Name: 聚酐IL-1α纳米颗粒 体内抗肿瘤 活性评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 了解利用聚酐IL-1α纳米颗粒在同基因小鼠头颈鳞状细胞癌模型中评估抗肿瘤活性与毒性的标准化实验方案，为癌症免疫治疗研究提供可靠方法。

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本工作部分得到了美国退伍军人事务部生物医学实验室研究与发展服务局的优异奖评审资助（资助号：I01BX004829），以及通过爱荷华大学霍尔登综合癌症中心的梅济尔奖计划的资助。

本研究中使用的所有体内操作均经爱荷华大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. 头颈部鳞状细胞癌细胞系的制备与维持
注意：本研究将使用经HPV E6和E7与hRas及荧光素酶（mEERL）稳定转化的小鼠口咽上皮细胞系。该细胞系源自C57BL/6J小鼠品系，由美国南达科他州南达科他大学桑福德医学院外科系Paola D. Vermeer博士惠赠。
<ol>
	<li>在预热（37 °C）的水浴中解冻一管冷冻保存的 mEERL 细胞，然后转移至含有温热培养基（DMEM 培养基 [Dulbecco 改良 Eagle 培养基]，添加 40.5% 1:1 DMEM/Hams F12、10% 胎牛血清 [FBS]、0.1% 庆大霉素、0.005% 氢化可的松、0.05% 转铁蛋白、0.05% 胰岛素、0.0014% 三碘甲腺原氨酸和 0.005% 表皮生长因子）的 15 mL 圆底离心管中。</li>
	<li>在 25 °C 下以 277 × g 离心 5 分钟，去除培养基。然后用 3–5 mL 新鲜培养基重悬细胞沉淀，并转移至 T-25 细胞培养瓶中。为获得最佳复苏效果，应以高密度接种细胞。 
	注：选用 T-25 培养瓶是因为其尺寸较小，当细胞彼此靠近时，相比 T-75 培养瓶可实现更快的复苏速度。</li>
	<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中培养，扩增至更大的培养瓶（如 T-75 或 T-150），每 3 天传代一次。当细胞数量足够用于所有小鼠的移植时，取出培养瓶，弃去培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗细胞。然后加入 4 mL（若使用 T150 培养瓶）0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在 37 °C 下孵育 2 分钟。根据所用培养皿/瓶的大小，相应调整胰蛋白酶用量。 
	注：细胞系类型和融合度可能影响消化时间。过长的胰蛋白酶消化时间会损伤细胞，导致存活率降低。应使用完成消化所需的最短时间。</li>
	<li>在显微镜下观察，经胰蛋白酶处理后脱落的细胞可自由移动。若仍有部分细胞附着，可非常轻柔地敲击培养瓶以松动剩余贴壁细胞。加入新鲜培养基（根据需要调整体积）以终止胰蛋白酶反应，并将细胞悬液收集至 50 mL 圆底离心管中。在 25 °C 下以 277 × g 离心 5 分钟，去除培养基。</li>
	<li>用新鲜培养基重悬细胞并进行计数。再次按上述条件离心后，向细胞中加入冷 PBS，调整细胞浓度至 10 × 106 个细胞/mL。注射前将细胞悬液置于冰上保存。</li>
</ol>
2. 肿瘤植入、药物处理与测量
注意：实验动物饲养于爱荷华大学动物护理设施中，并遵循适当的无菌操作规程进行处理。
<ol>
	<li>使用氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物麻醉C57Bl/6J小鼠。用电剃刀小心剃除侧腹部或所需注射部位的毛发。 
	注意：请务必根据机构（或其他）规定记录管制药品的使用情况。</li>
	<li>用乙醇棉片消毒侧腹部，使用25–28 G注射器将100 µL细胞悬液（含1 × 106个细胞）缓慢皮下注射。注射前应麻醉小鼠，以防止突然移动导致细胞流失。每次注射前，轻轻混匀细胞悬液，防止细胞沉降至小瓶或锥形管底部。</li>
	<li>将细胞悬液吸入注射器后，彻底排除顶部的气泡和死腔。以缓慢而稳定的方式注射细胞悬液。切勿在多只小鼠间重复使用同一根针头。始终额外准备部分细胞悬液，以应对意外损失。</li>
	<li>将动物放回各自笼中，并持续监测直至其从麻醉中恢复。麻醉期间，动物存在低体温风险；因此需提供辅助热源，或将小鼠彼此靠近放置以保持体温（若同笼饲养）。</li>
	<li>当肿瘤在任一方向达到3 mm时，根据肿瘤大小和/或体重将小鼠随机分入治疗组，随后开始药物治疗。在第4天和第9天，通过腹腔注射（i.p.）给予含有3.75 µg rIL-1α/只小鼠的NPs15。每日或隔日测量并记录肿瘤体积（(长度 × 宽度2) / 2）及小鼠体重，直至肿瘤大小或小鼠状况达到安乐死标准。 
	&#8203;注意：即使由经验丰富的研究人员操作，也难以在所有小鼠中植入大小完全相同的肿瘤。应根据肿瘤大小和小鼠体重将动物随机分配至实验组。</li>
</ol>
3. 血液采集与血清分离
注意：从下颌静脉采血是一种简单有效的技术，可用于从清醒动物或麻醉动物中采集血液。在本研究中，血液采集是在动物处于麻醉状态下进行的。
<ol>
	<li>按照上述方法，通过注射酮胺/赛拉嗪混合物使小鼠麻醉。</li>
	<li>用非优势手抓住肩部上方的松弛皮肤，使用18 G针头或采血针在下颌静脉处穿刺，位置略位于下颌骨后方（该区域可见一个白点）。</li>
	<li>穿刺静脉以确保血液立即流出。将200–300 µL血液（根据小鼠体重而定）收集至1.5 mL聚丙烯微量离心管或血清分离管中。采血后，对穿刺部位施加轻柔压力，直至出血停止。将小鼠放回各自笼中，并观察至其从麻醉中恢复。 
	注意：单次采血或24小时内累计采血量不得超过小鼠体重的1%。</li>
	<li>将采集的血液在室温下静置20–30分钟使其凝固。随后将管子置于冰上，待离心前保持低温。</li>
	<li>在4 °C条件下，以1540 × g 离心15分钟，使凝固的血液分离。</li>
	<li>小心吸取上层液体（血清），避免扰动下层红细胞。收集后储存于-80 °C，直至使用。</li>
</ol>
4. 收集血清的多重检测
<ol>
	<li>将血清或血浆样本在冰上解冻。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 1540 × g 离心 5 分钟，以沉淀细胞碎片，并小心吸取上层血清层。</li>
	<li>将多重检测试剂盒置于室温下平衡。 
	注意：市面上有多种针对特定细胞因子、趋化因子或生长因子的商用多重检测试剂盒。此外，也可根据目标蛋白定制试剂盒。</li>
	<li>按照生产商提供的说明书进行操作，以检测细胞因子。 
	&#8203;注意：大多数多重检测试剂盒使用磁珠结合捕获抗体，因此洗涤过程中必须使用自动或手持式磁力洗涤仪。否则，磁珠会从孔板中被洗脱，导致检测信号事件数量不足，无法进行读数。</li>
</ol>
5. 肿瘤和腹股沟淋巴结的采集及单细胞悬液的制备
<ol>
	<li>使用氯胺酮/赛拉嗪混合物对小鼠进行麻醉。为确保完全镇静，可通过足底反射（用力捏脚趾）进行检测。若小鼠无反应，则采用颈椎脱位法处死小鼠。</li>
	<li>将每只小鼠仰卧放置，并在其腹部皮肤喷洒70%乙醇。使用镊子和剪刀从小鼠左侧切除肿瘤，从右侧切除淋巴结。若肿瘤较大，可将其切成小块，并取500–600 mg组织。对于淋巴结，应完整采集整个器官。 
	注意：腹股沟区域两侧各有一个淋巴结。根据实验目的，淋巴结和肿瘤可从同侧分离。然而，若肿瘤体积过大，则难以从同侧采集淋巴结。</li>
	<li>将组织置于相应的组织解离管中，每管加入3–5 mL RPMI培养基。使用自动组织解离仪对组织进行均质化处理。 
	注意：也可使用其他自动或手动均质器。</li>
	<li>均质化完成后，将细胞悬液通过70 µm滤膜转移至50 mL锥形管中。在25 °C条件下，以277 × g离心5分钟，以去除培养基。用1–2 mL冷PBS洗涤细胞并重悬。</li>
</ol>
6. 单细胞悬液的流式细胞术染色
<ol>
	<li>使用0.4%台盼蓝染色法在血细胞计数板中计数活细胞。计算获得200万至300万个细胞所需的体积，并将其转移至相应的FACS管中。</li>
	<li>使用活性染料对活细胞设门；否则，抗体可能与死细胞发生非特异性结合，导致假阳性结果。 
	注意：本实验中使用Zombie染料进行活/死细胞染色。市面上有多种可固定和不可固定的染料（如碘化丙啶）可供选择。</li>
	<li>将计数后的细胞离心（277 × g，25 °C下离心5分钟）。弃去上清液，用300 µL PBS重悬细胞。每管加入0.5–1 µL Zombie染料，在室温避光孵育20分钟。</li>
	<li>离心（277 × g，25 °C下离心5分钟），用1–2 mL FACS缓冲液洗涤细胞，然后重悬于200 µL FACS缓冲液中。</li>
	<li>加入Fc受体阻断剂（每200 µL中加入2 µL，或根据制造商说明书操作），孵育10分钟。</li>
	<li>离心（277 × g，25 °C下离心5分钟），用1–2 mL FACS缓冲液洗涤细胞。加入抗体混合液，在4 °C避光孵育30分钟。</li>
	<li>孵育结束后，离心（277 × g，25 °C下离心5分钟），用1–2 mL FACS缓冲液洗涤细胞。加入300–400 µL 2%多聚甲醛溶液并重悬以进行固定。此步骤后可将细胞在4 °C保存数天，或立即使用多色流式细胞仪进行分析。</li>
</ol>

<ol><li>Dinarello, C. A., Simon, A., vander Meer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+inflammation+by+blocking+interleukin-1+in+a+broad+spectrum+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Treating inflammation by blocking interleukin-1 in a broad spectrum of diseases.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (8), 633-652 (2012).</li>
<li>de Mooij, C. E. M., Netea, M. G., vander Velden, W., Blijlevens, N. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+interleukin-1+pathway+in+patients+with+hematological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Targeting the interleukin-1 pathway in patients with hematological disorders.</a> Blood. 129 (24), 3155-3164 (2017).</li>
<li>Veltri, S., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+1+trials+in+cancer+patients%3A+a+review+of+the+toxicity%2C+antitumor+and+hematopoietic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Interleukin 1 trials in cancer patients: a review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects.</a> Stem Cells. 14 (2), 164-176 (1996).</li>
<li>Grandis, J. R., Chang, M. J., Yu, W. D., Johnson, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+of+interleukin-1+alpha+and+cisplatin+in+a+murine+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Otolaryngology-+Head+%26+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity of interleukin-1 alpha and cisplatin in a murine model system.</a> Archives of Otolaryngology- Head & Neck Surgery. 121 (2), 197-200 (1995).</li>
<li>Curti, B. D., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+in+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 in the treatment of cancer.</a> Pharmacology & Therapeutics. 65 (3), 291-302 (1995).</li>
<li>Smith, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+treatment+with+interleukin-1+alpha+on+platelet+recovery+after+high-dose+carboplatin%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The effects of treatment with interleukin-1 alpha on platelet recovery after high-dose carboplatin.</a> New England Journal of Medicine. 328 (11), 756-761 (1993).</li>
<li>Senapati, S., Mahanta, A. K., Kumar, S., Maiti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+drug+delivery+vehicles+for+cancer+treatment+and+their+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">Controlled drug delivery vehicles for cancer treatment and their performance.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 3, 7(2018).</li>
<li>Carbone, A. L., Uhrich, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+synthesis+of+fast-degrading+Poly%28anhydride-esters%29%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Design and synthesis of fast-degrading Poly(anhydride-esters).</a> Macromolecular Rapid Communications. 30 (12), 1021(2009).</li>
<li>Gopferich, A., Tessmar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydride+degradation+and+erosion%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Polyanhydride degradation and erosion.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 911-931 (2002).</li>
<li>Jain, J. P., Chitkara, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydrides+as+localized+drug+delivery+carrier%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Polyanhydrides as localized drug delivery carrier: an update.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (8), 889-907 (2008).</li>
<li>Jain, J. P., Modi, S., Domb, A. J., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+polyanhydrides+as+localized+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release+%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Role of polyanhydrides as localized drug carriers.</a> Journal of Controlled Release : Official Journal of the Controlled Release Society. 103 (3), 541-563 (2005).</li>
<li>Kumar, N., Langer, R. S., Domb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydrides%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Polyanhydrides: an overview.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 54 (7), 889-910 (2002).</li>
<li>Goldman, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+human+cell+engraftment+in+mice+deficient+in+RAG2+and+the+common+cytokine+receptor+gamma+chain%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Enhanced human cell engraftment in mice deficient in RAG2 and the common cytokine receptor gamma chain.</a> British Journal of Haematology. 103 (2), 335-342 (1998).</li>
<li>Seth, A., Park, H. S., Hong, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspective+on+in+vivo+molecular+imaging+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Current perspective on in vivo molecular imaging of immune cells.</a> Molecules. 22 (6), (2017).</li>
<li>Espinosa-Cotton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+alpha+increases+antitumor+efficacy+of+cetuximab+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 alpha increases antitumor efficacy of cetuximab in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 7 (1), 79(2019).</li>
<li>Veltri, S., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+1+trials+in+cancer+patients%3A+A+review+of+the+toxicity%2C+antitumor+and+hematopoietic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Oncologist%22%5BJournal%5D)">Interleukin 1 trials in cancer patients: A review of the toxicity, antitumor and hematopoietic effects.</a> The Oncologist. 1 (4), 190-200 (1996).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案将使任何研究人员能够研究免疫调节药物的抗肿瘤活性及其部分潜在作用机制 体内 肿瘤小鼠模型系统。本研究采用同源性皮下肿瘤模型，相较于原位模型具有多项优势，包括技术操作简便、易于监测肿瘤生长、动物发病率较低以及可重复性较高。皮下肿瘤模型还可通过在左右侧 flank 区域分别注射肿瘤细胞，改造为双侧肿瘤模型。在此双侧肿瘤模型中，可对其中一侧肿瘤进行瘤内放射治疗或药物干预，并监测远端效应（abscopal response）。尽管头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的原位小鼠模型在临床相关性方面更优，但其建模技术难度较高，肿瘤生长难以监测，且口腔内肿瘤负荷常导致小鼠因无法进食和饮水而需提前实施安乐死。
细胞制备是确保所有小鼠形成对称且大小相似肿瘤的重要步骤。细胞制备不当会导致细胞活力下降，严重影响小鼠体内肿瘤的生成。建议使用低代次、处于80%–90%融合度的肿瘤细胞。过高的代次和融合度会影响细胞活力，从而影响肿瘤的形成。细胞应尽可能在制备后立即注射，因为细胞在PBS中存放超过20–30分钟会降低活力。如果需要对大量小鼠接种肿瘤，建议先将细胞保存在培养基中配制成储备液，再为...

癌症免疫治疗的一个新兴领域是利用炎性细胞因子激活患者免疫系统以对抗其肿瘤细胞。多种促炎性细胞因子（如干扰素-α（IFNα）、白细胞介素-2（IL-2）和白细胞介素-1（IL-1））能够引发显著的抗肿瘤免疫反应，这促使人们开始关注基于细胞因子药物的抗肿瘤特性及其安全性。其中，白细胞介素-1α（IL-1α）是一种被称为炎症“主控细胞因子”的促炎性细胞因子1。自20世纪70年代末发现该细胞因子以来，研究人员已探索其作为抗癌药物以及用于缓解化疗不良反应的造血药物的潜力2。在20世纪80年代末，多项临床前和临床研究被开展以评估IL-1α的抗癌作用3,4,5,6。这些研究发现，重组IL-1α（rIL-1α）对黑色素瘤、肾细胞癌和卵巢癌具有良好的抗肿瘤活性。然而，常见毒性反应包括发热、恶心、呕吐、流感样症状，最严重的是剂量限制性低血压。遗憾的是，这些与剂量相关的毒性反应抑制了rIL-1α进一步临床应用的热情。
为了应对IL-1α介导的毒性这一关键问题，将研究采用聚酸酐纳米颗粒（NP）制剂，该制剂可通过表面侵蚀动力学实现IL-1α的可控释放。这些NP制剂旨在保留IL-1α抗肿瘤特性的优势，同时减少剂量限制性副作用7。聚酸酐是经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的聚合物，可通过表面侵蚀降解，从而实现包封药物近乎零级释放8,9,10,11,12。已有研究报道，含有1,8-双-(p-羧基苯氧基)-3,6-二氧杂辛烷（CPTEG）和1,6-双-(p-羧基苯氧基)己烷（CPH）的两亲性聚酸酐共聚物，可作为肿瘤学及免疫学研究中多种药物递送的优良载体系统8,12。在以下实验方案中，将使用负载1.5 wt.%重组IL-1α（rIL-1α）的20:80 CPTEG:CPH纳米颗粒（IL-1α-NPs），在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）小鼠模型中研究该细胞因子的抗肿瘤活性及毒性。
以下实验方案的总体目标是评估IL-1α-NPs对头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的抗肿瘤活性。所描述的实验步骤，包括肿瘤生长和生存率的评估，可适用于任何感兴趣的免疫调节剂。这些实验应在具有完整免疫系统的同源小鼠模型中进行13 以最大程度提高临床相关性。IL-1α-NP的毒性还将通过检测循环中促炎细胞因子水平的变化及动物体重变化来评估。目前有多种方法可用于确定 体内 药物毒性；然而，目前最常用的方法是通过检测血清酶水平评估器官毒性，并观察这些器官的组织学变化。然而，进行组织学分析需要处死实验动物，这会影响实验的生存曲线。因此，本方案将包括从活体小鼠采集血液的方案，用于检测血清样本中的细胞因子。所获得的血清可用于检测任何目标血清分析物以评估器官毒性。将采用多色流式细胞术来分析肿瘤微环境中的免疫细胞群体变化以及免疫细胞向淋巴结的迁移情况。此外，也可采用其他方法鉴定免疫细胞，包括对保存的组织切片进行免疫组织化学和/或免疫荧光染色。14然而，这些技术在大量动物样本上操作时可能耗时且繁琐。总体而言，以下方法将使研究人员能够研究抗肿瘤免疫反应以及免疫刺激剂在癌症治疗中的潜在作用机制。

<table><tbody><tr><td>Bio-Plex 200 系统</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>该系统由爱荷华大学医疗保健流式细胞术中心提供</td></tr><tr><td>Bio-Plex Pro 小鼠细胞因子 23-重检测试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>M60009RDPD</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>Jakson Labs</td><td>664</td><td>4 至 6 周龄</td></tr><tr><td>DMEM（杜氏改良伊格尔培养基）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Hams F12（杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物 F-12）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Millipore Sigma</td><td>SRP3196-500UG</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Millipore Sigma</td><td>12103C-500ML</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素溶液</td><td>IBI Scientific</td><td>IB02030</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS 组织解离仪</td><td>Miltenyi biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手持式磁板洗板机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EPX-55555-000</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Millipore Sigma</td><td>H6909-10ML</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Millipore Sigma</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮/赛拉嗪</td><td></td><td></td><td>可注射麻醉剂</td></tr><tr><td>MEERL 细胞系</td><td></td><td></td><td>稳定表达 HPV16 E6/E7、hRAS 和荧光素酶的小鼠口咽上皮细胞（mEERL 细胞）</td></tr><tr><td>便携式电子天平</td><td>Ohaus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scienceware&amp;nbsp;Digi-Max&amp;nbsp;数显游标卡尺</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z503576-1EA</td><td></td></tr><tr><td>无菌酒精擦拭垫（70% 异丙醇）</td><td>Cardinal</td><td>COV5110.PMP</td><td></td></tr><tr><td>人转铁蛋白</td><td>Millipore Sigma</td><td>T8158-100MG</td><td></td></tr><tr><td>三碘甲腺原氨酸</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5516-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

评估 体内 聚酸酐il-1α纳米颗粒的抗肿瘤活性

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

细胞因子治疗是一种有前景的免疫治疗策略，可在癌症患者中引发强烈的抗肿瘤免疫反应。促炎性细胞因子白细胞介素-1α（IL-1α）已在多项临床前和临床研究中被评估为抗癌剂。然而，其剂量限制性毒性（包括类流感症状和低血压）降低了人们对这一治疗策略的热情。在此背景下，采用聚酸酐纳米颗粒（NP）递送IL-1α将是一种有效的策略，因其可能实现IL-1α在体内的缓慢、可控释放，同时减少毒性副作用。本文描述了在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）同基因型小鼠模型中，负载IL-1α的聚酸酐纳米颗粒抗肿瘤活性的分析方法。将稳定表达HPV16 E6/E7、hRAS及荧光素酶（mEERL）的小鼠口咽上皮细胞皮下注射至C57BL/6J小鼠右侧 flank 区域。当肿瘤在任一方向达到3–4 mm时，通过腹腔注射给予小鼠1.5% IL-1α负载的20:80 1,8-双(对羧基苯氧基)-3,6-二氧杂辛烷:1,6-双(对羧基苯氧基)己烷（CPTEG:CPH）纳米颗粒（IL-1α-NP）制剂。持续测量肿瘤大小和体重，直至肿瘤尺寸或体重下降达到安乐死标准。通过下颌静脉穿刺采集血液样本，利用细胞因子多重检测法评估抗肿瘤免疫反应，并通过多色流式细胞术分析肿瘤组织和腹股沟淋巴结经匀浆处理后获得的单细胞悬液中的多种免疫细胞。这些标准方法将使研究人员能够深入研究免疫刺激性纳米颗粒及其他免疫治疗剂在癌症治疗中的抗肿瘤免疫反应及其潜在作用机制。

本研究探讨了聚酸酐包裹的IL-1α在同源HNSCC小鼠模型中的抗肿瘤活性。重组IL-1α（rIL-1α）显著延缓了mEERL肿瘤的生长（图1A），尽管治疗小鼠出现体重下降，但在停止治疗后体重得以恢复（图1B）。与生理盐水或空白纳米颗粒（blank-NPs）相比，IL-1α-NPs未诱导出显著的抗肿瘤效应（图1A），并伴随一定程度的体重下降，但不如rIL-1α组明显（图1B）。接受rIL-1α治疗的小鼠生存时间显著长于其他治疗组（图1C）。此外，与其余治疗组相比，rIL-1α治疗小鼠血液循环中IL-1α、IL-1β和IFN-γ的水平更高（图2A-C）。这些结果提示，有必要进一步改进IL-1α-NP以提高其抗肿瘤疗效。<...

本文描述了一种标准方案，用于在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）同源小鼠模型中研究IL-1α的抗肿瘤活性及其相关毒性。

评估 体内 聚酸酐IL-1α纳米颗粒的抗肿瘤活性

细胞因子治疗是一种有前景的免疫治疗策略，可在癌症患者中引发强烈的抗肿瘤免疫反应。这种促炎性……

这些方案为研究免疫调节剂攻击的抗肿瘤活性提供了有效的方法。此外，还可利用这些提议的方法分析循环细胞因子和免疫细胞群体的相关变化。本方案的主要优势在于其简便且直接的肿瘤植入及生长监测方式。该技术的直接应用是评估特定疗法或抗癌研究中所面临挑战的有效性。此外，这些技术的某些方面也适用于毒性研究。首先，在37摄氏度预热的水浴中解冻一管冻存的小鼠EERL细胞，并将其转移至含有温热培养基的15毫升锥形管中。在25摄氏度下以277 × g离心5分钟，去除培养基。然后将细胞沉淀重悬于3至5毫升新鲜培养基中，并转移至T25细胞培养瓶中。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中培养，扩增至更大的培养瓶，并每三天传代一次。当细胞数量足以满足所有小鼠所需的植入量时，取出培养瓶，弃去培养基，并用PBS轻轻冲洗细胞。随后加入4毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37摄氏度下孵育2分钟。加入新鲜培养基以终止胰酶反应，并将细胞悬液收集至50毫升锥形管中。将细胞重悬于新鲜培养基中并进行计数。再次离心后，向细胞中加入冷PBS，使其最终浓度为每毫升1000万个细胞。注射前将细胞悬液置于冰上保存。用乙醇棉片对小鼠 flank 区域进行消毒。为向小鼠注射细胞悬液，先用注射器吸取100微升细胞悬液，并彻底排除顶部的气泡和死腔。然后以缓慢而稳定的方式将细胞悬液皮下注射至麻醉后的小鼠体内。将动物放回各自笼中，并持续观察直至其从麻醉中恢复。采集血液时，用非优势手抓住肩部上方松弛的皮肤，使用18号针头或采血针穿刺下颌静脉。将200至300微升血液收集至1.5毫升聚丙烯微量离心管或血清分离管中。采血后，在穿刺部位施加轻柔压力直至出血停止。将小鼠放回各自笼中，并观察至其从麻醉中恢复。让采集的血液在室温下静置凝固20至30分钟。然后将试管置于冰上，待离心前保持低温。将凝固的血液在4摄氏度下以1,540 × g离心15分钟，小心收集上层血清。在保持样本处于冰上的同时解冻血清或血浆样本。随后在4摄氏度下以1,540 × g离心5分钟，以沉淀任何细胞碎片，并小心收集上层血清。将多重检测试剂盒置于室温，并按照制造商提供的方案进行检测。将每只小鼠仰卧放置，并在其腹部皮肤喷洒70%乙醇。使用镊子和剪刀从小鼠右侧切取淋巴结，从左侧取出肿瘤组织。若肿瘤较大，可将其切成小块，并取约500至600毫克组织。将组织分别放入含有3至5毫升RPMI培养基的组织解离管中。使用自动组织解离仪对组织进行均质化处理。均质化完成后，通过70微米滤网将细胞悬液过滤至50毫升锥形管中。在25摄氏度下以277 × g离心5分钟，去除培养基。用1至2毫升冷PBS洗涤并重悬细胞。使用0.4%台盼蓝染色法，在血细胞计数板上计数活细胞。计算获得200万至300万个细胞所需的体积，并将其转移至相应的流式管中。将已计数的细胞在25摄氏度下以277 × g离心5分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于300微升PBS中。每管加入0.5至1微升Zombie染料，在避光条件下室温孵育20分钟。离心细胞，用1至2毫升流式缓冲液洗涤，并重悬于200微升流式缓冲液中。根据制造商方案加入Fc受体阻断剂，孵育10分钟。再次按前述条件离心，并用1至2毫升流式缓冲液洗涤细胞。加入抗体混合物，在4摄氏度避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，离心并用1至2毫升流式缓冲液洗涤细胞。加入300至400微升2%多聚甲醛溶液，重悬细胞以进行固定。固定后的细胞可在4摄氏度保存数天，或立即使用多色流式细胞仪进行分析。在本研究中，研究了聚酸酐IL-1的抗肿瘤活性

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癌症研究

聚酐IL-1α纳米颗粒 体内抗肿瘤 活性评价

我们提出一种新方法，利用禽类胚胎模型中的动态实时活体成像，定量分析纳米颗粒在人源异种移植肿瘤血管系统中的定位。...

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靶向表皮生长因子受体的明胶纳米颗粒在人胰腺癌细胞中的治疗性基因递送与转染

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体内光动力疗法抗肿瘤疗效分析：一种评估光敏剂在荷瘤小鼠中光毒性潜能的技术

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对...的了解不足 体内 纳米药物的性能阻碍了其临床转化。用于评估的程序 体内...

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鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备、特性、毒性及有效性评价 体外 和 体内

为了合理设计高效的佐剂，我们开发了聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒稳定的皮克林乳液（PNPE）。该PNPE具有独特的柔软性和疏水界面，可实现强烈的细胞接触，同时提供高含量的抗原负载，从而增强递送系统对抗原呈递细胞的亲和力，并促进抗原的有效内化。...

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了解利用聚酐IL-1α纳米颗粒在同基因小鼠头颈鳞状细胞癌模型中评估抗肿瘤活性与毒性的标准化实验方案，为癌症免疫治疗研究提供可靠方法。

评估体内聚酸酐IL-1α纳米颗粒的抗肿瘤活性

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