夹</td><td>World Precision Instruments</td><td>WPI14117</td><td></td></tr><tr><td>持针器/镊子，弯型</td><td>Micrins</td><td>MI1542</td><td></td></tr><tr><td>持针器/镊子，直型</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>Perfadex Plus（器官保存液）</td><td>XVIVO Perfusion AB</td><td>REF# 19950</td><td></td></tr><tr><td>PhysioSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-MSTAT-RT</td><td>用于检测血氧饱和度和心跳</td></tr><tr><td>牵开器</td><td>Roboz 外科器械公司</td><td>RS-6560</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>PP Pharmaceuticals LLC</td><td>NDC 63323-186-10</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite 小动物麻醉系统</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-MVG-Module</td><td></td></tr><tr><td>无菌&amp;nbsp;纱布垫</td><td>Fisherbrand</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Leica</td><td>M500-N w/ OHS</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-Tubingen 弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15008-08</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Korn Pharmaceuticals Corp</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>Yasargil 血管夹</td><td>Aesculap, Inc</td><td>FT351T</td><td>用于夹闭支气管</td></tr><tr><td>Yasargil 血管夹</td><td>Aesculap, Inc</td><td>FT261T</td><td>用于夹闭肺门</td></tr><tr><td>Yasargil 血管夹施夹器</td><td>Aesculap, Inc</td><td>FT484T</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究热缺血/再灌注损伤的大鼠肺移植模型：改善预后的优化策略

A Rat Lung Transplantation Model of Warm Ischemia/Reperfusion Injury: Optimizations to Improve Outcomes

根据我们进行大鼠肺移植的经验，发现了一些有待改进的方面。现有文献中关于选择适合肺静脉（PV）、肺动脉（PA）或支气管（Br）套管尺寸的方法各不相同，导致在大鼠肺移植过程中确定合适套管尺寸往往依赖于试错。通过标准化套管技术，采用与血管或支气管尺寸相匹配的最小有效套管，可使移植手术更安全、更快速且成功率更高。由于PV、PA和Br的直径与大鼠体重相关，我们提出一种基于体重的套管尺寸选择策略。鉴于肺容积也与体重相关，我们建议在选择供体肺于热缺血期间充气所需空气体积时，以及在支气管肺泡灌洗（BAL）液采集过程中确定所需PBS灌注体积时，也应考虑这一关系。我们还描述了4th 肋间间隙解剖、伤口缝合，以及从原肺叶和移植肺叶采集样本。

为了评估肺水肿，计算了湿重与干重之比。按照方案所述，采集供体的原生肺叶、移植肺叶以及受体的原生肺叶，立即称重以获得湿重，随后在60 °C下干燥48小时，再次称重以获得干重。湿重与干重之比升高提示存在肺水肿。我们的结果表明，与供体或受体的原生肺叶相比，移植肺叶的湿重与干重之比显著升高（p=0.0050，n=6/组；图11）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">套管用血管导管尺寸</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>大鼠体重 (g)</td>
			<td>PA</td>
			<td>Br</td>
			<td><stro...

在此，我们提出了一种优化的大鼠肺移植模型，可改善手术预后。我们根据体重提供了套管尺寸指南，以及一种用于确定4th 肋间隙，以及伤口缝合方法和支气管肺泡灌洗液与组织采集。

根据我们进行大鼠肺移植的经验，我们发现了若干有待改进的方面。现有文献中关于这些方法的资料……

本方案确定了四个关键环节，以帮助改进方法并实现可靠的肺移植。首先是可重复的套管技术。其次是准确且可重复地定位第四肋间，彻底关闭切口，然后是如何恢复并获取样本进行分析。这些技术有助于建立可靠的肺移植方法，以研究分子机制并开发治疗干预手段。首先启动手术设备，打开心率/血氧饱和度监测仪，并将板温预热至42摄氏度。同时，开启呼吸机和麻醉机，以预热异氟烷蒸发器。用10毫升液态异氟烷填充麻醉注射器，并将注射器安装到通气和麻醉机上。接着，打开手术显微镜，调节至合适的高度和焦距，并启动电凝设备。同样，准备好手术器械并摆放整齐。根据大鼠的体重，参考表一确定用于制作袖套的血管套管的合适规格。准备好肺动脉、支气管和肺静脉的袖套后，将相应尺寸的血管套管置于手术显微镜下的无菌表面上。然后，使用11号反向刀片将血管套管以90度角切割，形成长度为2毫米、顶部宽度和高度均为1毫米的袖套主体。手术准备就绪后，使用剪刀在颈部中线处做一个3至4厘米长的正中皮肤切口，用镊子仔细分离皮下组织和肌肉。进行气管插管时，先用4-0丝线围绕气管穿线。然后将16号套管针插入气管，并用双结将丝线在气管周围扎紧，再打一个单结以固定套管针的位置。将套管针连接至呼吸机，通过1%至2%异氟烷维持大鼠的外科麻醉水平。使用剪刀行胸腹正中联合横切口，即胸腹联合切开术。随后，经下腔静脉（IVC）使用胰岛素注射器注射每千克1000单位的肝素，并等待10分钟以确保全身循环。在肺脏通气的同时，使用显微解剖弹簧剪剪开左右心耳，然后将一根18号血管导管经肺动脉插入，利用连接于导管和血管导管的注射器，在28厘米水柱重力压力下，以20毫升保存液灌注冲洗肺脏。断开呼吸机与气管插管的连接，改接一支根据体重充入适当体积空气的5毫升注射器。在经历一小时的温缺血后，使用显微解剖弹簧剪和镊子切除心肺组织块，并将其置于冰上预冷的无菌培养皿中，培养皿内放置经冰冻PBS润湿的无菌纱布上。使用Vannas-Tubingen弹簧剪仔细修剪左侧肺门区域，游离出左肺静脉、肺动脉和支气管。用蚊式止血钳夹住套管标签，然后将肺静脉、肺动脉或支气管的远端穿过相应的套管主体，并将多余的组织翻转覆盖在套管周围，再用8-0尼龙缝线固定。操作完成后，使用Vannas-Tubingen弹簧剪修剪套管主体周围的多余组织和套管边缘。准备受体大鼠时，从胸骨上窝至剑突画一条线。在这条线的中点，沿大鼠左侧胸部画一条线，其长度为胸骨上窝至剑突距离的一半。使用气管插管包中连接LED光源的光纤电缆，观察并用16号套管针对受体进行插管。将肺部拉出后，用无菌纱布包裹左侧肺，并用Dieffenbach止血钳夹住，同时尽可能靠近近端在左侧肺门区域应用Yasargil钳。大鼠准备就绪后，将7-0尼龙缝线环绕受体肺静脉，进行肺静脉吻合。使用Vannas-Tubingen弹簧剪，在尽可能远端处横向剪断受体肺静脉的

a-rat-lung-transplantation-model-warm-ischemiareperfusion-injury

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科研

JoVE Journal

Medicine

医学

温缺血/再灌注损伤的大鼠肺移植模型:改善结局的优化

闭塞性细支气管炎是肺移植受者长期存活的主要障碍，而缺乏可靠的临床前模型限制了对闭塞性细支气管炎免疫病理机制的研究。与其他实体器官移植不同，带血管的小鼠肺移植技术直到最近才得以建立。本文展示了我们在小鼠原位单肺移植后独立建立的闭塞性细支气管炎模型。...

正位肺移植小鼠模型中闭塞性细支气管炎的形成

本研究的目的是改进大鼠原位肝移植模型，以更好地模拟人类肝移植并提高受体存活率。本方法通过将供体肝脏的肝总动脉与受体肝脏的肝固有动脉相吻合，重建肝脏动脉血流。...

异位肝移植大鼠模型中动脉重建后并发症减少

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建立一种用于循环死亡后大鼠肺脏的新型离体肺灌注系统

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大鼠原位左肺移植

热预处理期间 离体 移植前修复受损肺移植物的肺灌注技术

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