基于时空波动光谱的运输亚细胞纳米结构的结构和动态性质
2021年8月16日
成像衍生的均方位移（iMSD）分析应用于大刺激小体，以突出它们在结构和动态特性方面的内在时间演化性质。然后将大孔蛋白酶体与胰岛素分泌颗粒（ISG）进行比较，作为具有时间不变平均结构/动态特性的亚细胞结构的参考。
"成像右均方位移法"能够同时提取活样品中目标生物物体的结构和动态平均特性。成像右均方位移是一个快速而强大的过程，无需提取单个物体轨迹，也无需复杂的标记。它只需要一个标准的光学设置和一个荧光标记的感兴趣物体。
该方法为大规模定量筛选在几种病理条件下亚细胞纳米结构水平上发现的结构和动态变化铺平了道路，例如癌症，糖尿病或神经退行性疾病。演示该程序的将是Fabio Azzarello，他是我实验室的博士生。要开始对细胞进行亚培养，首先用0.01摩尔PBS洗涤10厘米组织培养处理的融合螺旋细胞皿两次。
然后，加入1毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA，并将培养皿在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育5分钟。将分离的细胞重新悬浮在9毫升完整的DMEM培养基中，并在离心管中用胰蛋白酶收集10毫升总培养基。在每个35毫米×10毫米培养皿中接种约20万个细胞，最终培养基体积为1毫升，然后将细胞孵育。
根据感兴趣的亚细胞结构，需要特定的标记方法，一旦标记溶液准备就绪，用0.01摩尔PBS洗涤细胞两次。用含有染料的培养基替换PBS后，根据制造商的建议，将培养皿在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育。在孵育结束时，在实验前用新鲜培养基洗涤细胞两次。
在进行延时串联采集之前，打开显微镜培养箱控制系统，让显微镜在37摄氏度和5%二氧化碳下平衡约两个小时。使用488纳米氩激光器激发转染细胞中的EGFP和荧光标记的宏观骨脂组，并使用标准光电倍增管检测器收集500至600纳米之间的荧光发射。使用543纳米氦氖激光激发荧光染料，并收集555至655纳米之间的发射。
将检测针孔的直径设置为一个Eri的大小。并且，对于每次采集，收集一系列 1000 个连续帧。将像素停留时间设置为每像素 2 微秒，帧时间为 129 毫秒。
要正确初始化采集的仪器参数，请打开iMSD。M与软件文本编辑器。通过键入 N' 的值来设置参数:时间序列中的帧数、以微米为单位的像素大小和 f' 作为时间分辨率（以秒为单位）。
此外，将滤波器背景校正输入设置为零，以处理原始图像，或一个，以执行基于阈值的背景减法。接下来，设置AV收费阈值以进行背景校正。如果滤镜值设置为 1，则强度低于阈值的像素将设置为零。
接下来，将位设置为确定强度采样的整数。保存并运行编辑后的 iMSD。M 脚本文件。
检查命令窗口上的脚本执行，如果出现任何问题，将显示中断的警告消息。脚本执行成功后，导入图像堆栈并减去背景（如果需要）。然后，使用傅里叶法计算空间-时间相关函数。
将时空相关函数拟合为二维高斯函数。接下来，检查图形输出与 IMSD 曲线和相应的拟合曲线，这些曲线显示在三个单独的面板中，用于不同类型的拟合方程。图形图例中提供了 R 平方值。
然后，检查文本输出。溶酶体作为测试细胞器的图像采集在活细胞中以适当的时间分辨率和非常低的时间分辨率进行。由于细胞器运动引起的溶酶体的伪像变形在低分辨率图像中可见。
使用图像分析软件中的线工具导出斑点的强度分布。然后，通过绘制高斯函数的强度并进行插值，进行光斑直径估计。高速采集，产生了接近固定样品的可比平均结构尺寸。
相反，由于成像过程中的自然结构动力学，以较慢的速度采集增加了结构尺寸。在运输过程中观察到大棘皮动物的结构和动态特性。观察结果显示，巨噬细胞的平均大小减小。
子扩散运动的伴随增加，用α'值的降低表示。对于每次采集，观察到宏观骨盆体的数量随时间的增加。相比之下，对ISG进行的类似测量表明，与大皮脂酶组相比，这些后一种细胞器的行为非常不同。
事实上，胰岛素颗粒显示出不变的，平均的结构或动态特性，表明它们是在静止状态下探测的。如果两个不同的亚细胞器以不同的方式标记，则该方法可以很容易地在双色模式下应用。在这种情况下，互相关分析将突出显示单元格内两个对象的潜在动态交互。
概述
本研究利用成像衍生的均方位移（iMSD）分析来检查巨吞噬小体，突出它们随时间的动态和结构特性。将巨吞噬小体与胰岛素分泌颗粒（ISGs）进行比较，以区分它们的随时间变化的行为与更稳定的细胞器的行为。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞生物学
- 显微镜学
- 亚细胞动力学
背景
- 巨吞噬小体表现出随时间变化的结构和动态特征。
- 胰岛素分泌颗粒作为具有时间不变属性的对象的参考。
- 理解这些差异对于洞察各种病理状态至关重要。
使用的方法
- 成像衍生的均方位移分析
- 活细胞模型
- 标准带荧光标记的光学设置
主要结果
- 研究揭示了巨吞噬小体的平均大小减少以及随时间增加的亚扩散运动。
- 相比之下，ISGs保持稳定的结构和动态特性。
- 这些发现突出了不同细胞器在类似条件下的对比行为。
结论
- 本研究证明了iMSD方法在评估亚细胞结构动态变化方面的有效性。
- 它为相关疾病（如癌症和糖尿病）的细胞过程提供了宝贵的见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Imaging-derived mean square displacement (iMSD) enables quantitative assessment of structural and dynamic properties of subcellular nanostructures, supporting target validation in disease-relevant systems. The method provides mechanistic de-risking by distinguishing time-varying organelles like macropinosomes from stable structures such as insulin secretory granules. This capability enhances predictive confidence in preclinical models of cancer, diabetes, and neurodegenerative disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying size, diffusivity, and anomalous coefficient of trafficking nanostructures.
- Operational Value: Supports biological de-risking through label-free, trajectory-independent analysis compatible with standard optical setups.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream workflows via quantitative iMSD signatures.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through spatiotemporal fluctuation spectroscopy without single-object tracking.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Highlights disease relevance by detecting structural and dynamic alterations in subcellular nanostructures under pathological conditions.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal monitoring of organelle evolution.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing quantitative, multiplexable readouts of subcellular dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by extracting average structural and dynamic parameters from iMSD traces.
- Screening: Describes assay readiness and scalability through compatibility with any optical setup and fluorescent labeling.
- Analytics: Highlights measurements of size, local diffusivity, and anomalous coefficient that enable comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking iMSD signatures to pathophysiological states in cancer and diabetes models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for large-scale screening of subcellular nano-structures across disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in subcellular trafficking studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across live-cell imaging platforms.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in drug discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative organelle dynamics.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in fluorescence microscopy and image analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include standard optical setup and iMSD analysis software.
- Cross-team standardization requirements for consistent parameter setting and background correction.
- Adaptation considerations across model systems via appropriate fluorescent labeling of target nanostructures.
- Practical limitations include dependence on temporal resolution and potential artifactual deformation at low acquisition speeds.
