基于毛细管电泳的氢/氘交换结合自上而下质谱法用于蛋白质构象表征

该方法能够在一次CEMS测量中实现共存蛋白质种类（包括不同构象体或变体）的分离，并在线表征其高级结构差异。该方法利用电泳效应，在HDX反应过程中提供接近100%持续时间的氘代环境，并在质谱自上而下分析前，对共存的蛋白质种类进行正交分离。首先对毛细管电泳-氢氘交换（CE-HDX）系统进行预平衡处理。

在室温下，使用含有50%甲醇、49%水和1%甲酸的混合溶液进行超声处理，清洗流动式微管CE-MS接口至少30分钟。将HPC修饰的毛细管安装至毛细管电泳（CE）仪器上。利用自动进样器用背景电解质溶液（BGE）冲洗毛细管10分钟，并使其充满BGE溶液。

使用适当长度的未修饰熔融石英毛细管作为修饰剂溶液的输注管路。使用接头和合适的套管将修饰剂管路连接至带有钝头针头的气密玻璃注射器，并使用输注泵用修饰剂溶液冲洗管路至少10分钟。将装有相应溶液的HPC编码CE毛细管和修饰剂管路的出口插入已清洁的CE-MS接口中。

推进装有输注泵的注射器，使修饰液到达接口尖端。将组装好的毛细管电泳-质谱（CE-MS）接口安装至质谱仪的纳米电喷雾电离源腔体内。在CE-MS接口上施加3-5千伏的喷雾电压。

使用输注泵以0.1–10微升/分钟的流速将修饰剂溶液注入，并确保CE-MS接口尖端产生稳定的电喷雾。将含有背景电解质（BGE）的样品瓶放入自动进样器中，用于后续获取空白电泳图和空白质谱图。根据进样体积与进样参数之间的关系，估算进样体积。

使用自动进样器在2 PSI的压力下注入样品溶液，持续适当时间。在0-2 PSI的进样压力范围内施加20千伏的电泳电压，启动毛细管电泳分离，并采集电泳图。同时，在色谱模式下采集质谱数据，其中离子流图作为时间的函数被采集，相应的质谱扫描不会自动合并为单个谱图。

将空白电泳图谱和质谱图保存为参考。将含有目标浓度蛋白质样品溶液的样品瓶放入自动进样器中，获取电泳分离后且氘标记的蛋白质组分的电泳图谱和MS1质谱图。对目标组分进行串联质谱（MS/MS）检测，可在同一次运行中获取MS1谱图后立即进行，或在后续单独的运行中完成。

每次测量后，以20 PSI的压力用BGE冲洗毛细管至少10分钟。实验结束后，清洁CEMS接口及所有管路以备储存。采用质谱直接进样模式采集HDX终点样品的数据集。

较低的进样压力可实现更好的毛细管电泳峰分离效果，但会导致迁移时间及实验总时长增加。较长的氢氘交换（HDX）反应时间会导致蛋白质分析物的去氢程度更高。β免疫球蛋白（beta immunoglobulin）或β IG的A和B变异体，其序列仅相差两个氨基酸残基，在提取离子色谱图（EIC）衍生的电泳图中呈现出两个分离良好的峰。

氘标记的差异导致离子呈现出明显的质荷比分布差异。由于β-IG中独特的脱硫键结构限制了CS 82与CS 176之间的片段化效率，观察到Z离子的相对丰度低于C离子。来自β-IGA和β-IGB的大多数碎片离子表现出相似程度的氘摄取。

然而，覆盖β IGA序列变异位点的较大片段的脱氨程度显著高于β IGB。根据样品的等电点调整BGE的pH值，以防止蛋白质聚集并促进分离，同时维持复合物的稳定性。