Name: 一种生成周期负荷诱导的大鼠膝关节内软骨病变模型的非侵入性方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 4 s
Description: 了解一种非侵入性方法，通过周期性负荷诱导大鼠膝关节软骨损伤，无需手术即可建立软骨病变模型。该方法操作简便，适用于不同经验水平的研究人员，为关节健康研究提供可靠工具。

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本研究部分得到了日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（编号 JP18H03129 和 JP18K19739）的资助。 
此项研究还获得了再生康复研究联盟的资助 &amp;#38; 培训中心（AR3T），由美国国立卫生研究院（NIH）尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所（NICHD）、国家神经疾病与中风研究所（NINDS）和国家生物医学成像与生物工程研究所（NIBIB）通过资助编号P2CHD086843提供支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

该实验方案已获京都大学动物研究委员会批准（批准号：Med kyo 17616）。
1. 执行 体内 大鼠膝关节的周期性压缩
<ol>
	<li>诱导实验动物麻醉
	<ol>
		<li>在麻醉箱中通过吸入5%异氟烷溶液对一只12周龄的Wistar大鼠（256.8 ± 8.7 g）进行麻醉诱导。</li>
		<li>腹腔注射三种麻醉剂的混合物9，包括美托咪定、咪达唑仑和丁丙诺啡，按大鼠体重 2 mg/kg 给药，并剃除右膝关节周围区域的毛发。通过脚趾夹捏无足底反射确认麻醉充分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将麻醉后的大鼠固定在固定装置上。
	<ol>
		<li>将麻醉后的大鼠俯卧位放置于基板上（图1)，将右膝关节固定于带凹槽的树脂小块上。将右后肢置于髋关节伸展、膝关节屈曲和踝关节伸展的位置，膝关节屈曲角度约为140°。将大鼠的足跟放置在可移动夹具的楔形凹槽内。</li>
		<li>将固定装置移至应力/拉伸测试仪器（参见 材料表）。在确保载荷传感器无任何接触后，打开应力/拉伸测试仪器的控制软件（材料表）并点击 校准 按钮。校准后，小心地将框架顶部连接到载荷传感器。为使膝关节紧密贴合框架，缓慢旋转可移动主操作面板上的旋钮，直至预载荷达到 5 N。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建立加载方法并设置压缩试验。
	<ol>
		<li>在 主菜单，点击 创建新方法 | 系统 标记。设置 测试模式 到 循环，以及 检测类型 到 压缩. 点击 传感器 标记并选择 测试 检查限值是否在 60 N 以内。此外，选择 中风 标签并检查限值是否在500 mm范围内。 
		注意：如果应力点出现较大位移，上述步骤将立即停止操作。</li>
		<li>在……之下 测试对照 标记，选择 生长起源 以0.3%满量程启动主程序。在一个加载循环的四个阶段中，设置 对照组中的中风速度 在第1个st 和 3rd 切片速度设为1 mm/s。设置 最大测试力 在第2个nd 节段至20 N，以及 最小测试力 在第4个th 向 5 N 方向切段 &#34;持续按压时间&#34; 至峰值载荷时为0.5秒，最小载荷时为10秒（图2). 
		注意：由于此步骤定义了每个循环，需确保关节表面相互接触，以合理速度运动，并保持运动状态。</li>
		<li>在 预加载 页面底部的标签，确保 开启 被检查时， 偏转去除速度 设定为 100 mm/min，且 最大力 是 5 N。在 样本 标记，设置 材料 作为 金属. 
		注意：这些详细设置可能因制造商而异。</li>
		<li>在 主菜单，在以下条件下 选择方法并进行测试 切片，选择刚刚构建的方法，然后单击 开始 开始测试。 
		注意：下表显示了峰值载荷和位移的实际测量值。</li>
		<li>将循环次数设置为60。 
		&#8203;注意：整个加载过程包括60个循环，持续约12分钟。对照组大鼠在相同条件下接受5 N预加载，预加载时间为12分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>载样后，将大鼠放回笼中并监测直至完全恢复。在笼中维持12小时光照-12小时黑暗的循环周期，并提供充足的空间和食物。 随意摄取 在所需的实验周期结束后，通过腹腔注射过量的三种麻醉剂混合物或吸入过量二氧化碳处死大鼠，用于后续分析（1小时至8周）。</li>
</ol>

<ol><li>De Souza, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+axial+loading+of+mouse+tibiae+increases+cortical+bone+formation+and+modifies+trabecular+organization%3A+a+new+model+to+study+cortical+and+cancellous+compartments+in+a+single+loaded+element%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Non-invasive axial loading of mouse tibiae increases cortical bone formation and modifies trabecular organization: a new model to study cortical and cancellous compartments in a single loaded element.</a> Bone. 37 (6), 810-818 (2005).</li>
<li>Poulet, B., Hamilton, R. W., Shefelbine, S., Pitsillides, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+a+novel+and+adjustable+noninvasive+murine+joint+loading+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Characterizing a novel and adjustable noninvasive murine joint loading model.</a> Arthritis and Rheumatism. 63 (1), 137-147 (2011).</li>
<li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+response+of+mouse+joint+tissue+to+noninvasive+knee+injury+suggests+treatment+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Early response of mouse joint tissue to noninvasive knee injury suggests treatment targets.</a> Arthritis and Rheumatism. 66 (5), 1256-1265 (2014).</li>
<li>Poulet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+applied+mechanical+loading+induces+subchondral+bone+thickening+that+may+be+intensified+locally+by+contiguous+articular+cartilage+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Intermittent applied mechanical loading induces subchondral bone thickening that may be intensified locally by contiguous articular cartilage lesions.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 940-948 (2015).</li>
<li>Ko, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+cell-mediated+changes+in+articular+cartilage+and+bone+in+mice+are+initiated+by+a+single+session+of+controlled+cyclic+compressive+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Progressive cell-mediated changes in articular cartilage and bone in mice are initiated by a single session of controlled cyclic compressive loading.</a> Journal of Orthopaedic Research. 34 (11), 1941-1949 (2016).</li>
<li>Adebayo, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+subchondral+bone+properties+and+changes+in+development+of+load-induced+osteoarthritis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Role of subchondral bone properties and changes in development of load-induced osteoarthritis in mice.</a> Osteoarthritis Cartilage. 25 (12), 2108-2118 (2017).</li>
<li>Ko, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cyclic+compression+causes+cartilage+degeneration+and+subchondral+bone+changes+in+mouse+tibiae%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">In vivo cyclic compression causes cartilage degeneration and subchondral bone changes in mouse tibiae.</a> Arthritis and Rheumatism. 65 (6), 1569-1578 (2013).</li>
<li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+cyclic+compressive+loading+on+the+distribution+of+local+Col2+and+superficial+lubricin+in+rat+knee+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo cyclic compressive loading on the distribution of local Col2 and superficial lubricin in rat knee cartilage.</a> Journal of Orthopaedic Research. 39 (3), 543-552 (2021).</li>
<li>Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+three+types+of+mixed+anesthetic+agents+alternate+to+ketamine+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice.</a> Experimental Animals. 60 (5), 481-487 (2011).</li>
<li>Iijima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+medial+meniscus+leads+to+subchondral+bone+defects+and+site-specific+cartilage+degeneration+in+an+experimental+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the medial meniscus leads to subchondral bone defects and site-specific cartilage degeneration in an experimental rat model.</a> Osteoarthritis Cartilage. 22 (7), 1036-1043 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本方案首次展示了如何在大鼠股骨外侧髁上建立一种由负荷诱导的软骨损伤模型，类似于小鼠等小型啮齿类动物中的关节内损伤模型2。然而，小鼠的负荷方案会导致严重的骨赘形成和交叉韧带损伤，因此并不适合用于评估周期性压缩负荷的效果。本方案通过使用显著更低的负荷力，在大鼠中成功诱导出局灶性软骨损伤。正确的负荷参数设置对本方案至关重要，因为只有适当大小、速度和持续时间的应力才能在不损伤骨组织的前提下破坏软骨。
设定位移限制（方案步骤 1.3.1）也至关重要，因为在韧带断裂或大鼠在加载过程中从麻醉状态中苏醒时，仪器会立即停止运行。最佳最大载荷以及大鼠的年龄仍有待确定。然而，在初步实验中，超过 50 N 的载荷会导致大鼠膝关节前交叉韧带（ACL）断裂的概率显著升高。此外，目前的模型在较年长大鼠（&#62;36 周龄）中难以重复建立，这可能与生长过程中软骨变僵硬有关。
尽管尚未确定年轻大鼠的破坏性负荷阈值，但认为未来的研究应将最大负荷控制在20 N以下，以观察对软骨的任何合成代谢效应。病变区域的范围和定...

传统上，前交叉韧带（ACL）横断或内侧半月板失稳被认为是研究小动物创伤后骨关节炎（PTOA）的最佳方法。近年来，已采用非侵入性周期性压缩模型来研究PTOA。该模型最初设计用于研究松质骨对机械负荷的反应1，随后被改进为一种用于PTOA研究的非手术动物模型2,3,4,5,6。其原理是通过施加周期性外部力撞击&#160;关节软骨，从而引发一系列炎症反应。然而，该模型目前仅应用于小鼠，尚未探讨在较大动物中适宜的负荷强度。
先前模型的另一个问题是，大容量方案包含过多的循环次数，导致多个样本中出现软骨下骨过度增厚这一不良副作用7。因此，研究人员开发了一种适用于大型动物、具有适当载荷强度且副作用更小的新型循环压缩方法8。本文的总体目标是描述在大鼠中应用非侵入性循环压缩模型的实验方案，并展示软骨退变的典型结果。本实验方案将有助于对在大鼠中应用非侵入性循环压缩模型感兴趣的读者。

<table><tbody><tr><td>小型动物麻醉装置</td><td>SHINANO MFG CO.,LTD.</td><td>SN-487-0T</td><td></td></tr><tr><td>Autograph AG-X</td><td>Shimadzu Corp</td><td>N.A.</td><td>精密万能/拉伸试验机</td></tr><tr><td>Fluoview FV10i 显微镜</td><td>Olympus Corp</td><td>N.A.</td><td>全自动共聚焦激光扫描显微镜</td></tr><tr><td>异氟烷吸入溶液</td><td>Pfizer Japan Inc.</td><td>(01)14987114133400</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific Japan Inc</td><td>L3224</td><td>一种快速简便的双色检测方法，用于测定细胞活力</td></tr><tr><td>TRAPEZIUM X 软件</td><td>Shimadzu Corp</td><td>N.A.</td><td>Autograph AG-X 数据处理软件</td></tr></tbody></table>

一种非侵入性建立大鼠膝关节内关节软骨损伤模型的方法

A Non-Invasive Method for Generating the Cyclic Loading-Induced Intra-Articular Cartilage Lesion Model of the Rat Knee

原发性骨关节炎（OA）的病理生理机制尚不明确。然而，在相对年轻的人群中，OA 的一个特定亚分类可能与关节软骨损伤和韧带撕脱史相关。膝关节 OA 的手术动物模型在理解创伤后 OA 的发病机制和进展过程中发挥着重要作用，并有助于开发针对该疾病的新疗法。然而，近年来人们开始考虑采用非手术模型，以避免创伤性炎症对干预效果评估产生的影响。
在本研究中，通过诱导建立了一种大鼠关节内软骨损伤模型 体内 开发了一种循环压缩载荷方法，使研究人员能够：（1）确定可导致局灶性软骨损伤的载荷最佳强度、速度和持续时间；（2）评估创伤后软骨细胞活力的时空病理变化；（3）评价参与关节压缩载荷适应与修复机制的破坏性或保护性分子的组织学表达。本报告描述了在大鼠模型中建立这种新型软骨损伤的实验方案。

对经受 20 N 循环载荷的样本中软骨细胞活力的短期变化（1 小时和 12 小时）进行检测，获得了代表性结果。如图 3所示，创伤后 12 小时，死亡软骨细胞（红色荧光）数量增加；相反，活软骨细胞（绿色荧光）数量持续减少，部分样本在受损区域中已无存活的软骨细胞。
组织学显示，接受20 N动态负荷的大鼠膝关节关节软骨出现损伤，所有样本的股骨外侧髁均确认存在一个局灶性损伤区域（图4）。然而，在8周的观察期内，损伤范围并未持续扩大。在受损区域可观察到与损伤区和未受影响软骨交界处相对应的边界。
<img alt="固定装置示意图；生物力学研究中基板上用于足跟-膝盖固定的树脂凹槽。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62660/62660fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282...

本文介绍了通过在超过20 N的载荷下进行60次循环压缩，诱导大鼠膝关节内关节软骨损伤的模型，该方法可导致大鼠股骨髁软骨发生损伤。

原发性骨关节炎（OA）的病理生理机制尚不明确。然而，在相对较年轻的年龄组中，OA可能存在一种特定的亚分类……

本方案表明，可以在动物（尤其是大型动物）中诱导软骨损伤，且无需手术干预或对动物膝关节进行结构性破坏。最大的优势在于，该方法在不同操作者中均具有良好的可重复性，即使无经验的操作者也能实现，而这一点在任何手术方法中都难以达到。首先，将麻醉后的大鼠固定在固定装置上。将麻醉后的大鼠俯卧于基板上，其右膝固定在带有凹槽的小块树脂上。将右后肢置于髋关节伸展、膝关节屈曲和踝关节伸展的位置，膝关节屈曲角度约为140度。将大鼠的足跟放置在可移动夹具的楔形凹槽内。将固定装置移至应力和拉伸测试仪，并确保其与负荷传感器无任何接触。打开应力和拉伸测试仪的控制软件，点击校准按钮。校准完成后，小心地将框架的顶部连接到负荷传感器上。缓慢旋转可移动主操作面板上的旋钮，直至预载荷达到五牛顿，以使膝关节紧密贴合于框架上。在主菜单中，点击创建新方法和系统标签。将测试模式设置为循环，测试类型设置为压缩。单击传感器标签，选择测试选项卡，检查限值是否在 60 牛顿以内。然后选择行程选项卡，检查限值是否在 500 毫米以内。在测试控制标签下，选择生长原点以启动主程序，设置为 0.3% 或满量程。将第一和第三部分的控制行程速度设置为每秒1毫米，然后将第二部分的最大测试力设置为20牛顿，第四部分的最小测试力设置为5牛顿。将峰值载荷的持续时间设置为0.5秒，最小载荷的持续时间设置为10秒。在页面底部的预加载选项卡中，确保勾选“开启”，挠度去除速度设置为每分钟100毫米，最大作用力设置为5牛顿。在样本标签中将材料设置为金属。在主菜单的“选择方法和测试”部分，选择刚刚建立的方法，然后单击“开始”以启动测试。将循环次数设置为60次。加载完成后将大鼠放回笼中，并在具有充足空间且可自由进食的条件下，维持12小时光照-12小时黑暗的饲养周期，直至进行分析。研究了受到20牛顿循环载荷作用的样本中软骨细胞活力的短期变化。创伤后12小时，死亡软骨细胞数量增加。相反，活软骨细胞的数量持续减少。接受20牛顿动态负荷的大鼠膝关节关节软骨出现损伤，所有样本的股骨外侧髁均确认存在一个局灶性病变区。在为期八周的观察期内，病变范围未进一步扩大。在受累区域可以观察到病灶与未受影响的软骨之间的边界。最重要的是测试力和循环次数的适当设置。利用该技术，可控制机械负荷对关节覆盖区域血供的影响，为探索机械负荷如何影响骨关节炎的发生或预防提供了途径。

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一种生成周期负荷诱导的大鼠膝关节内软骨病变模型的非侵入性方法

动物模型是评估组织工程移植物的重要工具。本文介绍了制备用于前交叉韧带组织工程的静电纺可生物降解聚合物移植物的实验方案，以及在大鼠模型中进行移植手术的操作流程。...

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