利用D11 scFv-碱性磷酸酶融合蛋白和免疫荧光法直接检测组织中的异构左旋前列腺素

异左旋前列腺素已被证实与多种疾病相关，尤其是心血管疾病。本实验方案旨在利用D11碱性磷酸酶融合蛋白及免疫荧光技术检测组织中的异左旋前列腺素。目前的检测方法成本较高，或需要针对E标签的二抗。

寻找一种可靠的二抗十分困难，但本方案省去了使用二抗的步骤。将小鼠和人源石蜡包埋组织切片浸入二甲苯中，每次五分钟，重复三次，以完成脱蜡。为使组织复水，先用95%乙醇洗涤组织两次，随后用70%乙醇洗涤两次，最后用50%乙醇（用水配制）洗涤两次。

用含0.1% Tween 20的Tris缓冲盐水（TBST）清洗载玻片，将TBST加入载玻片架中，重复洗涤三次，然后弃去TBST。将载玻片放入预热的柠檬酸钠缓冲液中，置于高压锅内，设定为高压加热4分钟，总抗原修复时间为20分钟。

孵育结束后，从压力锅中取出载玻片，并在室温下冷却20分钟。用TBST对载玻片进行三次快速洗涤，方法如所示。加入溶解于TBST中的2% BSA对载玻片进行封闭。

用石蜡膜覆盖载玻片，在室温下孵育15分钟。孵育结束后，弃去封闭缓冲液。向载玻片中加入200 µL用TBST配制的D11碱性磷酸酶，并用石蜡膜覆盖载玻片。

将切片在室温下于湿盒中孵育3小时后，用TBST洗涤切片3次。使用比色碱性磷酸酶显色试剂盒进行免疫组织化学显色，或使用荧光碱性磷酸酶显色试剂盒进行免疫荧光显色。用TBST洗涤切片1次，以去除多余的显色剂并防止进一步显色。

使用磷酸盐缓冲液（PBS）配制的每毫升含一微克的HEX核染色剂对载玻片进行免疫荧光复染。随后用TBST缓冲液洗涤载玻片一次，以去除多余的复染剂。使用封片剂将盖玻片封固在已处理的载玻片上。

使用倒置光学显微镜观察免疫组织化学切片，或使用共聚焦荧光显微镜观察免疫荧光切片。可进行四种阴性对照实验以验证 D11 AP 染色对异左旋前列腺素的特异性。在第一种阴性对照实验中，将组织与用 TBST 稀释的 D11 AP 或仅 TBST 孵育。

然后将组织与稀释后的D11 AP以及在TBST中稀释的细菌周质提取物共同孵育，但不加入D11 AP连接剂。对于竞争性实验，制备异构亮氨酸加合物（isoLG）及其与小鼠血清白蛋白以8:1摩尔比结合的复合物。将D11 AP用TBST按1:10比例稀释。

然后将稀释的D11 AP与50微克/毫升的异左旋葡萄糖醛酸加合物修饰的MSA，或未修饰的MSA在室温下孵育一小时。将含异左旋葡萄糖醛酸加合物修饰MSA的D11 AP或含未修饰MSA的D11 AP加入组织中进行染色。使用相应的单链可变区片段抗体D20对组织进行染色，作为最终的阴性对照组。

采用本方案研究了高血压和正常血压小鼠主动脉的免疫荧光。使用 D11 AP 染色显示，与对照小鼠相比，血管紧张素 II 诱导的高血压小鼠主动脉中异构左旋前列腺素（isoLGs）浓度升高。D11 AP 还用于检测高血压患者和正常血压人类个体肠道组织中存在的一类异构左旋前列腺素（isolevuglandins）。

高血压患者的组织中异构左旋谷氨酸（isolevuglandins）浓度升高。组织分别用胞质提取物染色和未用D11 AP染色。与用胞质提取物染色的组织相比，用D11 AP染色的组织显示出更强的染色信号，证实染色结果并非由胞质提取物中存在的非偶联细菌碱性磷酸酶引起。在竞争性实验中，将D11 AP预先与isoLG竞争物孵育后进行染色，其组织染色强度减弱，与仅使用D11 AP染色的组织结果相似，表明D11 AP对异构左旋谷氨酸具有特异性。

在阴性对照中，使用 D11 AP 对小鼠主动脉进行染色，与 D20 相比显示出强烈的染色信号，表明 D11 AP 对高血压主动脉中的异左旋前列腺素具有特异性。重要的是要灭活组织中可能存在的内源性碱性磷酸酶，以减少背景染色。