Name: 用于线粒体疾病建模的人脑类器官的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 了解利用人诱导多能干细胞生成脑类器官以模拟线粒体疾病的方法。该方案无需昂贵生物反应器，可评估线粒体生物能量学特性，为神经退行性疾病研究提供可扩展的实验模型。

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感谢 Miriam Bünning 提供的技术支持。本研究得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG）（项目号 PR1527/5-1，授予 A.P.）、Spark 基金会与柏林健康研究所（Berlin Institute of Health, BIH）（BIH 验证基金，授予 A.P.）、联合线粒体病基金会（United Mitochondrial Disease Foundation, UMDF）（Leigh 综合征国际联盟基金，授予 A.P.）、杜塞尔多夫大学医院（University Hospital Duesseldorf，UKD 研究委员会基金，授予 A.P.）以及德国联邦教育与研究部（Bundesministerium für Bildung und Forschung, BMBF）（e:Bio 青年研究员基金，编号 AZ 031L0211，授予 A.P.）的支持。C.R.R. 实验室的工作还获得了德国研究基金会（DFG）（项目 FOR 2795 &#34;Synapses under stress&#34;，项目号 Ro 2327/13-1）的资助。

注意：使用人类诱导多能干细胞（iPSCs）可能需要获得伦理审批。本研究中使用的iPSCs系在获得当地伦理批准（#2019-681）后，从健康对照个体中分离获得。所有细胞培养操作均须在无菌细胞培养超净台内进行，并在转移至超净台前仔细对所有试剂和耗材进行消毒。用于分化的iPSCs传代次数应低于50代，以避免长期培养可能导致的基因组异常。在类器官生成前，应验证细胞的多能性状态，例如通过检测多能性相关标志物NANOG或OCT4的表达水平。应每周进行支原体检测，以确保细胞培养物无支原体污染。
1. 脑类器官的生成
<ol>
	<li>人iPSC的培养
	<ol>
		<li>将人iPSC在包被的6孔板中，使用无饲养层条件的iPSC培养基（见材料表）进行培养，并置于37 °C、5% CO2的湿润组织培养孵箱中。 
		&#8203;注意：饲养层细胞的残留可能阻碍类器官的分化。至少在无饲养层条件下传代一次。</li>
		<li>当细胞融合度达到80%时，使用无酶解离培养基以1:4至1:12的比例传代iPSC。为提高细胞存活率，每次传代后加入10 µM Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（Y27632）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解离iPSC（80%融合度）—第0天
	<ol>
		<li>配制皮质分化培养基I（CDMI）（表1）。在加入细胞前，将CDMI培养基于室温（22–25 °C）预温。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗含iPSC的孔，以去除死细胞和碎片。</li>
		<li>每孔加入500 µL预温的试剂A（材料表），在37 °C孵育5分钟。在显微镜下观察以确认细胞已解离。</li>
		<li>加入1 mL iPSC培养基以稀释试剂A，中和其活性。</li>
		<li>使用1000 µL移液器反复吹打使细胞解离，将细胞悬液转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>在室温（22–25 °C）下以125 × g轻柔离心5分钟。</li>
		<li>小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。</li>
		<li>用1 mL CDMI重悬沉淀，获得单细胞悬液，并计数细胞数量。</li>
		<li>配制接种培养基：每100 µL CDMI中加入9,000个iPSC，并补充20 µM ROCK抑制剂、3 µM WNT/β-catenin抑制剂（IWR1）和5 µM SB431542。</li>
		<li>每孔加入100 µL接种培养基至96孔V型底板中。</li>
		<li>将培养板置于37 °C、5% CO2的湿润组织培养孵箱中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经球生成
	<ol>
		<li>第1天，观察到具有清晰光滑边界的圆形细胞聚集体（神经球）正在形成。注意聚集体周围的死细胞。继续在37 °C、5% CO2孵箱中培养。</li>
		<li>第3天，轻敲培养板侧面三次，通过振荡去除死细胞。</li>
		<li>每孔加入100 µL CDMI，补充20 µM ROCK抑制剂、3 µM IWR1和5 µM SB431542。</li>
		<li>将培养板放回37 °C、5% CO2的孵箱中。</li>
		<li>第6天，小心从每孔中吸除80 µL上清液，避免接触孔底。</li>
		<li>每孔加入100 µL CDMI，补充3 µM IWR1和5 µM SB431542。将培养板放回37 °C、5% CO2的孵箱中。</li>
		<li>从第6天起，每3天重复步骤5和6，直至第18天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经球转移
	<ol>
		<li>第18天，配制皮质分化培养基II（CDMII）（表1），并将10 mL加入100 mm超低吸附细胞培养皿中。</li>
		<li>使用剪去尖端的200 µL移液枪头，将圆形神经球从96孔板转移至100 mm超低吸附细胞培养皿中。 
		注意：操作应轻柔，确保枪头开口足够宽，避免过快吸取导致神经球受损。</li>
		<li>从含神经球的培养皿中吸除5 mL培养基，并加入5 mL新鲜CDMII。 
		注意：此步骤有助于减少因神经球转移而残留的CDMI培养基量。</li>
		<li>将培养皿置于37 °C、5% CO2的湿润组织培养孵箱内的轨道摇床上，以70 rpm振荡。 
		注意：次日进行肉眼观察神经球状态。若神经球发生聚集或贴附于皿底，可适当提高轨道摇床转速。</li>
		<li>每3天小心吸除上清液，更换为新鲜CDMII。保留少量培养基以防止神经球干燥。</li>
		<li>第35天，配制皮质分化培养基III（CDMIII）（表1）。 
		注意：基质成分应在冷的CDMIII中溶解。</li>
		<li>吸除培养皿中的培养基，加入10 mL冷的CDMIII。 
		注意：使用冷培养基更有效，可使基质成分均匀包被类器官而不形成团块。</li>
		<li>换液后，将培养皿重新置于37 °C、5% CO2的湿润组织培养孵箱内轨道摇床上，以70 rpm振荡。</li>
		<li>根据培养基颜色指示的生长速率，每3–5天更换一次培养基。</li>
		<li>第70天，配制皮质分化培养基IV（CDMIV）（表1）。此后使用CDMIV培养基，直至类器官达到所需培养时间。在此期间，将培养皿持续置于37 °C、5% CO2的湿润组织培养孵箱内，轨道摇床保持70 rpm。</li>
		<li>根据生长速率，每3–5天更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脑类器官的免疫染色
<ol>
	<li>组织制备
	<ol>
		<li>配制 4% 多聚甲醛（PFA）溶液，并置于通风橱中。 
		注意：操作 PFA 时请穿戴个人防护装备。</li>
		<li>收集脑类器官，使用钝头 3 mL 塑料巴斯德移液管轻柔地将其转移至盛有 PFA 的 6 孔板中。 
		注意：建议使用培养时间超过 40 天的类器官，以便观察具有更高细胞复杂性的结构。</li>
		<li>在室温下将类器官置于 PFA 溶液中固定 1 小时。</li>
		<li>用 3 mL 塑料巴斯德移液管小心吸除 PFA，并用 PBS 洗涤固定后的类器官三次。</li>
		<li>将固定好的类器官保存在 4 °C 的 PBS 中，待后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脑类器官切片制备
	<ol>
		<li>配制 3% 琼脂溶液，缓慢加热至完全液化。</li>
		<li>将模具（10 mL 注射器的切端）放置在一张吸水滤纸上（光滑面朝上），并在其上滴加一滴琼脂液。</li>
		<li>用刮匙迅速从 6 孔板中取出单个类器官，并用滤纸吸去多余的 PBS。 
		注意：避免滤纸直接接触类器官。</li>
		<li>将类器官放置在琼脂液滴上。</li>
		<li>重复此操作，最多可处理三个类器官。 
		注意：操作需迅速，以防止琼脂在此过程中凝固。</li>
		<li>继续向模具中添加琼脂，直至完全覆盖所有类器官。</li>
		<li>等待琼脂开始凝固，然后将包含类器官的整个模具（连同吸水滤纸）轻柔转移至冷却装置上。 
		注意：若无冷却装置，可将模具短暂置于 4 °C 冰箱中数分钟。</li>
		<li>同时准备切片操作：将剃刀刀片（用丙酮清洗并以双蒸水冲洗干净）安装至振动切片机（vibratome）刀架上，固定于浴槽中，并加入 PBS。</li>
		<li>将模具从（已凝固的）琼脂中取出，使用解剖刀修整成方形块状。</li>
		<li>使用粘附凝胶（见材料表）将含类器官的琼脂块固定在振动切片机的载片板上，并放入含 PBS 的浴槽中。</li>
		<li>调节振动切片机（见材料表），设置切片厚度为 150 µm。 
		注意：振动切片机的参数设置（刀片角度、振幅、频率和速度）可参考用于新生早期动物固定脑组织切片的条件。然而，最佳参数高度依赖于所用振动切片机的型号，需在初次操作时优化，以避免切片过程中组织变形或撕裂。</li>
		<li>开始切片操作。使用玻璃移液管或刮匙将每一片新切下的组织轻柔转移至盛有 PBS 的 24 孔板中。</li>
		<li>将含有切片的 24 孔板置于 4 °C 保存（可保存数天），待后续处理。</li>
		<li>使用玻璃移液管或刮匙将切片从孔板中转移至载玻片上。每张载玻片至少放置 2 片切片。</li>
		<li>用注射器小心去除琼脂和多余的 PBS。</li>
		<li>让切片自然干燥，直至其牢固贴附于载玻片上。 
		注意：虽然载玻片可暂时储存在盛有 PBS 的塑料染色缸中（4 °C），但建议在切片完成后尽快进行染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫组织化学染色
	<ol>
		<li>配制封闭液（见表 1）。</li>
		<li>使用 PAP 笔在载玻片上的切片周围画出疏水性边界，以防止液体扩散。</li>
		<li>小心地将封闭液滴加至载玻片上，在室温（22–25 °C）孵育 1 小时。为避免损伤组织，切勿将液体直接滴在切片表面。</li>
		<li>吸除封闭液，加入用封闭液稀释的目标一抗。</li>
		<li>将载玻片置于湿盒中，于 4 °C 过夜孵育。</li>
		<li>用 1× PBS 漂洗载玻片三次，每次 10 分钟。</li>
		<li>在避光条件下，加入用封闭液稀释的特异性二抗，并同时进行 Hoechst 染色（1:2,500），室温孵育 1 小时。 
		注意：请务必设置阴性对照，以确认无非特异性结合或自发荧光。</li>
		<li>在避光条件下，用 1× PBS 漂洗三次，每次 10 分钟。</li>
		<li>在切片上滴加一滴封片剂，将盖玻片边缘接触液滴，缓慢放下盖玻片，避免产生气泡。</li>
		<li>将载玻片在室温下静置过夜。在盖玻片边缘涂抹指甲油以进一步密封。如需长期保存，应置于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色结果记录
	<ol>
		<li>为获取大视野图像并进行拼接，使用配备高精度物镜的电动直立式宽场显微镜（详见材料表），并配置以下滤光片组：DAPI 滤光片组（例如，激发光（EX）：340–380 nm，二向色镜（DM）：400 nm，发射滤光片（BA）：435–485 nm）；异硫氰酸荧光素（FITC）滤光片组（例如，EX：465–495 nm，DM：505 nm，BA：515–555 nm）；Alexa594 滤光片组（例如，ET 575/40；T 600 LPXR；HC 623/24）；数字相机；高性能图像采集软件，支持自动拼接与层叠操作。</li>
		<li>图像处理时，使用具备生成 8 位 tif 文件、裁剪拼接图像、调节对比度与亮度、合并通道（如蓝、绿、红）以及添加比例尺功能的图像处理软件。</li>
		<li>为观察细节，使用配备高精度物镜、紫外激光（EX：408 nm）、氩离子激光（EX：488 nm）、氦氖激光（EX：543 nm）以及共聚焦显微镜成像软件的电动共聚焦激光扫描显微镜。</li>
		<li>处理细节图像时，使用具备生成共聚焦 z 层叠图像的最大强度投影（例如，每层光学切片厚度为 0.6 µm）、生成 8 位 tif 文件、调节对比度与亮度、合并通道（如蓝、绿、红）以及添加比例尺功能的图像处理软件。</li>
		<li>使用图形编辑软件对图像进行排版。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 脑类器官的生物能量谱分析
<ol>
	<li>用于能量代谢分析的类器官制备
	<ol>
		<li>按照制造商提供的方案配制木瓜蛋白酶和DNase溶液。</li>
		<li>将3–5个类器官转移至6孔板中，用预热的PBS洗涤两次。</li>
		<li>加入2 mL预热的含DNase的活化木瓜蛋白酶溶液，使用刀片将类器官切割成小块。</li>
		<li>将培养板置于细胞培养箱内（37 °C，5% CO2）的轨道摇床上，设置转速为27 rpm，孵育15–20分钟。 
		注：孵育时间取决于类器官的发育阶段。早期阶段的类器官可直接使用；对于培养超过3个月的类器官，建议在解离前将其切成2–3小块，并在37 °C、27 rpm振荡条件下孵育15–20分钟。该步骤有助于去除晚期类器官中可能存在的坏死组织。</li>
		<li>将消化后的组织收集至15 mL离心管中，加入5 mL类器官培养基CDMIV（表1）。</li>
		<li>用10 mL塑料移液管反复吹打10–15次以充分解离组织，静置使未解离的组织块沉降至管底。</li>
		<li>小心地将细胞悬液转移至另一15 mL离心管中，避免转移未解离的组织块。使用40 µm细胞筛网过滤溶液（例如带筛网帽的聚苯乙烯圆底管）。</li>
		<li>在室温下以300 × g 离心5分钟，收集细胞沉淀。</li>
		<li>使用台盼蓝评估细胞数量和活力。</li>
		<li>将所需数量的细胞（约20,000/孔）接种至包被的96孔微孔板中。接种后6–8小时更换为神经元培养基（表1）。</li>
		<li>将包被的96孔微孔板置于CO2培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育4天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>能量代谢分析
	<ol>
		<li>在解离细胞重新接种后的第3天，向96孔微孔板底部每孔加入200 µL校准液，并将顶部绿色传感器盒插入已水化的微孔板上。 
		注：请将传感器盒以正确方向放置于微孔板上，并确保校准液覆盖所有传感器。</li>
		<li>将已水化的96孔微孔板置于不含CO2的培养箱中，37 °C过夜孵育。</li>
		<li>开启分析仪，使仪器在37 °C下稳定过夜。</li>
		<li>在重新接种后的第4天，在显微镜下检查96孔板中的解离类器官培养状态，确认细胞形成融合单层。</li>
		<li>配制检测培养基（表1）。</li>
		<li>使用移液器从所有孔中吸除神经元培养基，注意不要触碰孔底以避免损伤细胞。也可将整块板小心倒置后在洁净滤纸上吸干。操作应迅速，以防细胞死亡。</li>
		<li>用预热的200 µL检测培养基洗涤细胞两次，每孔最终加入180 µL检测培养基。将96孔微孔板置于不含CO2的培养箱中，37 °C孵育1小时。</li>
		<li>在检测培养基中配制10 µM的线粒体抑制剂溶液。注意：注射后的终浓度为1 µM。</li>
		<li>向已水化微孔板上的传感器盒各加样孔中加入10倍浓度的线粒体抑制剂溶液。
		<ol>
			<li>向A孔加入18 µL线粒体抑制剂1。</li>
			<li>向B孔加入19.8 µL线粒体抑制剂2。</li>
			<li>向C孔加入21.6 µL线粒体抑制剂2。</li>
			<li>向D孔加入23.4 µL线粒体抑制剂3。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将加载完成的传感器盒放回已水化的微孔板中，置于不含CO2的培养箱中37 °C保存，直至开始检测。</li>
		<li>在仪器软件中设置运行程序（表2）。</li>
		<li>点击START，从不含CO2的培养箱中取出加载好的传感器盒，放入分析仪中进行校准。 
		注：确保微孔板以正确方向插入，且不带盖。</li>
		<li>校准步骤完成后，移除校准板，从不含CO2的培养箱中取出96孔细胞培养微孔板并放入分析仪中，点击CONTINUE开始测量。</li>
		<li>运行结束后，从分析仪中取出96孔细胞培养微孔板，收集各孔中的培养基，注意不要扰动细胞。 
		注：收集的培养基可于-20 °C保存，后续使用合适的乳酸检测试剂盒测定细胞释放至培养基中的乳酸含量。</li>
		<li>每孔加入200 µL 1x PBS洗涤细胞。</li>
		<li>吸除PBS后，将微孔板在-20 °C冷冻保存。 
		注：冷冻后的微孔板可用于定量各孔中的细胞数、蛋白质或DNA含量，这些数据将用于标准化所获得的能量代谢速率。请遵循制造商提供的细胞、蛋白质或DNA定量检测方案说明。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Pfiffer, V., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+bioenergetic+profile+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessing the bioenergetic profile of human pluripotent stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1264, 279-288 (2015).</li>
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<li>Menacho, C., Prigione, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+mitochondrial+diversity+in+brain+function%3A+from+animal+models+to+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemestry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tackling mitochondrial diversity in brain function: from animal models to human brain organoids.</a> International Journal of Biochemestry & Cell Biology. 123, 105760(2020).</li>
<li>Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upgrading+the+physiological+relevance+of+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Upgrading the physiological relevance of human brain organoids.</a> Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).</li>
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作者声明不存在任何竞争性财务或非财务利益。

本文描述了人诱导多能干细胞（iPSC）来源的脑类器官的可重复生成方法及其在线粒体疾病建模中的应用。此处所述方案基于先前发表的研究20进行了改进。本方案的一个主要优势在于无需将每个类器官手动包埋至支架基质中。实际上，基质溶液只需直接溶解于细胞培养基中即可。此外，无需使用昂贵的生物反应器，类器官可在置于培养箱内轨道摇床中的标准组织培养6孔板中进行培养。该方法还支持同时培养多个含有来自不同个体细胞系的类器官的培养板，从而提高实验通量，并允许监测不同类器官在生长特征上可能出现的差异。我们使用来自健康对照者及线粒体疾病患者的多种iPSC对该方案进行了测试，结果具有一致性。
在构建线粒体疾病模型时，必须使用不同的标记物来观察线粒体网络的形态和组织结构。该方法可用于研究源自线粒体疾病患者的脑类器官中，线粒体的数量、形态或分布是否可能发生改变。脑类器官中神经前体细胞的存在及其组织结构对于模拟线粒体疾病可能具有关键意义。我们最近发现，导致线粒体疾病——Leigh综合征的突变会破坏患者来源的脑类器官中神经前体细胞的细胞结构及其分布<sup class="...

线粒体疾病是先天性代谢缺陷中最大的一类1。其病因是基因突变导致多种线粒体功能障碍，包括氧化磷酸化（OXPHOS）2、呼吸链组装、线粒体动力学以及线粒体DNA的转录或复制异常3。能量需求较高的组织尤其容易受到线粒体功能障碍的影响4。因此，线粒体疾病患者通常会出现早发性神经系统症状。
目前尚无针对线粒体疾病患儿的可用治疗方法5。线粒体疾病药物研发的主要障碍之一在于缺乏能够有效模拟人类疾病进程的模型6。目前研究的多种动物模型均未表现出患者中存在的神经学缺陷7。因此，线粒体疾病神经病理学背后的机制仍未被完全阐明。
近期研究从线粒体疾病患者中生成了诱导多能干细胞（iPSCs），并利用这些细胞获得了患者特异性的神经元细胞。例如，与线粒体疾病Leigh综合征相关的基因缺陷已被发现会导致细胞生物能量学8,9、蛋白质合成10以及钙稳态9,11出现异常。这些研究报告为线粒体疾病中发生的神经元功能障碍提供了重要的机制性线索，也为这些目前无法治愈的疾病的新药研发开辟了道路12。
然而，二维（2D）培养无法用于研究三维（3D）器官的结构复杂性和区域组织特性13。为此，利用患者特异性诱导多能干细胞（iPSCs）衍生的三维脑类器官14，可能使研究人员获得额外的重要信息，从而有助于解析线粒体疾病如何影响神经系统的发育与功能15。目前，已有研究采用iPSC来源的脑类器官来探究线粒体疾病，逐步揭示其神经发育层面的病理机制。
携带与线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及卒中样发作综合征（MELAS）相关突变的脊髓类器官表现出神经发生缺陷以及运动神经元分化延迟16。源自患有线粒体疾病——Leigh综合征患者的大脑皮层类器官显示体积减小、神经上皮芽生成缺陷以及皮层结构的丧失17。来自Leigh综合征患者的脑类器官研究表明，该疾病的缺陷起始于神经前体细胞水平，这些细胞无法有效启动线粒体代谢，从而导致异常的神经元分支和形态发生18。因此，神经前体细胞可能代表了线粒体疾病的一个潜在细胞治疗靶点，促进其线粒体功能的策略可能有助于神经系统功能的正常发育。
脑类器官的使用可能有助于揭示线粒体疾病的神经发育组分。线粒体疾病主要被视为早发性神经退行性疾病5。然而，患有线粒体疾病的患者也存在神经发育缺陷，包括发育迟缓和认知障碍19。患者特异性的脑类器官可能有助于研究这些方面，并阐明线粒体疾病如何影响人类大脑发育。线粒体功能障碍还可能在其他更常见的神经系统疾病中发挥致病作用，例如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病4。因此，利用脑类器官阐明线粒体缺陷对神经发育的影响，也可能对这些疾病的研究具有重要意义。本文描述了一种生成可重复性脑类器官的详细方案，可用于线粒体疾病的疾病建模研究。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Affinity Designer</td><td>Serif (Europe) Ltd</td><td></td><td>排版软件；矢量图形编辑器</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗豚鼠抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SAB4600033-250UL</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗小鼠抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31571</td><td>1:300</td></tr><tr><td>抗霉素A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1397-94-0</td><td></td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;-微管蛋白III (TUJ-1)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8578</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>氩离子激光器</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>其他任何激光器，例如发射488 nm的二极管激光器也可使用</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma</td><td>A92902</td><td></td></tr><tr><td>含维生素A的B-27添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bacto 琼脂</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>3% PBS溶液，储存于-20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-0811</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td></td></tr><tr><td>Cell Star 细胞培养6孔板</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>化学成分明确的脂质浓缩液</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜C1</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>模块化共聚焦显微镜系统</td></tr><tr><td>Corning Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质，无酚红，无LDEV</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>基质组分</td></tr><tr><td>CyQUANT 细胞增殖检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>C7026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2660-100ML</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊Cy3抗体</td><td>Merck Millipore</td><td>AP180C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>驴抗小鼠Cy3抗体</td><td>Merck Millipore</td><td>AP192C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>驴抗兔Cy3抗体</td><td>Merck Millipore</td><td>AP182C</td><td>1:300</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DS-Q1Mc相机</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 90i 直立宽场显微镜</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E 600FN 直立显微镜</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ts2 倒置显微镜</td><td>Nikon Microsope Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ-C1 Silver Version 3.91</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>共聚焦显微镜成像软件</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>370-86-5</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-291</td><td></td></tr><tr><td>格拉斯哥MEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>玻璃巴斯德吸管</td><td>Brand</td><td>747715</td><td>倒置使用</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>氦氖激光器</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>其他任何激光器，例如发射594 nm的二极管激光器也可使用</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Merck</td><td>H3149-25KU</td><td></td></tr><tr><td>HERACell 240i CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>1:2500</td></tr><tr><td>Image J 1.53c</td><td>Wayne Rasband 国立卫生研究院</td><td></td><td>图像处理软件</td></tr><tr><td>Injekt Solo 10 mL/鲁尔接头</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Knockout 血清替代物</td><td>Gibco</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>激光器（407 nm）</td><td>Coherent</td><td></td><td>其他任何激光器，例如发射407 nm的二极管激光器也可使用</td></tr><tr><td>Map2</td><td>Synaptic Systems</td><td>No. 188004</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Maxisafe 2030i</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stemcell Technology</td><td>85850</td><td>iPSC培养基</td></tr><tr><td>Multifuge X3R 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>10325804</td><td></td></tr><tr><td>MycoAlert 支原体检测试剂盒</td><td>Lonza</td><td># LT07-218</td><td></td></tr><tr><td>N2添加剂</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>一次性使用针头（23G x 1&amp;rdquo; TW）</td><td>Neoject</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Aadvanced Research 3.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>成像软件</td></tr><tr><td>寡霉素A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Heidolph Unimax 1010 轨道摇床</td><td>Heidolph</td><td>543-12310-00</td><td></td></tr><tr><td>PAP笔</td><td>Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td>用于在载玻片上绘制疏水屏障</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶解离系统试剂盒</td><td>Worthington</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Merck</td><td>818715</td><td>4% PBS溶液，储存于-20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>巴斯德吸管 7mL</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>刻度至3 mL</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo VC 20x / 0.75 空气 DIC N2&amp;nbsp; &amp;infin;/0.17 WD 1.0</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>干式显微镜物镜</td></tr><tr><td>Plan Apo VC 60x / 1.40 油镜 DIC N2 &amp;infin;/0.17 WD 0.13</td><td>Nikon Microscope Solutions</td><td></td><td>油浸显微镜物镜</td></tr><tr><td>聚苯乙烯培养皿（100 mm）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664161</td><td></td></tr><tr><td>带细胞筛盖的聚苯乙烯圆底管（5 mL）</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Glass 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36980</td><td></td></tr><tr><td>定性滤纸</td><td>VWR</td><td>516-0813</td><td></td></tr><tr><td>ROCK抑制剂</td><td>Merck</td><td>SCM075</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma</td><td>83-794</td><td></td></tr><tr><td>S100&amp;beta;</td><td>Abcam</td><td>Ab11178</td><td>1:600</td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>13031</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Heinz Herenz Hamburq</td><td>1110918</td><td></td></tr><tr><td>SMI312</td><td>Biolegend</td><td>837904</td><td>1:500</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Merck/Sigma</td><td>31437-1kg-M</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Roth</td><td>3957</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Applichem</td><td>131965</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>Sc-17320</td><td>1:100</td></tr><tr><td>StemPro Accutase 细胞解离试剂</td><td>Gibco/StemPro</td><td>A1110501</td><td>试剂A</td></tr><tr><td>超级胶水凝胶</td><td>UHU</td><td>63261</td><td>粘合凝胶</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>VWR</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>一次性使用注射器（1 mL）</td><td>BD Plastipak</td><td>300015</td><td></td></tr><tr><td>TB2 恒温模块</td><td>Biometra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC 24孔培养板</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>TC 6孔培养板</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td></td></tr><tr><td>TGFbeta3</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-007</td><td></td></tr><tr><td>组织培养罩</td><td>ThermoFisher</td><td>51032711</td><td></td></tr><tr><td>TOM20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-11415</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Merck</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机 Microm HM 650 V</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>已停产，其他任何可调式切片机亦可使用</td></tr><tr><td>振动切片机 Wilkinson Classic 剃刀刀片</td><td>Wilkinson Sword</td><td>70517470</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Benchkote</td><td>Merck/Sigma</td><td>28418852</td><td></td></tr><tr><td>Wnt拮抗剂I</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>3378738</td><td></td></tr><tr><td>XF 96 细胞外通量分析仪</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100737-101</td><td></td></tr><tr><td>XF 检测用DMEM培养基</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103680-100</td><td></td></tr><tr><td>XF 校准液</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000</td><td></td></tr><tr><td>XFe96 FluxPak（96孔微孔板）</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102416-100</td><td></td></tr></tbody></table>

用于线粒体疾病建模的人脑类器官生成

Generation of Human Brain Organoids for Mitochondrial Disease Modeling

线粒体疾病是先天性代谢障碍中最大的一类，目前尚无治愈手段。这类疾病可导致神经发育缺陷，但其潜在机制仍有待阐明。一个主要障碍是缺乏能够重现患者早期神经功能损伤的有效模型。诱导性多能干细胞（iPSCs）技术的进步使得能够生成三维（3D）脑类器官，可用于研究疾病对神经系统发育和结构组织的影响。包括本文作者在内的研究人员近期已引入人类脑类器官来模拟线粒体疾病。本文报道了一种高效生成人源iPSC衍生脑类器官的详细实验方案，并介绍了其在线粒体生物能量学分析及成像研究中的应用。这些实验将有助于利用脑类器官研究代谢和发育功能障碍，并可能为解析线粒体疾病的神经病理机制提供关键信息。

本方案可高效生成球形类器官(图1A)。所生成的类器官包含成熟的神经元，可通过特异性标记轴突（SMI312）和树突（微管相关蛋白2（MAP2））的蛋白标志物进行观察(图1B)。成熟的类器官不仅含有神经元细胞（MAP2阳性），还含有胶质细胞（例如，星形胶质细胞标志物S100钙结合蛋白B（S100ß）阳性）(图1B)。
通过使用共聚焦显微镜分析切片后的脑类器官，可以识别并监测不同类型细胞及细胞结构的详细分布与组织方式。这有助于深入了解线粒体疾病可能如何影响神经系统发育。例如，可监测神经元轴突（SMI312阳性）和树突（MAP2阳性）(图2A)，或神经元细胞（MAP2阳性）与胶质细胞（S...

我们描述了一种详细的人诱导性多能干细胞来源的脑类器官的生成方案，及其在模拟线粒体疾病中的应用。

线粒体疾病是先天性代谢错误中最大的一类，目前尚无治愈方法。这类疾病可导致神经发育……

本方案旨在利用脑类器官研究线粒体疾病。该方法专为在评估脑类器官线粒体特性时生成可重复的脑类器官而开发。该方法无需昂贵的生物反应器以及耗时的包埋步骤。因此，该方法易于实施和放大。本方案可实现可重复的脑类器官生成，并可用于检测其线粒体特性，从而有助于发现难治性线粒体疾病干预靶点。首先，在六孔板中使用包被的无饲养层条件下的iPSC培养基培养人iPSCs，并将其置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿润化组织培养孵箱中。当细胞融合度达到80%时，使用无酶解离培养基以1:4至1:12的比例传代iPSCs。为提高细胞存活率，每次传代后添加10 µM的Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂。在第0天解离80%的iPSCs。配制皮质分化培养基一（CDM1），并在加入细胞前于室温预热。用PBS洗涤含有iPSCs的孔板，以去除死细胞和碎片。向每个孔中加入500微升预热的试剂A，在37摄氏度下孵育5分钟。在显微镜下检查以确保细胞脱落。加入1毫升iPSC培养基以稀释试剂A，中和其活性。使用1,000微升移液器通过反复吹打使细胞解离，并将细胞悬液转移至15毫升离心管中。在室温下以125 × g轻轻离心诱导多能干细胞5分钟，然后小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。用1毫升CDM1重悬沉淀，获得单细胞悬液，并计数细胞数量。在CDM1培养基中加入20微摩尔ROCK抑制剂、3微摩尔WNT/β-连环蛋白抑制剂（IWR-1）和5微摩尔SB-431542，配制接种培养基，每100微升含9,000个iPSC。每孔加入100微升接种培养基至96孔V型底培养板中。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿润化组织培养孵箱中孵育。为了生成神经球，在第1天观察到具有明确光滑边界的圆形细胞团正在形成。注意细胞团周围存在的死亡细胞。继续在37摄氏度和5%二氧化碳的培养箱中进行培养。第三天，通过轻敲培养板侧壁三次以振荡培养板，使死细胞脱落，然后向每孔中加入100微升添加了20微摩尔ROCK抑制剂、3微摩尔IWR-1和5微摩尔SB-431542的CDM1培养基。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中继续培养。第六天，小心地从每孔中移除80微升上清液。避免触碰孔板底部。向每孔加入100 µL添加了3 µM IWR-1和5 µM SB-431542的CDM1培养基，并将孔板放入培养箱孵育。每隔三天重复上述步骤，直至第18天。在第18天，为转移神经球，准备CDM2培养基并加入10毫升至一个100毫米超低吸附细胞培养板中。使用剪去尖端的200微升移液枪头，将96孔板中的圆形神经球转移至100毫米超低吸附细胞培养板中。从含有神经球的培养板中移除5毫升培养基，并加入5毫升新鲜CDM2培养基。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳的加湿组织培养孵育箱中的轨道摇床上，以每分钟70转的速度振荡。每三天小心吸除上清液，更换新鲜的CDM2培养基

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

用于线粒体疾病建模的人脑类器官的生成

该视频展示了一种利用诱导多能干细胞生成人脑类器官的方法。视频中展示了神经球如何形成神经外胚层，从而抑制其他胚层的形成。神经球被包埋在三维凝胶基质中，并形成神经上皮芽状结构。当在类器官培养基中孵育时，这些神经上皮芽进一步分化为特定的脑区，最终形成成熟的脑类器官。...

一种体外生成人脑类器官的方法

模拟人类大脑发育一直受到神经上皮组织前所未有的复杂性的阻碍。本文介绍一种高效生成脑类器官的方法，用于解析人类大脑发育早期事件，并建立小头畸形模型。 体外 如上所述。...

生成人诱导多能干细胞来源的脑类器官以模拟早期神经发育障碍

类脑器官代表了一种新的体外模型系统，可用于研究人类早期大脑发育。in...

由人诱导多能干细胞生成标准化且可重复的前脑类脑器官

本研究介绍并描述了两种特定人源神经类器官的培养方案 ，作为研究以下两个方面的相关且精确的模型：1）仅在人源神经类器官内研究人脑胶质母细胞瘤的发展；2）生成三维类器官以诱导多巴胺能神经元分化。...

人脑类器官在脑癌与神经退行性疾病研究中的应用

本方案旨在以简化且低成本的方式生成脑类器官，无需外源性生长因子或基底膜基质，同时仍能维持脑细胞类型的多样性及细胞组织的多种特征。...

一种静态自诱导法由人胚胎干细胞生成脑类器官

本研究提供了一种详细的技术方法，用于建立一种简单且稳健的皮质类器官培养体系，该体系基于标准的无饲养层人多能干细胞（hPSC）培养系统。该方案快速、高效且可重复，可用于生成模拟脑衰老特征的类器官。 体外.

稳健且高度可重复的皮质脑类器官生成方法用于模拟脑神经元衰老 体外

灵长类大脑类器官的电穿孔技术为在接近灵长类（病理）生理新皮层发育的模型系统中，向不同类型的前体细胞和神经元引入瞬时遗传修饰提供了一种精确且高效的方法。该技术可用于研究神经发育和进化过程，也可应用于疾病建模。...

靶向显微注射与电穿孔法对灵长类大脑类器官进行遗传修饰

本方案旨在将背腹侧融合类脑器官稳定接种于多电极阵列上，用于癫痫建模 体外.

一种用于癫痫建模的多电极阵列平台：基于人多能干细胞衍生脑类组装体

脑类器官是研究线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及中风样发作（MELAS）的宝贵模型，有助于揭示其潜在的病理生理机制，并为药物筛选提供平台。源自携带不同异质性水平致病基因细胞系的类器官表现出显著的表型差异。...

利用脑类器官模拟线粒体疾病：聚焦线粒体脑肌病、乳酸酸中毒及卒中样发作

本方案旨在逐步描述一种检测SH-SY5Y细胞分离线粒体的Ca2+保留能力及Ca2+诱导线粒体肿胀的方法。...

线粒体 Ca2+ 保留能力检测与 Ca2+ 诱导的线粒体肿胀检测

了解利用人诱导多能干细胞生成脑类器官以模拟线粒体疾病的方法。该方案无需昂贵生物反应器，可评估线粒体生物能量学特性，为神经退行性疾病研究提供可扩展的实验模型。

用于线粒体疾病建模的人脑类器官生成

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