Name: 珠子将蛋白质和核酸加载到附体人类细胞中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学习珠子加载技术，通过机械搅拌将蛋白质、DNA、RNA及合成颗粒高效导入贴壁哺乳动物细胞。该方法成本低、操作简便，适用于活细胞成像与荧光显微镜实验，且对细胞活力和形态影响极小。

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我们感谢Stasevich实验室成员参与了无数次的讨论，这些讨论有助于本实验方案的改进与开发。特别感谢Linda Forero博士和Phil Fox博士在不同细胞类型珠子加载方面的建议。我们诚挚感谢Yoko Hayashi-Takanaka博士、Yuko Sato博士和Hiroshi Kimura博士分享了他们的玻璃珠加载实验方案。我们非常感谢Ashok Prasad博士和Diego Krapf博士慷慨分享了他们用于将无机颗粒导入细胞的珠子加载方案。我们感谢Travis Sanders博士、Craig Marshall和Thomas Santangelo博士慷慨提供标记的RNA试剂。ALK，MNS，&#160;CAC，GG&#160;TJS 获得美国国立卫生研究院（NIH）资助 R35GM119728 支持&#160;以及美国国家科学基金会（NSF）CAREER 资助项目 MCB-1845761&#160;至TJS。CAC还得到了以下支持：&#160;NSF&#160;NRT 奖项 DGE-1450032

1. 清洁、灭菌并干燥玻璃珠，以避免结块，并确保其在细胞表面均匀分布。
<ol>
	<li>用氢氧化钠（NaOH）灭菌约 5 mL 玻璃珠。将玻璃珠放入 50 mL 锥形管中，加入 25 mL 2 M NaOH，使用摇床或旋转仪轻轻混合 2 小时。</li>
	<li>倾去 NaOH 溶液，尽量保留玻璃珠。若玻璃珠处于悬浮状态，可将锥形管在离心机中短暂离心（室温下约 1000 × g 离心 1 分钟）。</li>
	<li>用细胞培养级水彻底清洗玻璃珠，直至 pH 呈中性（使用 pH 试纸检测洗液，确认 pH 为中性）。每次清洗后均按前述方法倾去洗涤水。</li>
	<li>用 100% 乙醇彻底清洗玻璃珠 2–3 次。每次清洗后均按前述方法倾去乙醇。</li>
	<li>干燥玻璃珠。将玻璃珠撒开，在无菌容器（如 10 cm 培养皿）内形成一层薄层。容器保持开放状态，在生物安全柜中过夜风干。通过轻敲或轻轻摇晃容器，检查玻璃珠是否完全干燥，确保其呈沙状质地，无结块或剥落现象。</li>
	<li>对干燥的玻璃珠进行紫外线灭菌 15 分钟。</li>
</ol>
2. 组装微珠加载装置。
<ol>
	<li>将一片网筛（聚丙烯或等效材料，孔径105 µm，允许珠子通过）用胶带固定，或夹在金属可重复使用成像室的公母接头之间，以完全覆盖珠子储存室的开口（图1A）。</li>
	<li>对装置进行15分钟的紫外灭菌。将珠子加入装置中，并用蜡膜严密封口。 
	注意：此步骤中珠子必须完全清洁且干燥。珠子应呈松散的砂状，无结块。若不符合此状态，需重新清洗并彻底干燥珠子。</li>
	<li>将装置存放于由硅胶或其他干燥介质干燥的密闭干燥容器中。若珠子受潮（表现为珠子结块），需彻底干燥并灭菌珠子加样装置，并更换新的珠子。 
	&#8203;注意：以上所有预防措施可防止珠子加样装置内的珠子及其周围生长霉菌或细菌。珠子加样装置可通过不同方式制备，详见讨论部分。</li>
</ol>
3. 准备贴壁细胞的玻璃底培养皿。
<ol>
	<li>将贴壁的哺乳动物细胞接种到35 mm玻璃底培养皿中。确保细胞在加载微珠时融合度约为80%。（有关不同类型细胞以及微珠加载在不同细胞类型中效果的更多信息，请参见表1。） 
	注意：为节约细胞用量，可仅将细胞接种至培养皿中央的微孔中。</li>
	<li>在正常条件下培养细胞，直至细胞完全贴附于玻璃表面。 
	&#8203;注意：细胞密度必须足够高，且细胞必须牢固贴附于玻璃表面。若未满足这些条件，细胞在微珠加载过程中很可能脱落。可根据需要延长细胞接种至微珠加载之间的时间，以确保细胞充分贴壁和达到适当融合度。</li>
</ol>
4. 磁珠加载细胞
注意：如有需要，先用磷酸盐缓冲液（PBS）短暂清洗细胞，然后加入 2 mL 最佳培养基。至少孵育 30 分钟。
<ol>
	<li>配制含有目标质粒、蛋白质和/或颗粒的溶液，体积为 3–8 µL。根据实验需求，每种质粒使用约 1 µg（0.1–1 pmol），蛋白质使用约 0.5 µg（0.01 nmol）。蛋白质操作应使用低吸附管，以避免其吸附在管壁上残留。用 PBS 将溶液体积补足至至少 3 µL，并根据待转染细胞区域的大小（即腔室中的微孔，图 1B）调整总体积，确保溶液能完全覆盖该区域。</li>
	<li>通过反复吹打和/或轻弹管壁充分混匀溶液，然后在台式微量离心机中短暂离心，使溶液全部沉降至管底。</li>
	<li>将微珠加载溶液和含细胞的腔室转移至组织培养超净台内。后续所有操作均需在超净台中以无菌技术进行。</li>
	<li>移除细胞培养基，并暂时将其储存于无菌离心管中。小心吸除腔室边缘的所有培养基，将腔室倾斜约 45° 角，吸去中心微孔中残留的液滴。在去除培养基过程中，注意避免移液枪头接触玻璃表面，以防细胞脱落或损伤。操作应迅速，避免细胞长时间暴露干燥。</li>
	<li>将微珠加载溶液轻柔地滴加至腔室中央的玻璃微孔区域。可选步骤：在不使腔室完全干燥的前提下，轻轻振荡孵育约 30 秒。</li>
	<li>将玻璃微珠轻柔地分散覆盖于细胞表面，形成单层，建议使用微珠加载装置（图 1A）。确保微珠完全覆盖玻璃底微孔中的细胞。</li>
	<li>用两指夹住腔室，将其抬高约 5 厘米后用力敲击超净台表面。施加的力度应大致相当于从该高度自由落体的冲击力。重复敲击，共进行约 10 次。 
	注意：确保敲击不会导致细胞明显脱落。可根据细胞类型优化敲击强度；若转染效率低，可适当增加力度；若细胞脱落过多，则应减轻敲击力度。</li>
	<li>通过缓慢地将培养基沿腔室塑料侧壁加入，轻柔地重新填充培养基。尽量吸除漂浮的微珠，同时避免扰动已贴附的细胞。若之前去除的培养基过多，此时可补充预温的培养基。将细胞放回培养箱孵育 0.5–2 小时。</li>
	<li>使用后，将微珠加载装置在紫外线下灭菌 15 分钟，随后在干燥条件下储存。</li>
	<li>根据实验需要，按照制造商推荐方案向细胞中加入染料（例如 DAPI 或 HaloTag 配体染色剂）。</li>
	<li>成像前用培养基洗涤细胞 3 次，以去除微珠及溶液中多余的加载组分。洗涤时避免直接将液体滴加在细胞上，防止细胞脱落。</li>
</ol>
5. 成像载珠细胞
<ol>
	<li>根据实验需要立即或在指定时间对细胞进行成像。使用能够捕获荧光的显微镜（如激光或单色光源）。确保激发波长与所选荧光染料或荧光分子相匹配（例如，绿色荧光蛋白（GFP）使用488 nm波长的光）。 
	注意：对于已加载微珠的蛋白质，可在细胞恢复后进行成像（对于本文所述细胞系，最早可在加载后30分钟进行）。质粒表达所需时间≥2小时，具体取决于表达载体元件（图1C，讨论部分有进一步说明）。对加载微珠的细胞进行成像时，可使用配备适当荧光光源（对应所加载探针）、能够捕获荧光图像的相机（如电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）或科学级互补金属氧化物半导体（sCMOS）相机）以及可控制温度、湿度和二氧化碳浓度的培养箱的任意显微镜系统。有关荧光显微镜的指南，请参见文献27。</li>
</ol>

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<li>Sabri, A., Xu, X., Krapf, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+origin+of+heterogeneous+anomalous+diffusion+in+the+cytoplasm+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Elucidating the origin of heterogeneous anomalous diffusion in the cytoplasm of mammalian cells.</a> Physical Review Letters. 125 (5), 053901(2020).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+system+to+track+histone+modification+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded system to track histone modification in vivo.</a> Scientific Reports. 3, 2436(2013).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述的微珠加载技术是一种经济高效且省时的方法，可用于将大分子及其他颗粒导入贴壁细胞中。该多功能方法可实现蛋白质（图2A）15,16,26,27、蛋白质与质粒的组合（图2B、C）22,25、RNA（图4C）、100 nm和250 nm聚苯乙烯微珠（个人通讯）、合成染料39&#160;或量子点34,40的导入。微珠加载技术还可能适用于其他类型细胞膜不通透性颗粒的导入。该技术最常用的应用是将抗体或抗原结合片段（Fabs）导入活细胞，以靶向内源性表位，例如翻译后修饰（PTMs）。对于PTMs等靶标，在缺乏特异性识别PTMs的基因编码探针的情况下，通常难以在活细胞中进行标记41,42。相比之下，微珠加载技术可将多种类型的探针、报告分子或其他分子工具同时导入同一细胞，从而实现多指标的同步检测。我们预计，微珠加载技术将成为导入多种大分子或颗粒的有用工具。
珠子加载的主要优势在于成本低廉：每次实验的成本低于0.01美元。珠子加载装置可使用廉价材料轻松制作，总成本约为150美元，远低于其他任何细胞加载方法。通过将可重复使用的金属腔室替换为塑料腔室，珠子加载装置的成本可进一步降低至10美元以下。为此，可在35 mm的培养皿上钻孔，或从35 mm玻璃底培养皿中移除玻璃，然后用胶带将筛网牢固固定。若无装置，也可使用宽口1000 µL移液器吸头舀取并撒布珠子到细胞上，但这种方法难以将珠子以单层形式均匀撒布到细胞表面（步骤4.6）。
珠子加载的另一个优点是细胞能够保持正常的整体形态，快速恢复，并继续生长和分裂，至少在本研究中涉及的U2OS、RPE1和HeLa细胞以及其他文献报道的细胞系中是如此（图3；图4A、B；补充视频1；以及表1）31。在珠子加载过程中，细胞会经历物理应力，有时会发生脱离和剥离（在最佳条件下约有5%的细胞发生剥离，但如果珠子加载操作过于剧烈或在细胞上加载过多玻璃珠，则可能导致更严重的细胞损失，如图3B所示）。然而，仍附着在盖玻片上的珠子加载细胞通常表现健康，最早可在珠子加载后30分钟进行成像（图3A）。我们通常给予细胞30分钟的恢复时间，但预计在珠子加载后更短时间内进行成像也是可行的。
该技术的一个主要缺点是，细胞必须能够耐受加载过程中轻微的物理应力，并牢固地贴附在盖玻片上。贴壁能力差或不贴壁的细胞系，或在包被培养板上生长的细胞（例如 HEK 细胞和干细胞），在微珠加载过程中轻微敲击时常常会脱落。此外，经验表明，原代神经元对微珠加载过于敏感。
珠载法最适合用于单细胞或单分子实验。根据我们的经验，珠载法的蛋白载入效率约为20%-40%，且约20%的珠载细胞同时表达了共载的质粒（图2A、B）。因此，与直接载入纯化蛋白相比，通过珠载法导入质粒进行蛋白表达的效率可能更低，因为质粒不仅需要进入细胞，还需完成表达过程（包括核输入、转录和翻译等多个步骤，每个步骤均可能降低表达效率）。珠载质粒表达效率低的问题可通过在珠载蛋白或探针前采用其他转染方案（如脂质体转染）来规避16，27。此外，在珠载前将细胞置于最佳培养基中孵育30分钟，可能有助于提高质粒表达水平。由于质粒表达效率较低，本实验室通常不将珠载法作为基于脂质体转染的替代方法。唯一的例外情况是当需要共载入纯化的蛋白（如Fab片段）时，此时同时通过珠载法导入蛋白和质粒则非常方便。此外，对于对脂质体转染无反应或耐受性差的细胞，珠载法可提供一种替代的、尽管效率较低的瞬时质粒表达方法。

将大分子物质导入哺乳动物细胞需要能够使其穿过细胞质膜的技术方法1。可通过转染将质粒导入哺乳动物细胞的方法有多种，包括脂质体转染2和二乙氨基乙基-葡聚糖转染3。然而，将蛋白质或不能穿透膜的颗粒物质导入细胞的方法则较为有限。
已有多种技术通过不同的策略克服了这一难题。首先，显微注射技术可在显微镜下通过微移液管将颗粒直接导入活细胞内4。尽管该方法可以说是控制最精确、侵入性最小的技术，但其通量相对较低，因为细胞必须逐个进行加载。此外，显微注射需要专用设备，且技术操作难度较高。
其次，电穿孔是一种通过电压诱导细胞膜破裂将蛋白质电注射到细胞内的方法5,6,7。然而，该方法同样需要专用且昂贵的设备，且电击可能导致细胞应激和死亡。此外，细胞在电穿孔前必须经过胰蛋白酶消化处理，并在之后重新接种，这限制了电穿孔后可进行研究的时间窗口。
第三，细胞膜可通过化学修饰实现暂时性、可逆的通透性增加8,9。链球菌溶素O（Streptolysin-O）负载后可在细胞膜上插入一种内毒素，形成临时孔道，使外源性膜不可渗透的颗粒（包括蛋白质和DNA质粒）进入细胞10。经过约2小时的恢复期后，约一半的细胞可修复这些孔道，并停止从溶液中摄取颗粒。然而，该技术需要较长的恢复时间，且不适用于不能耐受内毒素的细胞类型。
第四，机械破碎法通过物理扰动细胞膜将颗粒导入细胞11。该方法可通过多种方式实现，包括刮擦、刮取以及在细胞表面滚动微珠12,13。早在1987年，已有研究利用微珠将蛋白质机械导入细胞14。近年来，微珠导入技术已得到优化，并不仅限于蛋白质，还可用于质粒和RNA的导入，本文对此进行了描述。
微珠转染是一种简单、经济且快速将蛋白质和质粒导入贴壁人源细胞的方法。通过短暂滚动玻璃微珠作用于细胞，可暂时破坏细胞膜，从而使溶液中的分子进入细胞。由于微珠转染效率较低，因此最适合用于单分子或单细胞显微成像实验。该方法可导入多种类型的蛋白质，包括抗体片段（Fab）15,16、如scFv类的纯化蛋白质17、胞内抗体（intrabodies）18,19，或mRNA结合蛋白，例如MS2衣壳蛋白（MCP）20,21。质粒表达载体也可与蛋白质溶液混合，通过微珠转染同时导入细胞22,23,24,25。
除了蛋白质和质粒外，通过珠加载技术已可将大小达250 nm的聚苯乙烯微球导入细胞内（个人&#160;通讯）。珠加载技术成本极低，每次实验的材料费用不足0.01美元，且无需额外昂贵设备。由于每次实验仅需将探针用于成像腔室中央直径为14 mm的微孔区域内的细胞，探针用量显著减少，进一步降低了成本。需要注意的是，加载区域有限意味着珠加载并不适用于大规模细胞加载。
本文介绍了微珠加载过程，包括如何构建微珠加载装置并开展实验。结果表明，蛋白质、RNA 和 DNA 可被加载到多种细胞类型中，且两种不同但同时通过微珠加载的蛋白质在细胞内的浓度高度相关，变异程度相对较低。文中还讨论了根据细胞类型以及所加载的蛋白质、质粒或 RNA 的不同而对实验方案进行的调整。尽管微珠被认为会穿孔并破坏细胞膜，但当操作恰当时，微珠加载过程仅会使成像培养皿底部少量细胞脱落。经过短暂的恢复期后，细胞可继续生长和分裂。该方法非常适用于活细胞显微成像实验，包括单分子蛋白质和RNA追踪、翻译后修饰检测、动态细胞机制观察或亚细胞定位监测15,16,22,26,27。

<table><tbody><tr><td>10 cm 细胞培养皿</td><td>VWR</td><td>82050-916</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>35 mm 细胞培养皿</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>用于构建微珠加载装置</td></tr><tr><td>Attofluor 细胞培养腔室</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A7816</td><td>用于构建定制的微珠加载装置</td></tr><tr><td>DMEM，高糖，无谷氨酰胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11960069</td><td>用于常规细胞培养</td></tr><tr><td>Drierite 指示性干燥剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07-578-3B</td><td>将微珠加载装置与这些干燥剂颗粒一同存放于干燥器中</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlas Biologics</td><td>F-0050-A</td><td>用于常规细胞培养，以及微珠加载前的补充添加</td></tr><tr><td>玻璃微珠，酸洗，&amp;le;106 &amp;micro;m*</td><td>Millipore Sigma</td><td>G4649</td><td>撒在细胞上以实现质粒DNA和蛋白质的微珠加载</td></tr><tr><td>玻璃底培养皿，35 mm，#1.5，14 mm 玻璃</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>将细胞接种于这些腔室内用于成像</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺-200 mM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>用于配制含补充成分的DMEM培养基（DMEM + media）</td></tr><tr><td>Opti-MEM，减血清培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>微珠加载前孵育细胞的最佳培养基（可选步骤）</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>VWR</td><td>52858-032</td><td>用于构建微珠加载装置的蜡质薄膜</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>用于配制含补充成分的DMEM培养基（DMEM + media）</td></tr><tr><td>无酚红DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31053036</td><td>成像前用于处理细胞</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td>无菌1X PBS工作液</td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>使用2 M溶液清洗玻璃微珠</td></tr><tr><td>Spectra Mesh 编织滤膜，聚丙烯，105 &amp;micro;m 孔径</td><td>Spectrum Labs</td><td>148496</td><td>用于构建微珠加载装置</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300062</td><td>用于常规细胞培养</td></tr></tbody></table>

将珠粒负载的蛋白质和核酸导入贴壁人源细胞

Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells

许多活细胞成像实验使用外源性颗粒（例如肽、抗体、微珠）来标记细胞或在细胞内发挥功能。然而，将蛋白质穿过细胞膜导入细胞内部具有较大难度。目前可用的方法选择有限，普遍存在效率低下、需要昂贵且技术要求高的设备，或仅在狭窄的参数范围内有效等问题。本文介绍一种相对简单且成本低廉的技术，可用于将DNA、RNA和蛋白质导入活的人类细胞中。微珠加载法通过诱导细胞膜产生短暂的机械性扰动，使大分子物质得以进入贴壁生长的活体哺乳动物细胞。该方法每次实验的成本低于0.01美元，是目前最经济的细胞导入技术。此外，微珠加载对细胞造成的应激较小，基本不影响细胞的活力或增殖能力。本文详细描述了微珠加载的操作步骤、适应性调整、变异形式及技术局限性。该方法特别适用于活细胞成像研究，同时也为需要将蛋白质、微珠、RNA或质粒导入活体贴壁哺乳动物细胞的其他应用提供了切实可行的解决方案。

磁珠转染最常见的应用是将一种或多种蛋白质导入贴壁的人源细胞中。为说明这一点，将细胞通过磁珠转染导入含有Cy3和Alexa488标记的Fab蛋白溶液。尽管微孔中的每个细胞并非都被成功转染，但被转染的细胞几乎总是同时含有Cy3和Alexa488标记的蛋白质（图2A）。根据先前的估算，当将0.5微克稀释于4微升中的Fab蛋白进行磁珠转染时29（如图2A所示），每个细胞大约被导入106个Fab分子。
通过微珠加载法将编码GFP的质粒DNA（1 µg质粒DNA，即557 ng/µL溶液的1.8 µL）和0.5 µg Cy3标记的Fab片段共同导入细胞，并随后进行表达与观察（图2B）。GFP荧光信号表明，编码GFP的质粒不仅成功导入细胞，而且实现了表达。因此，在同一细胞中，微珠加载法可同时导入蛋白探针（例如Cy3标记的Fab片段）和报告质粒（例如GFP质粒），这与本实验室先前的研究方法一致22,23,24。我们发现，40%的细胞成功通过微珠加载了Fab蛋白，其中21%的微珠加载细胞表达了共导入的质粒，代表性视野如图2B所示。通常情况下，每个腔室加载1–2 µg质粒，加载量与脂质体转染法大致相当。
负载微珠的细胞中质粒的表达水平表现出广泛差异（图2C，D）。为定量评估这一现象，我们采用Fisher比率检验来比较蛋白质与质粒强度数据的分布情况。结果显示，尽管蛋白质1和蛋白质2的强度分布相似（p = ~1），但两种蛋白质的分布范围均显著小于质粒的分布（p = 3.2e-6 和 1.8e-5）。这种差异可能源于每个细胞所摄入质粒数量的不均一性，但更大的变异来源可能是质粒表达过程中多个步骤在细胞间的显著差异，包括质粒进入细胞核、转录和翻译等过程。相比之下，微珠负载的蛋白质在细胞间的表达水平变异较小，且同时导入的两种蛋白质的表达水平彼此高度相关（图2D，E）。
质粒表达最早可在磁珠加载后2-4小时观察到，但具体时间可能因达到最佳质粒表达的时间而有所延迟。我们建议进行时间进程实验，以确定特定质粒在磁珠加载后2-24小时范围内的最佳表达窗口。该实验可通过一个腔室的长时间成像完成，或通过磁珠加载并依次处理多个腔室来实现。加载磁珠的细胞仍保持贴壁状态，并具有足够的健康程度以继续生长和分裂。在磁珠加载前、加载后即刻以及加载后24小时，对加载磁珠的人类U2OS细胞进行了直接成像观察。如图3A（左、中）所示，正确的磁珠加载对细胞数量或形态几乎无明显影响。
相比之下，珠子装载不当、珠子过多以及振击力度过大则如图所示 图3B这导致了大量细胞丢失（盖玻片上出现大片无细胞区域，以及脱落、漂浮、失焦的细胞）、细胞形态差（细胞呈圆缩状且贴壁不良），以及在加载磁珠后仍有磁珠簇残留在盖玻片上。尽管认为细胞在磁珠加载过程中可能遭受机械损伤，但在正确加载磁珠的腔室中，细胞仍能生长和增殖，这一点可通过磁珠加载24小时后细胞数量增加得到证实。图 3A，正确）。可通过多种检测方法评估细胞活力的影响，例如采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）检测法，比较载珠细胞与模拟载珠细胞的活力差异30此外，本研究及先前的工作表明，载有微珠的细胞能够进行细胞分裂（图3C 和 补充视频 1，且有丝分裂的时间进程不受微珠加载的影响31这进一步证明了细胞在加载微珠后仍保持持续的健康状态。
微珠加载是一种多功能技术，可适用于多种贴壁细胞系及各类大分子。本文通过将RPE1和HeLa细胞系加载Fab片段，展示了该技术的适用范围（图4A、B）。表1进一步列举了本实验室及其他实验室在不同细胞系中进行微珠加载的更多实例，并指出了不同实验室间微珠加载方案中存在的一些细微差异。值得注意的是，各实验室所用玻璃微珠的直径差异较大，但在多个细胞系中发现，直径较小的75 µm微珠加载效率最高14。此外，本实验室已开始尝试用微珠加载RNA（数据未显示）。图4C展示了一个典型的U2OS细胞，其通过微珠加载同时导入了Cy5标记的9聚体RNA和Cy3标记的28聚体DNA。
<img alt="采用微珠加载技术的细胞培养加载方法。示意图及逐步操作流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62559/62559fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：微珠加载装置、技术及操作时间线 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62559/62559fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜示意图；蛋白质表达分析，A488-H3K11ac，Cy3-Pa57，sfGFP 质粒。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62559/62559fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图 2．微珠加载在蛋白质浓度中引入的变异性较低，但在质粒表达中变异性较高。（A）细胞通过微珠加载方式导入 4 µL 微珠加载溶液中的每种试剂 0.5 µg，包括 Alexa488 标记的抗 H3K27 乙酰化 Fab 片段（绿色）和 Cy3 标记的抗 RNA 聚合酶 II 丝氨酸 5 磷酸化 Fab 片段（红色）。细胞经 DAPI 染色（蓝色）后立即进行活细胞成像。比例尺 = 20 µm。（B）细胞通过微珠加载方式导入 4 µL 微珠加载溶液中的 0.5 µg Fab 蛋白（Cy3 标记的抗 RNA 聚合酶 II 丝氨酸 5 磷酸化蛋白，红色）和 1 µg 编码超折叠 GFP-H2B 的质粒（绿色）。24 小时后，细胞经 DAPI 染色（蓝色）并进行活细胞成像。比例尺 = 30 µm。（C–E）将蛋白 1（JF646-HaloLigand 标记的 HaloTag-MCP）、蛋白 2（Cy3 标记的抗 FLAG Fab）以及编码 EGFP 的质粒（λN-EGFP-LacZ）共同通过微珠加载导入细胞。在每个细胞的细胞质中选取 1.3 × 1.3 µm 区域，测量各荧光通道的总强度。N = 25 个细胞。（C）表达微珠加载质粒 λN-EGFP-LacZ 的代表性细胞。所有细胞均采用相同的成像条件和强度设置。斑点为表达蛋白的聚集体。比例尺 = 10 µm。（D）图表显示了每个细胞中蛋白 1、蛋白 2 或质粒表达的 EGFP 的总强度。每个通道的强度均归一化至中位数。采用 Fisher 比率检验计算经 Bonferroni 校正的 P 值，以判断蛋白或质粒强度数据的分布是否具有相同的变异性。每个数据点代表一个细胞。（E）分别将两种蛋白、蛋白 1 与质粒、或蛋白 2 与质粒的总强度相互对照作图。显示了计算得到的 R2 值。每个数据点代表一个细胞。缩写：DAPI = 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚；EGFP = 增强型绿色荧光蛋白；A.U. = 任意单位；MCP = MS2 衣壳蛋白；RNAPII = RNA 聚合酶 II。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62559/62559fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞培养反应分析；延时显微图像显示细胞在不同时间间隔内的变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62559/62559fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：负载微珠的细胞保持贴壁状态，并且健康到足以生长和分裂。 （A）U2OS 细胞使用 4 µL 微珠负载溶液，负载 0.5 µg Cy3 标记的抗 FLAG Fab 片段。在微珠负载前、负载后立即以及负载后 24 小时对细胞进行成像。橙色箭头标示出在微珠负载过程中细胞脱落的区域。比例尺 = 2 mm。（B）U2OS 细胞使用（A）中的组分进行微珠负载，但因剧烈敲击和微珠过多导致结果异常。红色箭头标示出多余的玻璃微珠。比例尺 = 2 mm。（C）U2OS 细胞使用 8 µL 微珠负载溶液，负载 1.5 µg 的 14.4 kbp 质粒 smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2、0.5 µg Cy3 标记的抗 FLAG Fab（绿色）以及 130 ng HaloTag-MCP（品红色）。成像前，使用 JF646-HaloLigand 对 HaloTag 进行染色。报告质粒转录的 mRNA 上的 MS2 发夹结构由 MCP 标记（品红色斑点），而翻译出的 FLAG 标签报告蛋白则由抗 FLAG Fab 标记（与 mRNA 共定位呈绿色）。成熟的 Fab 标记蛋白定位于细胞核。该细胞在微珠负载后 4–15 小时进行成像。黄色箭头标示细胞分裂前的细胞核以及分裂后的子代细胞核。比例尺 = 5 µm。缩写：MCP = MS2 衣壳蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62559/62559fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜；RPE1、HeLa细胞系；细胞核、细胞质标记；复合图像，Cy3-DNA，Cy5-RNA。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62559/62559fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：微珠加载法中不同细胞类型加载材料的差异。（A-B）RPE1（A）和HeLa（B）细胞通过4 µL加载溶液，使用1.5 µg核内Fab蛋白（抗RNA聚合酶II丝氨酸5磷酸化）进行微珠加载。每个细胞的细胞核（nuc）和细胞质（cyto）均已标示。细胞在微珠加载后6小时进行成像。比例尺 = 5 µm。（C）人U2OS细胞在4 µL微珠加载溶液中同时加载Cy5标记的9mer RNA（品红色）和Cy3标记的28mer DNA（绿色）寡核苷酸，每种各10皮摩尔。细胞在微珠加载后4小时进行成像。所有细胞核均以虚线标出。比例尺 = 5 µm。缩写：RNAPII = RNA聚合酶II。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62559/62559fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody style="font-size: 14px;">
		<tr>
			<td>细胞系</td>
			<td>细胞类型</td>
			<td>微珠加载效率</td>
			<td>备注/参考文献</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>干细胞（人）</td>
			<td>胚胎干细胞</td>
			<td>困难</td>
			<td>*若细胞接种于明胶包被的培养板上，在微珠加载过程中许多细胞会脱落</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK 293</td>
			<td>人胚胎肾细胞</td>
			<td>困难</td>
			<td>*在微珠加载前需在成像腔表面铺设凝胶基质。初次进行微珠加载时应轻敲</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>神经元（大鼠）</td>
			<td>原代胚胎神经元（e-18），已解离</td>
			<td>极低效</td>
			<td>*使用本标准微珠加载方案未观察到神经元的有效微珠加载。这可能是由于神经元的非贴壁特性或神经突起在操作中受到损伤所致</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDCK（犬）</td>
			<td>Madin-Darby 犬肾细胞</td>
			<td>参见 McNeil 和 Warder（1987）14</td>
			<td>*微珠加载效率低14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U2OS（人）</td>
			<td>骨肉瘤细胞</td>
			<td>标准微珠加载方案</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa（人）</td>
			<td>宫颈癌细胞</td>
			<td>标准微珠加载方案</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPE1（人）</td>
			<td>经 hTERT 永生化的上皮细胞</td>
			<td>标准微珠加载方案</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFF（人）</td>
			<td>原代包皮成纤维细胞</td>
			<td>参见 Besteiro 等（2009）31 </td>
			<td>*采用倾斜而非轻敲的改良方案31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">BALB/c 3T3、NIH 3T3 和 Swiss 3T3（小鼠）</td>
			<td rowspan="3">胚胎成纤维细胞</td>
			<td rowspan="3">参见 Gilmore 和 Romer（1996）32、Emerson 等（2014）33 和 McNeil 与 Warder（1987）14</td>
			<td>*报道使用 425–600 μm 玻璃微珠32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*使用 200–300 μm 玻璃微珠33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*75 μm 玻璃微珠效果优于 400 μm14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM（印度麂）</td>
			<td>皮肤成纤维细胞</td>
			<td>参见 Manders、Kimura 和 Cook（1999）34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO（仓鼠）</td>
			<td>类上皮卵巢细胞</td>
			<td>参见 Memedula 和 Belmont（2003）35</td>
			<td>*使用 425–600 μm 玻璃微珠35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BAE（牛）</td>
			<td>牛主动脉内皮细胞（BAEC-11）</td>
			<td>参见 McNeil 和 Warder（1987）14</td>
			<td>*75 μm 玻璃微珠效果优于 400 μm14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PtK-2（Potomus tridaclylis）</td>
			<td>肾上皮细胞</td>
			<td>参见 McNeil 和 Warder（1987）14</td>
			<td>*75 μm 玻璃微珠效果优于 400 μm14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC（人）</td>
			<td>脐静脉内皮细胞</td>
			<td>参见 Gilmore 和 Romer（1996）32</td>
			<td>*使用 425–600 μm 玻璃微珠32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>J774 和 J774.2（小鼠）</td>
			<td>单核巨噬细胞</td>
			<td>参见 Becker 等（2005）36 和 McNeil 与 Warder（1987）14</td>
			<td>*采用轻柔振荡（而非轻敲）及 425–600 μm 玻璃微珠36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-5（小鼠）</td>
			<td>骨髓基质细胞</td>
			<td>参见 Molenaar 等（2003）37</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">WPE1-NB11（人）</td>
			<td rowspan="2">前列腺上皮细胞</td>
			<td>参见 Gilmore 和 Romer（1996）32 和</td>
			<td>*使用 425–600 μm 玻璃微珠32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emerson 等（2014）33</td>
			<td>*使用 200–300 μm 玻璃微珠33</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：不同细胞系中的微珠加载情况。 对于本实验室尚未进行微珠加载的细胞系，提供了相关参考文献以及实验方案中步骤差异的说明。
补充视频 1：加载微珠的细胞进行细胞分裂的示例。 将 U2OS 细胞与 8 µL 微珠加载溶液混合，其中包含 1.5 µg 的 14.4 kbp 质粒 smFLAG-KDM5B-15xBoxB-24xMS2、0.5 µg Cy3 标记的抗 FLAG Fab 抗体（绿色）和 130 ng HaloTag-MCP（品红色）。成像前，使用 JF646-HaloLigand 对 HaloTag 进行染色。报告质粒转录出的 mRNA 上的 MS2 发夹结构由 MCP 标记（品红色斑点），而带有 FLAG 标签的翻译产物则通过抗 FLAG Fab 抗体标记（与 mRNA 共定位呈绿色）。成熟的 Fab 标记蛋白定位于细胞核内。该细胞在微珠加载后 4–15 小时进行成像。比例尺 = 10 µm。缩写：MCP = MS2 衣壳蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62559/bead_load_cell_divides.avi" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

微珠加载法可将蛋白质、质粒和颗粒导入贴壁哺乳动物细胞。该细胞加载技术成本低廉、操作快速，且对细胞活性影响较小。尤其适用于活细胞成像。

许多活细胞成像实验使用外源性颗粒（如多肽、抗体、微珠）来标记细胞或在细胞内发挥功能。然而，引入这些颗粒……

微珠加载是一种经济的检测方法，用于将膜不通透性颗粒导入活的贴壁细胞中。该方案已被证明在单细胞或单分子荧光显微镜实验中加载探针时极为有用。微珠加载技术使研究人员能够快速地将各种分子（包括蛋白质、DNA、RNA、合成颗粒，或这些物质的组合）同时导入单个细胞中。初次进行微珠加载时，测试敲击力度非常重要。不同细胞系对微珠加载的反应各异，因此可调整敲击次数和力度，以实现最佳的细胞加载效果，同时尽量减少细胞脱落。为了演示该实验步骤，Matthew Saxton 和我将与我们的同事 Dr. Amanda Cook 和 Gabriel Galindo 一同进行。首先，在一个 50 毫升的锥形管中加入约 5 毫升玻璃珠。向管中加入 25 毫升 2 摩尔的氢氧化钠溶液，并使用摇床或旋转仪轻轻混合两小时。如果珠子处于悬浮状态，先将珠子离心管在离心机中短暂离心，然后倒出氢氧化钠溶液，同时尽可能保留珠子。用细胞培养级水彻底洗涤珠子，直至pH呈中性，每次洗涤后均弃去上清液。使用pH试纸检测流出液以确认pH为中性，随后用100%乙醇彻底洗涤珠子两到三次。每次倾去乙醇。将磁珠干燥，并撒开使其在无菌容器内形成一层薄层。然后将容器敞口置于生物安全柜中，让磁珠过夜风干。轻轻敲击或摇晃容器，检查微珠是否呈沙粒状质地，无结块或剥落现象，以确保微珠完全干燥。将微珠加入装置中，并使用孔径为105微米的聚丙烯网膜或等效材料覆盖珠粒储存室的整个开口，以允许微珠通过。将网膜夹在金属可重复使用成像室的公母接口之间，然后用蜡膜紧密封口，并对装置进行15分钟的紫外灭菌。现在可以使用珠子加样装置进行数百次加样实验。将该装置存放在由硅胶或其他干燥介质干燥的干燥容器中并密封。如果珠子受潮，请彻底干燥并灭菌珠子加样装置，并更换新的珠子，具体操作如前所述。移除细胞中的培养基，并轻轻抽吸干净细胞室边缘的所有培养基。然后将细胞室倾斜约45度角，吸除中心微孔中残留的液滴。将珠子加载溶液轻轻移液至细胞室中心的玻璃微孔中。使用微珠加载装置将玻璃微珠轻柔地分散在细胞表面，形成单层。确保微珠完全覆盖细胞。用两根手指夹住培养腔，将其提起约两英寸高，然后以相当于从该高度轻轻下落的力度迅速放下。随后，用移液枪沿培养腔的塑料侧壁缓慢加入培养基。吸去未贴壁的磁珠，注意不要扰动细胞，整个磁珠孵育过程应相对快速进行，以免细胞在无培养基的情况下干燥。随后将细胞置于培养箱中孵育4.5至2小时。成像前，用培养基洗涤细胞三次，以去除珠子及负载溶液中过量的负载组分。根据实验需要，立即或按照文稿中的说明进行细胞成像。成功负载珠子的细胞中，Cy3-Pa57 和 A488-H3K11ac 几乎总是同时标记了相应蛋白质。通过微珠载入法，将1微克编码GFP的质粒DNA和0.5微克Cy3标记的蛋白导入细胞，并进行表达与可视化观察。40%的细胞成功载入了fab蛋白，其中21%的载珠细胞表达了所载入的质粒。载珠细胞中质粒的表达水平存在差异。该Fisher比率检验的结果表明，尽管蛋白质一和蛋白质二具有相似的强度分布，但每种蛋白质的分布均显著小于质粒的分布。珠载蛋白的水平在细胞间的变异很小，且同时加载的两种蛋白质的水平彼此高度相关。在珠加载前立即、加载后立即以及加载24小时后进行成像时，适当的珠加载对人U2OS细胞数量或其形态几乎没有明显影响。珠子装载不当，珠子过多且敲击力度过大，导致细胞丢失、细胞形态差以及盖玻片上残留珠子团块。尽管在珠子装载过程中细胞可能受到机械损伤，但在正确装载珠子的腔室内，细胞仍能生长并增殖。此外还观察到，装载珠子的细胞能够进行细胞分裂。通过使用抗体片段（fab）对RPE1和HeLa细胞系进行微珠加载，以展示微珠加载技术的通用性。同时，将Cy5标记的9个核苷酸RNA（Cy5-RNA 9-mer）和Cy3标记的28个核苷酸DNA（Cy3-DNA 28-mer）共同加载至U2OS细胞。在执行本实验方案时，务必仅添加单层微珠至细胞，因为微珠过多会导致细胞脱落。因此，在磁珠加载细胞后的短暂30分钟恢复期结束后，细胞即可用于成像，可立即进行，也可在数小时至数天后进行；如果实验流程需要染色等额外步骤，也可在恢复期之后完成。

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珠子将蛋白质和核酸加载到附体人类细胞中

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体外细菌黏附哺乳动物上皮细胞实验

本文描述了一种用于测量当受体和配体均锚定在相互作用细胞表面时其相互作用动力学的黏附频率检测方法。该基于力学的检测方法以微管加压的人红细胞作为黏附传感器，并以整合素αLβ2和细胞间黏附分子-1作为相互作用的受体与配体进行示例说明。...

黏附频率检测 原位 细胞-细胞界面交叉连接分子相互作用的动力学分析

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本文介绍一种简单、快速的方法，用于表征假定细胞黏附分子的内在黏附特性。将细胞黏附分子分泌的、带有表位标签的胞外结构域从培养基中捕获至小型、均一的功能化微珠上。随后可立即利用这些微珠进行简单的微珠聚集实验。...

用于表征候选细胞黏附分子的微珠聚集实验

细菌附着于宿主细胞是宿主定植和感染过程中的关键步骤。本方案描述了制备聚合物偶联的重组黏附素作为仿生材料的方法，该材料可独立于其他细菌因子，用于分析单个黏附素在这些过程中所起的作用。...

用于表征细菌-宿主相互作用的仿生材料

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支撑脂双层中的配体纳米簇阵列

细胞表面黏附在机械转导过程中起核心作用，因其可传递机械张力并启动参与组织稳态与发育的信号通路。本文介绍一种利用配体包被的磁性微珠对黏附受体施加外力，以解析张力响应所激活的生化通路的实验方案。...

利用磁珠分析细胞表面黏附在机械张力作用下的重塑过程

将介绍一种先进的显微镜，该显微镜能够对分离的质膜及其周围的细胞内体积进行快速且高分辨率的成像。将转盘共聚焦显微技术与全内反射荧光显微技术集成于同一系统，可实现高达每3.5秒获取一幅图像堆栈的高速活细胞成像实验。...

利用先进的转盘-全内反射荧光显微镜技术可视化细胞中的黏附形成

本方案介绍了进行黏附足迹实验以成像快速细胞滚动黏附过程中黏附事件的实验步骤。...

成像细胞滚动过程中分子黏附的黏附足迹检测法

本文介绍了使用脂质双层支撑微球逐步重建合成抗原呈递细胞的方案，以及利用该系统检测活化T细胞突触输出的方法。...

制备用于研究T细胞免疫突触颗粒输出的珠载脂质双层

学习珠子加载技术，通过机械搅拌将蛋白质、DNA、RNA及合成颗粒高效导入贴壁哺乳动物细胞。该方法成本低、操作简便，适用于活细胞成像与荧光显微镜实验，且对细胞活力和形态影响极小。

将珠粒负载的蛋白质和核酸导入贴壁人源细胞

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