将珠粒负载的蛋白质和核酸导入贴壁人源细胞

微珠加载是一种经济的检测方法，用于将膜不通透性颗粒导入活的贴壁细胞中。该方案已被证明在单细胞或单分子荧光显微镜实验中加载探针时极为有用。微珠加载技术使研究人员能够快速地将各种分子（包括蛋白质、DNA、RNA、合成颗粒，或这些物质的组合）同时导入单个细胞中。

初次进行微珠加载时，测试敲击力度非常重要。不同细胞系对微珠加载的反应各异，因此可调整敲击次数和力度，以实现最佳的细胞加载效果，同时尽量减少细胞脱落。

为了演示该实验步骤，Matthew Saxton 和我将与我们的同事 Dr. Amanda Cook 和 Gabriel Galindo 一同进行。首先，在一个 50 毫升的锥形管中加入约 5 毫升玻璃珠。向管中加入 25 毫升 2 摩尔的氢氧化钠溶液，并使用摇床或旋转仪轻轻混合两小时。

如果珠子处于悬浮状态，先将珠子离心管在离心机中短暂离心，然后倒出氢氧化钠溶液，同时尽可能保留珠子。用细胞培养级水彻底洗涤珠子，直至pH呈中性，每次洗涤后均弃去上清液。使用pH试纸检测流出液以确认pH为中性，随后用100%乙醇彻底洗涤珠子两到三次。

每次倾去乙醇。将磁珠干燥，并撒开使其在无菌容器内形成一层薄层。然后将容器敞口置于生物安全柜中，让磁珠过夜风干。

轻轻敲击或摇晃容器，检查微珠是否呈沙粒状质地，无结块或剥落现象，以确保微珠完全干燥。将微珠加入装置中，并使用孔径为105微米的聚丙烯网膜或等效材料覆盖珠粒储存室的整个开口，以允许微珠通过。将网膜夹在金属可重复使用成像室的公母接口之间，然后用蜡膜紧密封口，并对装置进行15分钟的紫外灭菌。

现在可以使用珠子加样装置进行数百次加样实验。将该装置存放在由硅胶或其他干燥介质干燥的干燥容器中并密封。如果珠子受潮，请彻底干燥并灭菌珠子加样装置，并更换新的珠子，具体操作如前所述。

移除细胞中的培养基，并轻轻抽吸干净细胞室边缘的所有培养基。然后将细胞室倾斜约45度角，吸除中心微孔中残留的液滴。将珠子加载溶液轻轻移液至细胞室中心的玻璃微孔中。

使用微珠加载装置将玻璃微珠轻柔地分散在细胞表面，形成单层。确保微珠完全覆盖细胞。用两根手指夹住培养腔，将其提起约两英寸高，然后以相当于从该高度轻轻下落的力度迅速放下。随后，用移液枪沿培养腔的塑料侧壁缓慢加入培养基。

吸去未贴壁的磁珠，注意不要扰动细胞，整个磁珠孵育过程应相对快速进行，以免细胞在无培养基的情况下干燥。随后将细胞置于培养箱中孵育4.5至2小时。

成像前，用培养基洗涤细胞三次，以去除珠子及负载溶液中过量的负载组分。根据实验需要，立即或按照文稿中的说明进行细胞成像。成功负载珠子的细胞中，Cy3-Pa57 和 A488-H3K11ac 几乎总是同时标记了相应蛋白质。

通过微珠载入法，将1微克编码GFP的质粒DNA和0.5微克Cy3标记的蛋白导入细胞，并进行表达与可视化观察。40%的细胞成功载入了fab蛋白，其中21%的载珠细胞表达了所载入的质粒。载珠细胞中质粒的表达水平存在差异。

该Fisher比率检验的结果表明，尽管蛋白质一和蛋白质二具有相似的强度分布，但每种蛋白质的分布均显著小于质粒的分布。珠载蛋白的水平在细胞间的变异很小，且同时加载的两种蛋白质的水平彼此高度相关。在珠加载前立即、加载后立即以及加载24小时后进行成像时，适当的珠加载对人U2OS细胞数量或其形态几乎没有明显影响。

珠子装载不当，珠子过多且敲击力度过大，导致细胞丢失、细胞形态差以及盖玻片上残留珠子团块。尽管在珠子装载过程中细胞可能受到机械损伤，但在正确装载珠子的腔室内，细胞仍能生长并增殖。此外还观察到，装载珠子的细胞能够进行细胞分裂。

通过使用抗体片段（fab）对RPE1和HeLa细胞系进行微珠加载，以展示微珠加载技术的通用性。同时，将Cy5标记的9个核苷酸RNA（Cy5-RNA 9-mer）和Cy3标记的28个核苷酸DNA（Cy3-DNA 28-mer）共同加载至U2OS细胞。在执行本实验方案时，务必仅添加单层微珠至细胞，因为微珠过多会导致细胞脱落。

因此，在磁珠加载细胞后的短暂30分钟恢复期结束后，细胞即可用于成像，可立即进行，也可在数小时至数天后进行；如果实验流程需要染色等额外步骤，也可在恢复期之后完成。