Name: 树脂辅助捕获与同量异位串联质量标签标记相结合，用于蛋白质硫醇氧化的多重定量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: 学习树脂辅助捕获与同量异位串联质量标签标记相结合的方法，用于蛋白质硫醇氧化的多重定量分析。该技术可位点特异性地鉴定氧化半胱氨酸残基，为氧化还原生物学研究提供可靠的定量数据。

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本工作的部分研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金 R01 DK122160、R01 HL139335 和 U24 DK112349 的资助

本方案中所述所有涉及动物或人类样本/组织的实验程序均经人类与动物研究伦理委员会批准，并遵循其机构指南。
1. 样品匀浆/裂解
<ol>
	<li>冷冻组织样本
	<ol>
		<li>在干冰上，使用预冷的刀片和镊子将冷冻组织（约 30 mg）在玻璃载玻片上切碎。将切碎的组织转移至预冷的 5 mL 圆底聚苯乙烯管中，加入 700 µL 缓冲液 A（见表 1），在冰上孵育 30 分钟，避光。</li>
		<li>使用手持式组织匀浆器匀浆 30 秒，或直至组织完全均质化。将样品置于冰上，静置 10 分钟以使泡沫消退。 
		注意：将铝制烤盘放置于干冰上可提供稳定的操作平台，便于组织的初始处理和切碎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>或者，使用 100 mm 培养皿中的贴壁细胞培养物作为起始材料。
	<ol>
		<li>将细胞置于冰上，用含有 100 mM NEM 的 10 mL 冰冷 PBS 通过移液管冲洗细胞两次。</li>
		<li>加入 1 mL 冷的匀浆/裂解缓冲液，用坚硬的细胞刮刀剧烈刮取以裂解细胞。使用移液器将裂解液转移至 2 mL 离心管中。 
		注意：冲洗缓冲液和裂解缓冲液可根据不同规格的培养容器按比例调整。通常需要 200 万至 500 万个细胞；然而，具体数量取决于裂解效率和特定细胞类型的蛋白得率。若样品用于总巯基分析，匀浆缓冲液可不添加 NEM。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用移液器将所得匀浆液（步骤 1.1.2 或 1.2.2）转移至 2 mL 离心管中，在 4 °C 下以最大速度（≥16,000 × g）离心 10 分钟。</li>
	<li>使用移液器将上清液（约 700 µL 或细胞培养样品约 1 mL）转移至 5 mL 锥形微量离心管中，在 55 °C 下避光振荡（850 rpm）孵育 30 分钟。</li>
	<li>使用玻璃移液管向样品中加入 4 mL 冰冷丙酮，在 -20 °C 下过夜孵育，以沉淀蛋白质并去除过量的 N-乙基马来酰亚胺。</li>
</ol>
2. 树脂辅助捕获
<ol>
	<li>将沉淀的蛋白质沉淀物用丙酮洗涤两次：在 4 °C 下以 20,500 × g 离心 10 分钟，倾去丙酮，用微量移液器除去残留丙酮，再用玻璃刻度移液管加入 3 mL 新鲜的冰丙酮。反复倒置数次以混匀。第二次洗涤后，让沉淀物在空气中干燥 1–2 分钟，注意避免过度干燥，否则可能难以重悬。</li>
	<li>使用微量移液器加入 1 mL 缓冲液 B（见表 1），利用输出功率为 250 W 的水浴超声仪进行多次超声处理（每次 15–30 秒），并辅以短暂涡旋振荡，使蛋白质溶解。按照制造商说明书，采用双辛可宁酸（BCA）法测定蛋白质浓度。</li>
	<li>为在后续处理中统一各样品的蛋白质浓度，并确保完全去除 NEM，使用微量移液器将 500 µg 蛋白质转移至 0.5 mL 10 kDa 离心过滤器中，并用重悬缓冲液调整终体积至 500 µL。</li>
	<li>在室温下以 14,000 × g 离心，直至离心过滤器中液体体积少于 100 µL。将过滤器倒置放入收集管中，回收样品。再以 1,000 × g 离心 2 分钟，并用缓冲液 C（见表 1）调整终体积至 500 µL。</li>
	<li>使用微量移液器加入 20 µL 500 mM 二硫苏糖醇（DTT），使终浓度达到 20 mM，于 37 °C 振荡孵育 30 分钟（振荡速度为 850 rpm），以还原蛋白质中的巯基。</li>
	<li>还原完成后，使用微量移液器将样品转移至 0.5 mL 10 kDa 离心过滤器中，在室温下以 14,000 × g 离心 15 分钟，或直至过滤器中液体体积少于 100 µL。加入缓冲液 D（见表 1）使过滤器中液体体积补足至 500 µL。
	<ol>
		<li>重复步骤 2.6 的离心及补液至 500 µL 操作共三次；第四次离心后，将过滤器倒置放入收集管中，以 1,000 × g 离心 2 分钟，收集样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照制造商说明书，使用 BCA 法测定蛋白质浓度。</li>
	<li>在进行缓冲液置换的同时，准备巯基亲和树脂：使用微量天平称取适量树脂（30 mg/样品），转移至 50 mL 离心管中。然后用刻度移液管加入纯水，使树脂终浓度为 30 mg/mL，在室温下振荡孵育 1 小时，以充分水合树脂。 
	注：上述提到的巯基亲和树脂已由制造商停产。目前市场上有可替代产品，但其结合容量约为原产品的五分之一（见补充信息）。或者，也可使用 2-(吡啶二硫代)乙胺盐酸盐与 N-羟基琥珀酰亚胺活化树脂自行合成该巯基亲和树脂（见补充信息）。
	<ol>
		<li>树脂水合完成后，将离心柱置于真空装置上，使用微量移液器将 500 µL 树脂悬液转移至每个离心柱中，抽真空除去水分；重复此步骤一次，使每根离心柱中树脂总量达到 30 mg。或者，在此步骤及后续所有树脂洗涤与洗脱步骤中，可用 1,000 × g 离心 2 分钟代替真空装置。 
		注：将 1000 µL 移液器吸头末端剪去一部分以增大孔径，有助于树脂转移。在移液过程中应反复吹打，确保树脂保持均匀悬浮状态，并等量转移至各离心柱中。</li>
		<li>使用微量移液器加入 500 µL 超纯水洗涤树脂，抽真空除去水分；重复此步骤 5 次。随后用 500 µL 缓冲液 E（见表 1）洗涤树脂 5 次。 
		注：后续所有洗涤步骤中，也可用 1,000 × g 离心 2 分钟代替真空装置。所有后续洗涤步骤均使用 500 µL 体积。向离心柱中加入洗涤缓冲液时，应小心施加足够力度以充分重悬树脂，同时避免溅出或损失树脂；这有助于实现树脂的彻底且高效洗涤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用微量移液器将每个还原样品中的 150 µg 蛋白质转移至新离心管中，并用缓冲液 C（见表 1）调整终体积至 120 µL。再用微量移液器将蛋白质溶液转移至含有树脂的封闭式离心柱中，盖上盖子，在室温下以 850 rpm 振荡孵育 2 小时。</li>
	<li>按照步骤 2.8.2 所述方法，依次用 25 mM HEPES（pH 7.0）、8 M 尿素洗涤树脂 5 次，再用 2 M NaCl 洗涤 5 次，接着用含 0.1% 三氟乙酸（TFA）的 80% 乙腈（ACN）洗涤 5 次，最后用 25 mM HEPES（pH 7.7）洗涤 5 次，并更换柱塞。 
	注：此时可按步骤 4.1 所述方法洗脱样品，用于蛋白质水平的分析（如 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质印迹等）。</li>
</ol>
3. 树脂上胰蛋白酶消化及TMT标记
<ol>
	<li>通过将测序级修饰胰蛋白酶溶解于缓冲液C中（见表1），配制成0.5 µg/µL的溶液，为每个样品准备6–8 µg所需的足量胰蛋白酶溶液，确保最终总体积可满足每份样品至少120 µL。使用微量移液器向各样品中加入120 µL该胰蛋白酶溶液，并在37 °C、850 rpm振荡条件下孵育过夜。 
	注意：为提高消化效率，可在次日额外进行一步消化，即移除原有胰蛋白酶溶液并更换为新鲜溶液，继续消化2小时。</li>
	<li>用25 mM HEPES（pH 7.0）洗涤树脂5次；随后用2 M NaCl洗涤5次；再用含0.1% TFA的80%乙腈（ACN）洗涤5次；最后用25 mM HEPES（pH 7.7）洗涤3次。最终用50 mM三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB）洗涤树脂2次，并更换塞子。</li>
	<li>准备TMT标记试剂时，首先将试剂瓶置于室温回温，然后短暂离心（16,000 × g）。使用微量移液器向每瓶TMT标记试剂中加入150 µL无水乙腈（ACN）。将试剂瓶置于恒温混匀仪中，设置转速为850 rpm，在室温下孵育5分钟，以充分溶解试剂。短暂涡旋振荡后，以16,000 × g离心收集试剂。</li>
	<li>使用微量移液器向已洗涤的树脂中加入40 µL 100 mM TEAB，随后加入70 µL已溶解的TMT试剂，在室温、850 rpm振荡条件下孵育1小时。剩余未使用的TMT试剂应储存于-80 °C。 
	注意：请记录分配给每个生物学样品的特定TMT标签（图1）。</li>
	<li>按前述方法，用含0.1% TFA的80%乙腈洗涤树脂5次，再用100 mM碳酸氢铵缓冲液（ABC，pH 8.0）洗涤3次，最后用水洗涤2次，并更换塞子。</li>
</ol>
4. 肽段洗脱
<ol>
	<li>使用移液器向每根色谱柱中加入 100 µL 含 20 mM DTT 的 100 mM ABC 缓冲液（pH 8.0），在设定为 850 rpm 的恒温混匀仪中室温孵育 30 分钟，以洗脱标记的肽段。 
	注意：加入 DTT 后，树脂会结块。可用移液器枪头搅动以打散结块，确保肽段完全洗脱。</li>
	<li>孵育结束后，将色谱柱置于用于固相萃取（SPE）的真空装置上，施加真空，使样品洗脱至 5 mL 微量离心管中。重复此步骤一次。</li>
	<li>最后，加入 100 µL 含 0.1% TFA 的 80% ACN，室温孵育 10 分钟，洗脱至同一 5 mL 离心管中。将所有洗脱组分收集至同一个 5 mL 微量离心管中。 
	注意：为防止样品损失，洗脱过程必须使用低吸附管，且单个 5 mL 管中的液体体积必须保持在 4.0 mL 及以下&#160;。</li>
	<li>将洗脱后的样品置于真空浓缩仪中干燥。干燥后的肽段可于 -80 °C 保存，并在后续实验中重新溶解。 
	&#8203;注意：样品也可分别洗脱，取部分等分试样通过 SDS-PAGE 进行分析，以在肽段水平上进行检测，之后再合并样品。</li>
</ol>
5. 肽段烷基化及脱盐/纯化
<ol>
	<li>使用微量移液器加入少量 100 mM ABC 缓冲液（pH 8.0），重悬干燥的肽段（体积不超过 500 µL）。使用输出功率为 250 W 的水浴超声仪，每次超声处理 15–30 秒，重复进行，并涡旋振荡以促进溶解，随后转移至 2 mL 离心管中。 
	注意：加入的 100 mM ABC 缓冲液（pH 8.0）体积应根据将 DTT 溶解至 150 mM 摩尔浓度所需的体积来确定。用户需根据步骤 4.1 中最初添加的 DTT 量，计算样品中 DTT 的实际含量。</li>
	<li>使用微量移液器加入足够量的碘乙酰胺（IAA）浓储备液（600 mM，溶于 ABC 缓冲液），使 DTT 与 IAA 的摩尔比达到 1:4，随后在室温下以 850 rpm 振荡孵育 1 小时。</li>
	<li>使用微量移液器加入浓三氟乙酸（TFA，10%），将样品酸化至 pH &#60; 3，并按照制造商说明书，采用反相纯化方法进行样品脱盐处理。</li>
	<li>将纯化后的肽段置于真空浓缩仪中干燥。干燥后的肽段保存于 -80 °C，待后续分析使用。</li>
</ol>
6. 液相色谱-串联质谱法
<ol>
	<li>使用输出功率为250 W的水浴超声仪，将干燥的肽段在含有3%乙腈（ACN）的20–40 µL水中进行多次超声处理，每次15–30秒，并辅以涡旋振荡使其充分重悬。按照制造商的说明书进行BCA法测定肽段浓度。</li>
	<li>采用反相液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对样品进行分离分析，方法如前所述6，记录质荷比（m/z）范围为400–2000的MS1谱图。应采用高能碰撞解离（HCD）模式，以获得同量异位素标记肽段分析所需的报告离子强度信息。有关仪器运行条件的更多细节，请参见先前研究报告的方法部分27,30，以及质谱数据的分析方法27,31。 
	注意：可使用不同的LC-MS/MS系统或设置来分析肽段样品。肽段鉴定的覆盖度和灵敏度将取决于所使用的具体系统和参数设置。</li>
</ol>

<ol><li>Sies, H., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+%28ROS%29+as+pleiotropic+physiological+signalling+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).</li>
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作者声明不存在任何经济或其他方面的利益冲突。

树脂辅助捕获技术已广泛应用于多种样本类型和生物系统，用于研究半胱氨酸残基的氧化修饰25,29,30。该方法可在多个层面和检测方式下对样本进行评估，包括利用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析检测蛋白质和多肽，以及利用质谱技术检测单个半胱氨酸位点。无论样本类型或最终检测终点如何，该方法最终均可实现对含半胱氨酸的蛋白质和多肽的高度高效且特异性的富集38。通过使用RAC技术，我们已在不同模型系统中检测到扰动后多达数千个半胱氨酸位点的氧化状态变化。
在经历疲劳性肌肉收缩的小鼠中，2,200 S-谷胱甘肽化位点被鉴定出来，其中超过一半的位点谷胱甘肽化水平发生显著改变 S-谷胱甘肽化32RAC 也已用于分析可逆性硫醇氧化的特征 &#62;蓝细菌在暴露于光合作用抑制剂或不同光照条件后出...

在稳态条件下，细胞会产生活性氧、活性氮和活性硫物质，这些物质有助于促进代谢和信号传导等过程1,2,3，该现象存在于原核生物和真核生物中。这些活性物质的生理水平对于细胞正常功能至关重要，也被称为“良性应激”（eustress）1,4。相反，氧化剂增加导致氧化剂与抗氧化剂之间失衡时，可引发氧化应激，即“不良应激”（distress）1，从而造成细胞损伤。氧化剂通过修饰多种生物分子（包括蛋白质、DNA、RNA和脂质）将信号传递至生物学通路。其中，蛋白质中的半胱氨酸残基因其含有对多种氧化剂具有高反应活性的巯基，成为易受氧化的关键位点5。这导致半胱氨酸发生多种可逆的基于氧化还原的翻译后修饰（PTMs），包括亚硝基化（SNO）、谷胱甘肽化（SSG）、次磺酰化（SOH）、过硫化（SSH）、多硫化（SSnH）、酰化以及二硫键形成。而半胱氨酸的不可逆氧化形式则包括亚磺酰化（SO2H）和磺酰化（SO3H）。
半胱氨酸残基的可逆氧化修饰可能起到保护作用，防止进一步发生不可逆氧化，或作为信号分子参与下游细胞通路的调控6,7某些硫醇氧化还原型翻译后修饰的可逆性使得半胱氨酸位点能够发挥 &#34;氧化还原开关&#34;8,9，其中这些位点氧化还原状态的变化会改变蛋白质功能，从而调控其在瞬时过程中的作用。氧化还原翻译后修饰的调节作用10 在蛋白质功能的许多方面都已观察到11，包括催化作用12蛋白质-蛋白质相互作用13构象变化14金属离子配位15或药理学抑制剂结合16此外，氧化还原型翻译后修饰参与调控转录等通路的蛋白质半胱氨酸位点17，翻译18，或代谢19鉴于氧化还原翻译后修饰对蛋白质功能和生物过程具有重要影响，定量分析在氧化还原状态发生扰动时半胱氨酸位点所经历的氧化程度显得尤为重要。
对氧化还原状态发生改变的半胱氨酸位点的鉴定，主要集中于在正常与扰动条件下，对位点特异性水平上的氧化状态进行比较。通常利用倍数变化（fold change）测量来确定哪些位点发生了显著改变，这有助于研究人员判断哪些半胱氨酸位点可能在生理学上对研究具有重要意义。另一种方法是，对特定样本类型中可逆硫醇氧化的化学计量比进行测量，从而总体反映细胞氧化状态下的生理状况，这一重要测量指标常常被忽视且使用不足。修饰化学计量比的计算基于修饰型硫醇占总蛋白硫醇（包括修饰与未修饰硫醇）的百分比20,21。因此，相较于倍数变化，化学计量比测量提供了更为精确的定量结果，尤其是在使用质谱技术时。通过化学计量比来确定特定半胱氨酸位点的翻译后修饰（PTM）占据率，可以更清晰地评估氧化程度增加的生物学意义。例如，硫醇氧化水平增加3倍，可能源于修饰占据率从1%上升至3%，也可能由30%上升至90%。对于一个基础占据率仅为1%的位点，其氧化水平增加3倍可能对蛋白功能影响甚微；然而，若某位点在静息状态下的占据率已达30%，则其氧化水平增加3倍可能对蛋白功能产生更显著的影响。当化学计量比测量在总氧化硫醇与特定氧化修饰类型（如蛋白质谷胱甘肽化（SSG）和亚硝基化（SNO））之间进行时，可揭示不同修饰类型之间的比例关系及定量信息。
由于可逆性巯基氧化通常是一种丰度较低的翻译后修饰，因此已开发出多种方法用于从生物样品中富集含有此类修饰的蛋白质。Jaffrey 等人早期提出的一种方法称为生物素转换技术（biotin switch technique, BST）22，该方法包含多个步骤：首先通过烷基化封闭未修饰的巯基，然后将可逆修饰的巯基还原为新生的游离巯基，接着用生物素标记这些新生的游离巯基，最后通过链霉亲和素亲和沉淀富集标记的蛋白质。该技术已在多项研究中用于分析 SNO 和 SSG，并可进一步改造以检测其他形式的可逆性巯基氧化23,24。尽管 BST 已被用于探索多种可逆性巯基氧化形式，但该方法存在一个问题是：非特异性结合可能导致未生物素化的蛋白质与链霉亲和素结合，从而影响富集效果。我们&#160;实验室开发了一种替代方法，称为树脂辅助捕获法（resin-assisted capture, RAC）25,26（图1），该方法避免了通过生物素-链霉亲和素系统进行巯基富集所带来的问题。
在还原可逆氧化的巯基后，含有新生游离巯基的蛋白质可通过巯基亲和&#160;树脂进行富集，该树脂可共价捕获游离巯基，从而实现比生物素开关法（BST）更特异地富集含半胱氨酸的蛋白质。将RAC方法与近年来在等压标记和质谱技术方面的多重检测能力相结合，可建立一种稳健且灵敏的流程，用于在全蛋白质组水平上对可逆氧化的半胱氨酸残基进行富集、鉴定和定量。质谱技术的最新进展使得巯基氧化还原蛋白质组的分析深度显著增加，加深了人们对蛋白质巯基氧化因果关系的理解27。从位点特异性定量数据中获得的信息有助于进一步研究可逆氧化修饰的机制性影响及其下游效应28。利用该流程已揭示可逆半胱氨酸氧化在正常生理过程（如衰老）中的生理影响，其中S-谷胱甘肽化（SSG）水平随年龄发生变化。使用新型肽类药物SS-31（elamipretide）可在一定程度上逆转衰老引起的SSG变化，该药物可增强线粒体功能并降低老龄小鼠的SSG水平，使其SSG谱更接近于年轻小鼠29。
在小鼠巨噬细胞模型中，已证明与纳米颗粒暴露相关的病理生理状况涉及SSG。作者采用RAC联合质谱技术，表明SSG水平与氧化应激程度及巨噬细胞吞噬功能损伤程度呈直接相关性。数据还揭示了不同人工纳米材料因诱导不同程度的氧化应激，导致通路特异性的响应差异30。该方法在原核生物中也显示出其应用价值，曾被用于研究昼夜节律对光合蓝细菌中硫醇氧化的影响。研究观察到多个关键生物学过程中的硫醇氧化发生广泛变化，包括电子传递、碳固定和糖酵解。此外，通过正交验证，多个关键功能位点被证实发生氧化修饰，提示这些氧化修饰可能具有调控作用6。
本文详细描述了一种标准化的工作流程（图1），展示了RAC方法在富集蛋白质中全部氧化型半胱氨酸巯基、并对其进行后续标记与化学计量学定量方面的应用价值。该工作流程已应用于多种样本类型的氧化还原状态研究，包括细胞培养物27,30以及完整组织（如骨骼肌、心脏、肺）29,31,32,33。尽管本文未予涵盖，RAC方案亦可便捷地调整用于研究特定类型的可逆性氧化还原修饰形式，包括谷胱甘肽化（SSG）、亚硝基化（SNO）和S-酰化（S-acylation），如前所述25,29,34。

<table><tbody><tr><td>2-(吡啶二硫)乙胺盐酸盐</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-101794</td><td>用于实验室自制树脂的试剂</td></tr><tr><td>2.0 mL LoBind 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>5.0 mL LoBind 离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>5.0 mL 圆底管</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A949-1</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>活化硫醇&amp;ndash;Sepharose&amp;nbsp;4B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8512</td><td>硫醇亲和树脂的潜在替代品</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 离心过滤器</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC5010BK</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>双辛可宁酸（BCA）</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>蛋白质检测试剂</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Thermo Scientific</td><td>20291</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>匀浆器</td><td>BioSpec Products</td><td>985370</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>N-乙基马来酰亚胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4259</td><td></td></tr><tr><td>NHS-活化 Sepharose 4 Fast Flow</td><td>Cytiva</td><td>17-0906-01</td><td>用于实验室自制树脂的试剂</td></tr><tr><td>QIAvac 24 Plus 真空抽滤装置</td><td>Qiagen</td><td>19413</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6026</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Branson</td><td>1510R-MT</td><td></td></tr><tr><td>离心柱</td><td>Thermo Scientific</td><td>69705</td><td></td></tr><tr><td>Strata C18-E 反相柱</td><td>Phenomenex</td><td>8B-S001-DAK</td><td>肽段脱盐</td></tr><tr><td>恒温混匀仪</td><td>Eppendorf</td><td>5355</td><td></td></tr><tr><td>硫丙基 Sepharose 6B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0420-01</td><td>硫醇亲和树脂；*该树脂的生产已被制造商停止（详见实验方案说明）。</td></tr><tr><td>TMT 同重同位素标签（16-plex）</td><td>Thermo Scientific</td><td>A44522</td><td>肽段标记试剂；有多种规格可选</td></tr><tr><td>三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Promega</td><td>V5820</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus 真空浓缩仪</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>真空浓缩装置</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr></tbody></table>

树脂辅助捕获联合等重串联质谱标签标记用于多重定量蛋白质硫醇氧化

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

蛋白质硫醇的可逆氧化修饰最近被发现是调控细胞功能的重要介质。本文详细描述了一种定量氧化还原蛋白质组学方法，该方法结合树脂辅助捕获（RAC）、串联质谱标签（TMT）等压标记以及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），可在蛋白质组水平上实现对氧化蛋白质硫醇的多重化学计量定量。针对氧化半胱氨酸残基的位点特异性定量信息，为进一步理解此类修饰的功能影响提供了重要线索。
该实验流程适用于多种样本类型，包括培养细胞（如哺乳动物细胞、原核细胞）和完整组织（如心脏、肺、肌肉）。样本首先经过裂解或匀浆处理，并对游离巯基进行烷基化修饰，以防止发生人工氧化。随后，被氧化的蛋白质巯基被还原，并通过巯基亲和树脂进行富集捕获。该树脂可简化后续操作流程，使得消化、标记和洗涤步骤无需额外转移蛋白质或多肽即可完成。最后，洗脱标记后的肽段并采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析，从而全面揭示整个蛋白质组中与巯基氧化相关的化学计量变化。该方法显著提升了对生理及病理生理状态下蛋白质巯基氧化介导的氧化还原依赖性调控作用的理解。

完成该方案将实现对 formerly oxidized 含半胱氨酸肽段的高度特异性富集，通常具有 &gt;95% 特异性27,35,36然而，该方案的若干关键步骤需要特别注意，例如在样品裂解/匀浆前对游离巯基进行初始封闭，以防止巯基发生人为氧化及非特异性富集人为氧化的巯基25样品可在实验方案的多个阶段通过不同方法进行分析，包括对蛋白质和多肽进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE可用于样品的定性分析，其中总巯基样品可实现样本间的比率比较，以确定因处理或刺激导致的氧化水平差异。图2A）。为了进一步研究单个蛋白质的氧化水平，可将SDS-PAGE凝胶进行蛋白质印迹分析36 (图2B）。这使得能够对模型系统进行更详细的分析，生成支持性数据，并进一...

蛋白质巯基氧化在正常生理和病理生理条件下具有重要意义。本文详细描述了一种定量氧化还原蛋白质组学方法，该方法利用树脂辅助捕获、等重标记和质谱技术，能够实现对蛋白质中可逆氧化半胱氨酸残基的位点特异性鉴定与定量分析。

蛋白质巯基上的可逆氧化修饰最近被发现是调控细胞功能的重要介质。本文详细描述了……

本方案描述了一种可实现蛋白质中氧化型胱氨酸残基位点特异性鉴定的方法。该方法能够从多种样品类型中获得氧化型胱氨酸残基的定量且位点特异性的数据。开始辅助捕获步骤时，将沉淀的蛋白质沉淀物用丙酮洗涤两次，每次在4°C条件下以20,500 ×g离心10分钟。然后倾去丙酮，并用微量移液器除去残留的丙酮。使用玻璃刻度移液器向管中加入3 mL新鲜的预冷丙酮，通过反复倒置管数次充分混匀。第二次洗涤后，让沉淀在空气中干燥1至2分钟，注意不要过度干燥。向干燥的蛋白质沉淀中加入1毫升缓冲液B。为溶解蛋白质，将沉淀置于输出功率为250瓦的水浴超声仪中，每次超声15至30秒，并辅以短暂涡旋振荡，重复进行。采用二辛可宁酸（Bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白质浓度。为标准化蛋白浓度，将500微克蛋白样品转移至0.5毫升、10千道尔顿的离心过滤装置中，并用重悬缓冲液定容至500微升。在室温下以14,000 ×g离心蛋白缓冲液混合物，直至离心过滤装置中的体积小于100微升。通过将滤膜装置倒置插入收集管中来收集样品。将样品在1000 G条件下离心2分钟，并加入缓冲液C，使最终体积达到500微升。为还原蛋白质中的巯基，向样品中加入20微升500毫摩尔的二硫苏糖醇（DTT），使终浓度为20毫摩尔，并在37摄氏度、850 RPM振荡条件下孵育30分钟。还原完成后，将样品转移至0.5毫升10千道尔顿的离心过滤管中，在室温下以14,000 G离心，直至离心过滤管中的体积小于100微升。加入缓冲液D，使总体积达到500微升，并重复离心。第四次离心后，将滤膜倒置放入收集管中，在1000 ×g条件下离心2分钟以收集样品。然后使用BCA法测定蛋白质浓度。接下来，将离心柱置于真空装置上，使用微量移液器将500 µL新配制的巯基亲和树脂悬液转移至每个柱中。施加真空以去除水分。重复该步骤一次，使每根柱中获得30 mg树脂。用500微升超纯水洗涤树脂5次，每次通过抽真空去除水分，随后再用500微升缓冲液E洗涤5次。在新离心管中，加入缓冲液C至150微克还原后的蛋白质样品中，使终体积达到120微升。将蛋白质溶液转移至含有树脂的封闭式离心柱中。盖上柱子的盖子，在室温下以850 rpm振荡孵育2小时。按照文中的描述洗涤树脂。更换塞子。进行树脂上胰蛋白酶消化时，向样品中加入120微升新鲜配制的胰蛋白酶溶液，在37摄氏度下以850转/分钟振荡孵育过夜。第二天，按照文中的描述多次洗涤树脂并更换塞子。使用微量移液器，向洗涤后的树脂中加入40微升100毫摩尔的三乙基铵碳酸氢盐缓冲液。然后加入70微升溶解的串联质谱标签（TMT）标记试剂，在室温下以850转/分钟振荡孵育1小时。将剩余的TMT试剂于-80摄氏度保存。洗涤树脂并更换塞子。通过向柱中加入100微升pH 8.0的100毫摩尔碳酸氢铵缓冲液（含20毫摩尔DTT），并在室温下以850 RPM在温控混合仪上孵育30分钟，洗脱TMT标记的肽段。孵育后，将柱子置于真空装置上，施加真空压力，使样品洗脱至一个5 mL的微量离心管中。重复该步骤一次，然后向柱子中加入100 µL含0.1%三氟乙酸的80%乙腈。室温孵育柱子10分钟后，将样品再次洗脱至同一个5 mL离心管中。将洗脱的样品置于真空浓缩仪中至干燥。随后将干燥的多肽在零下80摄氏度保存，直至进一步使用。对来自RAW 264.7细胞的多肽样品进行定性分析时采用SDS-PAGE，通过检测不同处理导致的氧化水平差异来比较样品。随后通过蛋白质印迹法检测分离的蛋白质，以进一步研究各蛋白质的氧化水平。含有半胱氨酸的肽段的报道离子强度通过液相色谱-串联质谱法进行分析。在单个半胱氨酸位点水平上，对iTRAQ标记的富集氧化肽段的巯基氧化化学计量比进行了定量。小心移除丙酮，避免扰动蛋白质沉淀。确保蛋白质沉淀完全溶解并精确定量，且准确分配树脂至离心柱中。在洗涤步骤中务必重新悬浮树脂。可通过SDS-PAGE和染色、蛋白质印迹以及质谱分析对富集的蛋白质和多肽进行进一步分析。

resin-assisted-capture-coupled-with-isobaric-tandem-mass-tag-labeling

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科研

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Biochemistry

生物化学

树脂辅助捕获与同量异位串联质量标签标记相结合，用于蛋白质硫醇氧化的多重定量

当细胞遇到应激条件时，活性氧水平会升高。本文以Pseudomonas...

使用同位素标记质谱法分析硫醇氧化还原蛋白质组

本文介绍了一种基于未标记与标记去污剂混合物的植物质膜分馏的稳健方法，可将质膜分离为去污剂抗性膜和去污剂可溶性膜 体内 完全 15N标记 拟南芥...

代谢标记与膜组分分离用于比较蛋白质组学分析 拟南芥 悬浮细胞培养

通过还原性二甲基化对肽段进行稳定同位素标记（ReDi 标记）是一种快速、经济的基于质谱的定量蛋白质组学准确分析策略。本文展示了一种利用 ReDi...

使用还原性二甲基化进行稳定同位素标记的定量蛋白质组学

前体同位素标记与等重标记联合技术（cPILOT）是一种定量蛋白质组学策略，可增强等重标签的样本多重检测能力。本方案描述了cPILOT在阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组织样本中的应用。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）增强组织样本的多重检测能力

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

本工作流程描述了同时对多种蛋白质翻译后修饰（PTM）进行高效、经济的时间和成本控制下的富集，以实现定量全局蛋白质组学分析。该方案采用多抗体偶联的肽段水平PTM富集方法，随后结合数据非依赖性采集质谱分析，以深入理解PTM之间的相互调控关系。...

同时富集两种翻译后修饰以实现定量与修饰位点定位

我们提出了一种优化的串联质量标签（TMT）标记实验方案，其中包含以下各个步骤的详细信息：蛋白质提取、定量、沉淀、消化、标记、提交至蛋白质组学平台以及数据分析。...

TMT 样本制备用于蛋白质组学平台送样及后续数据分析

前体同位素标记与等重标记联用技术（cPILOT）是一种增强的样本多重分析策略，能够利用现有的等重标签显著增加可同时分析的样本数量。结合机器人平台的应用，极大地提高了实验通量、重复性以及定量准确性。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）实现自动化样本多重分析

蛋白质的快速光化学氧化是一种新兴的蛋白质结构表征技术。不同的溶剂添加剂和配体具有各异的羟基自由基清除特性。为了比较不同条件下的蛋白质结构，需要对反应中产生的羟基自由基进行实时校正，以标准化反应条件。...

实现快速蛋白质光化学氧化中实时校正以确定蛋白质拓扑结构变化

本方案介绍了一种利用两种方法——基于标签和非标签定量——对组织样本进行优化的定量蛋白质组学分析。基于标签的方法在蛋白质定量方面具有更高的准确性优势，而非标签方法则更具成本效益，适用于对大规模队列中的数百个样本进行分析。...

基于质谱的组织样本鸟枪法蛋白质组学综合工作流程

学习树脂辅助捕获与同量异位串联质量标签标记相结合的方法，用于蛋白质硫醇氧化的多重定量分析。该技术可位点特异性地鉴定氧化半胱氨酸残基，为氧化还原生物学研究提供可靠的定量数据。

树脂辅助捕获联合等重串联质谱标签标记用于多重定量蛋白质硫醇氧化

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