基于片段的先导化合物发现中用于筛选的纳米差示扫描荧光法

该方案可作为基于片段的先导化合物发现项目的有用工具，用于额外筛选有潜力的片段作为热候选分子。用于片段筛选的Nano DSO技术仅需少量未标记的蛋白质样品，几乎可常规应用于所有蛋白质靶点。该方法可用于筛选任何配体集合。

或验证其他方法产生的热效应。从-20或-80摄氏度冰箱中取出片段板，在台式摇床上轻轻振荡，室温下解冻。以500 × g离心30秒，收集附着在孔壁上的液滴。

取一个MRC 2孔结晶板，使用多通道移液器将15微升蛋白储备溶液加入每个子孔中。为在Mosquito系统上检查片段和蛋白板的定义，先打开纳米分配仪，并确保运动部件周围无障碍物。打开图形用户界面，点击“Setup”选项卡，在“Deck Configuration”下检查提供化合物的板类型以及转移蛋白所用的板类型是否已存在于可用板列表中。

如果没有，请点击“选项”，然后选择“板”并输入属性类型的正确值以创建新的板定义。在“设置”选项卡下，于“甲板配置”中指定板的位置。使用下拉菜单，为位置一选择 Grainier U 底板，为位置二选择 MRC 2 孔板，然后保存该方案。

将片段板放置在甲板的位置一，将蛋白板放置在位置二。在“协议”选项卡中，点击“文件”并选择上一步中保存的用于分配片段的协议。设定要分配的片段体积为 0.3 µL。

对于一个典型的孔板，若第一列和第12列不包含片段，则将起始位置设为第二列，结束位置设为第11列。在某些孔板中，如果第二列或第11列为空，则使用第三列和第十列作为起始和结束值。点击“运行”以启动程序。

加样完成后（约需两分钟），从机器人上取下蛋白质板和片段板，并用压敏密封膜密封。将蛋白质板在500 × g条件下短暂离心30秒，以收集附着在孔壁上的液滴，然后进行下一步操作。目视检查蛋白质板各孔中是否出现因加入片段而产生的沉淀。

若在多个孔中观察到沉淀，则降低片段的浓度并重复实验。打开 Prometheus 仪器。在触摸屏上，按“打开抽屉”以访问仪器的毛细管上样模块。

取下加样模块上的磁条，并用乙醇清洁镜面以去除任何灰尘颗粒。要将溶液从蛋白质片段板转移至毛细管中，请将蛋白质板和毛细管放置在仪器旁边，以便于接近毛细管加样模块。取一根毛细管，用手握住其一端，用另一端接触蛋白质板中的溶液，以转移样品。

始终佩戴手套，并确保不要触碰毛细管的中部，因为手套上的杂质会影响测量结果。将毛细管放入支架的指定位置，确保其正确对齐并居中。重复上述步骤，填满上样模块中的所有位置。最后，将磁条放置在毛细管上方以固定毛细管，并点击“关闭抽屉”以开始Nano-DSF实验。

打开Prometheus应用程序PR.ThermControl，通过点击“Start New Session”创建一个新项目。首先进行发现扫描，以检测样品的荧光信号。通过调节激光的激发功率来改变样品的荧光信号。

进行热变性实验时，点击“熔解扫描”选项卡，将起始温度设置为 20 摄氏度，终止温度设置为 95 摄氏度，温度斜率为每分钟 1 摄氏度，然后点击“开始测量”。此处展示了外层蛋白、动力学蛋白或在癌症中高表达的蛋白、单极纺锤体激酶 1 的调节性四肽重复结构域以及 SARS-CoV-2 3c 样蛋白酶的位移和熔解温度的频率分布。

负值表示片段存在时熔解温度降低，而正值表示熔解温度升高。对于 Nsp5，所有片段均具有去稳定作用；而对于 Hec1 和 Mps1，则同时观察到稳定性和去稳定性的作用。这是一种经济快速的片段库筛选方法。

其他方法（如核磁共振或X射线晶体学）可以显示片段的精确结合情况，这些方法也可通过INX发现平台获得。冠状病毒蛋白酶的研究结果有助于提出可开发为抗COVID-19药物的新化合物。