Name: 骨髓来源巨噬细胞的分离和 体外 培养用于NO-氧化还原生物学研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: 学习从iNOS或BH4缺陷小鼠分离骨髓来源巨噬细胞并进行体外培养的方法，使用低BH4和低硝酸盐培养基以减少氧化还原干扰，实现M0、M1和M2表型激活，用于NO-氧化还原生物学研究。

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本工作获得了英国心脏基金会授予M.J.C.的中级研究员基金（FS/14/56/31049）、英国心脏基金会项目拨款（RG/17/10/32859 和 RG/12/5/29576）、惠康信托基金（090532/Z/09/Z）以及英国国家健康研究所（NIHR）牛津生物医学研究中心的支持。作者还感谢英国心脏基金会牛津研究卓越中心（RE/13/1/30181 和 RE/18/3/34214）提供的支持

所有动物实验均经牛津大学伦理委员会批准，并依照英国政府内政部《1986年动物（科学程序）法》进行。所有实验均符合欧洲议会指令2010/63/EU的规定。
1. 骨髓细胞的分离
<ol>
	<li>通过颈椎脱臼法处死野生型（C57BL/6）或 Gch1 缺陷型（R26-CreERT2Gchfl/fl）小鼠（10–16 周龄），并取下后肢。 
	注意：对性别无特殊偏好。同龄雌性小鼠体型略小于雄性，可能影响起始材料的初始产量。
	<ol>
		<li>用 70% 乙醇喷洒小鼠，以降低污染风险。</li>
		<li>使用解剖剪在腹部做一小切口，去除躯干上的毛发和皮肤。剥离皮肤以暴露后肢肌肉。</li>
		<li>将小鼠置于腹部，通过提起膝关节并对髋部施加压力使后肢脱臼。可在髋关节处感知到脱臼。</li>
		<li>小心剪开髋部肌肉以取下后腿，确保股骨不受损伤。</li>
		<li>在踝关节上方剪断，去除足部，并清理腿部残留的皮肤。</li>
		<li>将解剖好的后腿放入含 25 mL 冰上预冷的 PBS（无需抗生素）的 50 mL 离心管中，并置于冰上。 
		注意：可同时解剖多只动物，后腿可保持在冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在组织培养超净台内无菌条件下，从后肢去除肌肉，并切除骨端以暴露骨髓。
	<ol>
		<li>将后腿置于 70% 乙醇中浸泡 2 分钟，以减少污染，并冲洗掉任何毛发或残留物。</li>
		<li>将后腿转移至洁净无菌的细菌培养皿中。使用镊子和解剖刀，用刀片侧面牢固而小心地沿骨面刮除肌肉组织。切断肌腱以方便操作。</li>
		<li>切除每根骨末端的骨骺以暴露骨髓。股骨两端均需切断，切口位置接近但不包括关节。</li>
		<li>胫骨上端在接近膝关节处切断，下端在与腓骨交汇点稍上方切断。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 PBS 冲洗骨髓，并收集至 50 mL 无菌离心管中。
	<ol>
		<li>用 10 mL PBS 填充一支 10 mL 注射器，并连接一根 25 G × 0.5 × 16 mm 针头。此量足以冲洗一只小鼠的所有骨骼。</li>
		<li>将针头插入骨髓腔，轻轻注入 1–2 mL PBS 冲洗骨髓，同时上下移动针头，确保所有骨髓组织被充分冲出。</li>
		<li>对所有骨骼重复此操作，将冲洗出的骨髓收集至洁净的培养皿中。</li>
		<li>使用无菌的 1 mL 注射器，通过反复抽吸 5–10 次，使骨髓悬液充分分散，直至无可见团块。</li>
		<li>将分散后的骨髓收集至 1 mL 注射器中，经 70 µm 细胞滤网过滤至洁净的 50 mL 离心管中。在继续收集其他样本时，将已收集的骨髓置于冰上保存。 
		&#8203;注意：参见 图 1 - 第 1 部分的实验流程示意图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. BMDM 的筛选、分化与刺激
<ol>
	<li>如需冷冻骨髓以备后续使用，先以 1000 × g 离心 5 分钟收集骨髓细胞，再用 2 mL 含 5% 二甲基亚砜（DMSO）的低内毒素胎牛血清（FBS）重悬。
	<ol>
		<li>将骨髓悬液在室温（RT）下以 1000 × g 离心 5 分钟，可见形成暗红色沉淀。</li>
		<li>弃去上清液。</li>
		<li>用 2 mL 含 5% DMSO 的低内毒素 FBS 轻柔重悬沉淀，于 -80 °C 冷冻过夜，随后转移至液氮气相中长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如需立即使用骨髓，应在接种前裂解红细胞。
	<ol>
		<li>将骨髓悬液在室温（RT）下以 1000 × g 离心 5 分钟，可见形成暗红色沉淀。</li>
		<li>用 3 mL 1× 红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，并在室温下孵育 5 分钟。</li>
		<li>加入 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），在室温下以 1000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>从步骤 2.3.5 继续操作，接种细胞用于即时实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解冻巨噬细胞，并用 3 mL 接种培养基重悬，随后离心收集细胞。
	<ol>
		<li>配制 DMEM:F12 培养基：含 5% 低内毒素 FBS、1× 青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和 25 ng/mL M-CSF。 
		注：M-CSF 和 GM-CSF 可通过将冻干蛋白溶解于含 0.1% 无菌牛血清白蛋白（BSA）的无菌水中进行配制，分装后可于 -80 °C 冷冻保存以备后续使用。</li>
		<li>在 37 °C 下快速解冻冷冻的细胞悬液。</li>
		<li>将 0.5 mL 细胞悬液转移至含 3 mL 已配制 DMEM:F12 培养基的洁净无菌离心管中。</li>
		<li>在室温下以 1000 × g 离心 5 分钟收集细胞，弃去上清液。</li>
		<li>用 3 mL 已配制的 DMEM:F12 培养基重悬细胞沉淀。</li>
		<li>采用&#160;偏好的方法对细胞进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第 0 天：接种细胞。
	<ol>
		<li>将细胞接种于未经组织培养处理的塑料器皿中，使用含 5% 低内毒素 FBS、1× 青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和 25 ng/mL M-CSF 的 DMEM:F12 培养基。 
		注：代表性接种密度见表 1。一只小鼠完整的一对后肢可提供 1500 万至 2000 万个前体细胞。</li>
		<li>将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第 5 天：换液喂养细胞。
	<ol>
		<li>向培养体系中加入原始培养基体积 50% 的新鲜 DMEM:F12 培养基，其中含 5% 低内毒素 FBS、1× 青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺和 50 ng/mL M-CSF。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第 6 天：用 GM-CSF 刺激细胞。
	<ol>
		<li>将配制好的 GM-CSF 直接加入细胞培养体系中，使其终浓度为 50 ng/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>更换为配制好的 DMEM:F12 培养基。
	<ol>
		<li>移除细胞中的全部旧培养基。</li>
		<li>用预热的 PBS 对细胞进行短暂洗涤。</li>
		<li>加入含 2% 低内毒素 FBS、1× 青霉素/链霉素、L-谷氨酰胺、25 ng/mL M-CSF 和 50 ng/mL GM-CSF 的 DMEM:F12 培养基。</li>
		<li>根据步骤 2.7.5–2.7.7 所述刺激方式，将巨噬细胞激活为 M0、M1 或 M2 表型。</li>
		<li>M0 表型：无需刺激，将细胞在培养基中过夜孵育即可。</li>
		<li>M1 表型：加入 100 ng/mL LPS 和 10 ng/mL IFNγ（终浓度），过夜刺激细胞。</li>
		<li>M2 表型：加入 100 ng/mL IL-4（终浓度），过夜刺激细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第 8 天：收获细胞。
	<ol>
		<li>移除细胞培养基（收集培养基并保存于 -80 °C，用于后续分析）。</li>
		<li>用相当于原培养基体积 50% 的冰浴 PBS 孵育细胞 5 分钟。</li>
		<li>通过轻柔刮擦或反复吹打使细胞从培养皿上脱落。</li>
		<li>在室温下以 2500 × g 离心 5 分钟收集细胞，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀于 -80 °C 冷冻保存以备后续使用。 
		注：参见实验流程图图 1 — 第二部分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zajd, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+and+elicited+peritoneal+macrophages+are+not+created+equal%3A+The+questions+asked+dictate+the+cell+type+used%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived and elicited peritoneal macrophages are not created equal: The questions asked dictate the cell type used.</a> Frontiers in Immunology. 11, 269(2020).</li>
<li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%3A+nomenclature+and+experimental+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li>
<li>Zhao, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+characteristics+of+macrophages+derived+from+murine+spleen%2C+peritoneal+cavity%2C+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zheijang+University+Science+B%22%5BJournal%5D)">Comparison of the characteristics of macrophages derived from murine spleen, peritoneal cavity, and bone marrow.</a> Journal of Zheijang University Science B. 18 (12), 1055-1063 (2017).</li>
<li>Nasser, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+bone+marrow-derived+M-CSF+receptor-dependent+self-renewing+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">Establishment of bone marrow-derived M-CSF receptor-dependent self-renewing macrophages.</a> Cell Death Discovery. 6, 63(2020).</li>
<li>Stanley, E. R., Heard, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+regulating+macrophage+production+and+growth.+Purification+and+some+properties+of+the+colony+stimulating+factor+from+medium+conditioned+by+mouse+L+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Factors regulating macrophage production and growth. Purification and some properties of the colony stimulating factor from medium conditioned by mouse L cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 252 (12), 4305-4312 (1977).</li>
<li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+bone+marrow-derived+macrophages+for+nitric+oxide+and+redox+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine bone marrow-derived macrophages for nitric oxide and redox biology.</a> Nitric Oxide. 100-101, 17-29 (2020).</li>
<li>Shiva, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrite%3A+A+physiological+store+of+nitric+oxide+and+modulator+of+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Nitrite: A physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function.</a> Redox Biology. 1 (1), 40-44 (2013).</li>
<li>McNeill, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+iNOS+function+and+cellular+redox+state+by+macrophage+Gch1+reveals+specific+requirements+for+tetrahydrobiopterin+in+NRF2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of iNOS function and cellular redox state by macrophage Gch1 reveals specific requirements for tetrahydrobiopterin in NRF2 activation.</a> Free Radical Biology and Medicine. 79, 206-216 (2015).</li>
<li>McWhorter, F. Y., Wang, T., Nguyen, P., Chung, T., Liu, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+macrophage+phenotype+by+cell+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Modulation of macrophage phenotype by cell shape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (43), 17253-17258 (2013).</li>
<li>Bailey, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+modulates+metabolic+remodeling+in+inflammatory+macrophages+through+TCA+cycle+regulation+and+itaconate+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide modulates metabolic remodeling in inflammatory macrophages through TCA cycle regulation and itaconate accumulation.</a> Cell Reports. 28 (1), 218-230 (2019).</li>
<li>Hamilton, T. A., Zhao, C., Pavicic, P. G., Datta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+colony-stimulating+factors+as+regulators+of+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Myeloid colony-stimulating factors as regulators of macrophage polarization.</a> Frontiers in Immunology. 5, 554(2014).</li>
<li>Na, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+induces+inflammatory+macrophages+by+regulating+glycolysis+and+lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF induces inflammatory macrophages by regulating glycolysis and lipid metabolism.</a> Journal of Immunology. 197 (10), 4101-4109 (2016).</li>
<li>Sorgi, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+priming+drives+bone+marrow-derived+macrophages+to+a+pro-inflammatory+pattern+and+downmodulates+PGE2+in+response+to+TLR2+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GM-CSF priming drives bone marrow-derived macrophages to a pro-inflammatory pattern and downmodulates PGE2 in response to TLR2 ligands.</a> PLoS One. 7 (7), 40523(2012).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本BH4和NO缺乏的BMDMs培养方案旨在通过降低四氢生物蝶呤（BH4）及其他干扰因素的影响，研究原代巨噬细胞中的NO氧化还原生物学，以提高这些实验模型所得结果的可靠性和可重复性。
关键步骤包括使用正确的塑料器皿。巨噬细胞前体细胞是贴壁细胞且具有很强的黏附性，因此使用未经组织培养（TC）处理的培养板至关重要，这有助于从其他可能贴壁的前体细胞中筛选和分离出巨噬细胞前体，避免污染从而提高细胞纯度。在收获细胞当天，从培养板上脱离巨噬细胞需要使用冰冻的PBS，但根据后续实验需求（例如裂解细胞或活细胞实验），也可使用EDTA或极其轻柔地刮取细胞。还需特别注意防止污染。在冲洗骨髓时，残留的毛发和皮肤可能带来细菌或病毒颗粒，造成潜在的交叉污染。因此，操作过程中应尽可能保持无菌和谨慎，建议将解剖后的腿骨浸入70%乙醇中数分钟。同样，在培养巨噬细胞过程中强烈推荐使用抗生素。
该方案的另一个局限性源于第0天的细胞接种密度。冲洗获得的骨髓含有多种细胞，可能被错误计数并计入巨噬细胞前体细胞，从而导致总细胞数不准确。为避免后续可能出现的变异，可在第7天用预热的PBS轻柔冲洗已分离的巨噬细胞，然后将其重新接种至含有2% FBS的DMEM:F12培养基中，以正确的密度接种，至少在刺激前1小时完成，以确保细胞充分贴壁。
最后，使用培养的巨噬细胞的培养基通过Griess法检测亚硝酸盐水平，对于数据分析至关重要。此外，该检测方法操作快速且成本低廉。
如本文所示，该定制方案相较于常用的使用L细胞条件培养基（LCM）分离和培养巨噬细胞的方案，是一种定义更明确且经过改进的替代方法。事实上，在研究一氧化氮（NO）氧化还原生物学时，使用LCM的主要问题之一是其含有大量可检测到的生物蝶呤，可能导致潜在的代谢改变10。例如，外源性四氢生物蝶呤（BH4）可迅速补充缺乏的模型，并作为诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的辅因子，从而导致一氧化氮的非预期生成。使用LCM的另一个缺点在于其制备过程——LCM是L-929细胞直接分泌的集落刺激因子、细胞因子及其他副产物的混合物，这些成分均可能影响巨噬细胞的生理状态6。尽管LCM富含对巨噬细胞增殖和存活至关重要的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），但其各组分在不同批次间的差异增加了实验间结果变异的风险。
为解决上述两个问题，本新方案采用成分明确的DMEM:F12培养基，其生物蝶呤含量较低，并添加定量的纯化M-CSF和GM-CSF。这两种细胞因子均有助于巨噬细胞的分化与生长。其中，M-CSF尤其能够促进骨髓来源巨噬细胞（BMDM）由骨髓前体细胞生成，确保造血干细胞向巨噬细胞分化11。此外，研究表明，在刺激前添加GM-CSF可增强炎症细胞因子和一氧化氮（NO）的产生，这在研究NO-氧化还原生物学时具有显著优势12,13。
该新方法解决的另一个主要因素是胎牛血清（FBS），后者通常用作维持细胞良好健康状态和生长所必需的营养来源。与条件培养基（LCM）类似，FBS 含有显著水平的生物蝶呤。尽管最初考虑在刺激前对细胞进行完全无血清培养（使用 OptiMEM + 0.2% BSA），但巨噬细胞出现脱落迹象，提示细胞活力下降，正如 Bailey 等人所述6。然而，由于巨噬细胞对血清具有绝对依赖性，因此选用了 BioWest 公司的超低内毒素 FBS。在批量采购前，对多个批次的 FBS 进行了生物蝶呤含量检测并预先筛选，以确保获得可靠且定义明确的供应来源。为进一步减少生物蝶呤的污染源，测试了降低 FBS 浓度的方案。在将骨髓细胞分化为巨噬细胞的 7 天过程中，FBS 浓度保持在 5%，而非细胞培养中常用的 10%；在最后一天过夜刺激期间，进一步将 FBS 浓度降低至 2%。该策略可确保检测到的生物蝶呤水平可忽略不计，同时仍提供足够的营养以维持巨噬细胞的良好健康状态和贴壁能力。尽管这种使用重组 M-CSF 的新优化方案为原代巨噬细胞的培养与活化提供了更可控的环境，但其主要局限性在于，该方法的成本高于使用 LCM 的方法。
综合考虑所有这些因素后，我们对这两种方法进行了直接比较。重要的是，本文中采用重组M-CSF和GM-CSF的新改良方案，建立了一个更为可重复的体系，其培养基中不含污染性BH4。这一改进具有双重效应：BH4缺陷型细胞确实缺乏BH4，因此在使用LPS刺激使其极化为M1型后，培养基中几乎检测不到亚硝酸盐的积累。相比之下，使用LCM培养的相同BMDM细胞中则检测到显著量的BH4和亚硝酸盐。
总之，该方法的优势在于通过全面评估可能影响巨噬细胞中一氧化氮和氧化还原信号传导的各个参数，从而精确控制生物蝶呤水平。特别是，这确保了一氧化氮-氧化还原生物学领域的最大可重复性和标准化。

巨噬细胞已被证实是在多种疾病和病理状态下具有重要意义的一类细胞，其中许多情况似乎与其传统上关注的先天免疫功能并无直接关联。由于巨噬细胞的生理特性在很大程度上依赖于其所处的组织或微环境，因此已发展出多种方法和模型用于研究其功能及相关信号通路。历史上，巨噬细胞系（如RAW264.7）曾广泛应用于该领域，但近年来逐渐被各种原代细胞模型所取代。例如，可通过腹腔注射巯基乙酸盐后进行腹腔灌洗，从而分离获得小鼠腹腔巨噬细胞。尽管该模型为研究组织驻留型细胞提供了有价值的工具，但已有研究表明，这些腹腔巨噬细胞对外界刺激的反应较弱，从而限制了其在许多后续实验应用中的适用性1。
作为一种替代方法，骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）源自骨髓中的髓系祖细胞，已成为研究巨噬细胞生物学多个方面的有价值模型，包括巨噬细胞的成熟过程及其多种经典表型：M0（幼稚型、非活化状态）、M1（促炎型，通常由LPS/IFN激活）和M2（促修复型，通常由IL-4激活）2,3。然而，髓系祖细胞向BMDMs的分化依赖于培养基中存在巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）4,5。该因子可通过向培养基中添加纯化的蛋白形式提供，也可来源于L929细胞条件培养基（LCM）。在使用BMDMs时，需权衡其在成本和效率方面的优势与它们对多种刺激因素（如细胞因子、代谢中间产物以及活性氮/活性氧物种）敏感性所带来的局限性。
既往研究表明，LCM 的成分定义不清且具有内在变异性，导致其在多种下游应用中不可靠且不适用，尤其是涉及一氧化氮（NO）或氧化还原生物学的研究，因为这些研究可能受到外源性化合物存在的显著影响6。因此，本详细实验方案要求使用成分明确、批间差异小的 DMEM:F12 培养基，并添加重组小鼠 M-CSF 和 GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）。此外，组织培养基中通常作为补充物使用的胎牛血清（FBS）是另一类成分不明确且存在固有变异性的化合物来源。因此，有必要对这类添加剂进行控制和优化，以确保骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的可靠培养。通过采用低内毒素水平的 FBS 来源，并确保批量采购同一批次的血清，可明确定义培养条件并保证实验的可重复性。本方案已被证实，在通过流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物 CD45 和 CD11b 时，所获得的巨噬细胞培养物纯度可超过 95%6。

<table><tbody><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Terumo</td><td>SS+01T1</td><td>1mL 6% LUER 注射器</td></tr><tr><td>10 mL 塑料注射器</td><td>Fisher scientific</td><td>14955453</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板，无菌，未处理</td><td>CytoOne</td><td>CC7672-7506</td><td>平底</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (1:1) (1x)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>无菌 DMSO</td><td>Sigma-aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Easy flask 260 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>156800</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液 200 mM</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G7513-100ML</td><td></td></tr><tr><td>来自大肠杆菌 O111:B4 的脂多糖</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4391-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Mutlidish 12 孔板，无菌，未处理</td><td>Thermo Scientific</td><td>150200</td><td>平底</td></tr><tr><td>25G 针头，0.5 × 16 mm</td><td>BD Microlance 3</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7.4, 1x)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，100 × 15 mm，无菌</td><td>Falcon, Corning incorporated</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 GM-CSF</td><td>PEPROTECH</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IFN-&amp;gamma;</td><td>PEPROTECH</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 M-CSF</td><td>PEPROTECH</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>23 号手术刀</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td></td></tr><tr><td>超低内毒素 FBS</td><td>Biowest</td><td>S1860-500</td><td></td></tr><tr><td>VWR 细胞筛，70 &amp;micro;m 尼龙</td><td>VWR</td><td>732-2758</td><td></td></tr></tbody></table>

分离与 体外 骨髓来源巨噬细胞的培养用于一氧化氮氧化还原生物学研究

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

巨噬细胞来源于全身的造血祖细胞，在炎症过程中起核心作用，并参与先天性和适应性免疫应答。体外研究巨噬细胞可通过从腹腔中分离细胞进行离体培养，或通过髓系骨髓祖细胞分化形成骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）。一种常见的巨噬细胞前体分化方法是使用L929细胞条件培养基（LCM）。该培养基易于自行制备，但存在批次间差异，且其成分未明确定义。同样，胎牛血清（FBS）常用于支持细胞生长，但含有大量未定义的分子混合物，其成分在不同批次间可能存在差异。这些方法不适用于一氧化氮（NO）生物学和氧化还原机制的研究，因为它们均含有大量小分子，这些小分子可能干扰氧化还原机制，或补充四氢生物蝶呤（BH4）等辅因子，而BH4是诱导型一氧化氮合酶（iNOS）产生NO所必需的。本报告中，我们提出了一种优化的实验方案，通过降低外源性生物蝶呤水平，同时维持适合细胞生长和分化的条件，从而实现对NO-氧化还原环境的精确控制。严格控制培养基成分有助于确保实验的可重复性，并促进对结果的准确解读。在本方案中，BMDMs来源于GTP环水解酶（GCH）缺陷型小鼠模型。BMDMs的培养采用含有以下成分的培养基：（i）条件化LCM，或（ii）重组M-CSF和GM-CSF，以在获得BH4和NO缺乏的培养条件的同时，产生最少的实验干扰，从而实现对NO-氧化还原生物学和免疫代谢的可重复性体外研究。

在验证该方案在巨噬细胞中的效率之前，首先检测了补充有含10%胎牛血清（FBS）的培养基中亚硝酸盐和四氢生物蝶呤（BH4）的水平，该培养基中添加了10%的条件培养基（LCM）或仅含重组M-CSF和GM-CSF。亚硝酸盐长期以来被视为一氧化氮代谢的终产物，但现在被认为是一氧化氮的生理储存形式，可在需要时被重新利用，因此常被用作一氧化氮生物可利用性的指标7。BH4是NOS合成一氧化氮所必需的辅因子。如图2所示，无论添加M-CSF/GM-CSF还是LCM，补充10% FBS的培养基中亚硝酸盐水平相似。然而，不同批次LCM之间的亚硝酸盐水平表现出更大的变异性。这一现象在BH4的测定中同样存在。事实上，某一LCM批次（#3批次）的BH4水平显著高于另外两个批次（#1和#2批次）。此外，LCM批次中的生物蝶呤含量显著高于补充10% FBS和重组细胞因子的培养基。不同批次间总生物蝶呤的含量也存在显著差异。这些结果表明，使用比LCM变异更小的M-CSF来源具有重要意义。
此外，添加10% FBS的培养基中亚硝酸盐水平显著高于含2%或5% FBS的培养基。在BH4含量方面，10%与5% FBS之间的差异极为显著（p &lt; 0.05）。然而，不同浓度FBS条件下，生物蝶呤的含量相似。相比之下，OptiMEM + 0.2% BSA几乎不含亚硝酸盐和BH4，因此是一种非常洁净且合适的培养基。但正如Bailey等人所述，尽管OptiMEM仅用于刺激巨噬细胞过夜，仍观察到因营养缺乏导致的细胞死亡。为解决这一问题，选择添加2% FBS的DMEM:F12培养基，可在提供足够营养以获得健康细胞的同时，将亚硝酸盐和BH4的污染降至最低。事实上，尽管检测到少量亚硝酸盐，其水平（约0.2 µM）与LPS/IFN刺激的野生型巨噬细胞（1 × 106 个细胞为30–80 µM；数据未显示）相比可忽略不计。
为了通过实验数据验证该改进后的实验方案，本文展示了从一种新的BH4缺陷型小鼠模型R26-CreERT2Gchfl/fl中分离和鉴定骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的过程。BH4由GTP环化水解酶I（Gch1）基因产生。如图3A所示，Gch1的缺失会导致BH4丧失，进而引起一氧化氮（NO）及其产物亚硝酸盐的消失，并导致超氧阴离子增加，从而引发氧化应激，这一点此前已被McNeill等人8证实。尽管该实验方案此前已被明确定义并用于培养其他基于不同Cre系统的BH4缺陷型巨噬细胞（例如Gchfl/flT2C模型）6,8，但R26-CreERT2Gchfl/fl模型具有独特性，因其利用他莫昔芬处理后条件性激活Cre-ERT2系统，从而特异性敲除Gch1基因（图3B、C）。这种方法可在不同时间点实现基因敲除，并以内源性对照形式比较溶剂处理组与他莫昔芬处理组。在本示例中，细胞在第1天和第3天分别接受溶剂（95%乙醇）或0.1/1.0 µM 4-羟基他莫昔芬处理（溶剂和他莫昔芬储备液均以1:100比例溶于培养基中，随后将0.7/7.0 µL加入1 mL现有培养体系中）。
如图3D所示，在R26-CreERT2Gchfl/fl细胞中，GTPCH蛋白在他莫昔芬处理后消失，而在Gchfl/fl细胞中则未消失。重要的是，R26-CreERT2Gchfl/fl细胞和Gchfl/fl对照细胞在LPS/IFN刺激后仍能产生iNOS（图3B、C）。Gch1基因表达的这些变化以及随之引起的GTPCH蛋白改变，导致细胞内BH4水平显著紊乱，并减弱了亚硝酸盐的生成。如图4所示，从R26-CreERT2Gchfl/fl小鼠分离并培养的BMDM细胞，在他莫昔芬存在的情况下，与对照组GCHfl/fl细胞相比，表现出显著降低的BH4生成量以及培养基中亚硝酸盐积累减少。类似地，这些细胞在LCM培养基中培养时也显示出Gch1表达被消除；尽管在使用4-羟基他莫昔芬敲除Gch1表达后，这些细胞仍产生了相当量的BH4和亚硝酸盐，这可能是由于培养基和胎牛血清（FBS）中存在BH4污染所致。这表明，与在含L细胞的培养基中培养细胞相比，该新方法具有明显改进。
对该模型的进一步表征显示，在不同浓度他莫昔芬处理后的第8天，非激活型（M0）Gchfl/fl 与 R26-CreERT2Gchfl/fl BMDM 在形态学上无显著差异。如图5所示，两种模型均表现出数量相似的贴壁细胞，细胞呈圆形并具有伸长的突起，典型地符合未刺激巨噬细胞的特征9。
综上所述，这些结果表明，该骨髓来源巨噬细胞（BMDM）的分离与培养方法可获得适用于小鼠巨噬细胞培养的高纯度细胞群体。该方法能够在无某些培养基配方中外源性化合物干扰的情况下进行小鼠巨噬细胞的培养。
<img alt="骨髓细胞分离；BMDM分化建立；细胞培养、刺激步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：示意图展示从骨髓细胞分离（第1部分）到BMDM的筛选、分化与刺激（第2部分）。（A）在无菌条件下，将经70%乙醇清洗后的离体腿部组织置于洁净的细菌培养皿中。（B）使用镊子和手术刀沿骨骼轻轻刮除肌肉组织。（C）切除骨骼两端以暴露骨髓腔。（D）将装有10 mL PBS的10 mL注射器针头插入骨骼髓腔，冲洗出骨髓。（E）将针头在骨骼内反复推拉，确保完全释放骨髓；此时骨骼应呈现白色透明状，释放出的骨髓收集于培养皿中。（F-G）对所有骨骼重复上述操作，将解离后的骨髓收集至1 mL注射器中，并通过70 µm细胞筛网过滤至洁净的50 mL离心管中。离心后，将细胞重悬于冻存液中以备后续使用。第2部分展示了BMDM的筛选、分化与刺激过程<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="比较NH4+、BH4、生物蝶呤；培养基成分；统计学显著性分析的柱状图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：DMEM:F12 + GM-CSF + M-CSF 或 DMEM:F12 + L细胞培养基中的亚硝酸盐和BH4水平。（A）采用Griess法测定不同培养基中的亚硝酸盐水平。（B）通过HPLC定量法使用BH4标准品测定不同培养基中的BH4和生物蝶呤水平。数据以均值（n = 3）± 标准差表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行多组间比较分析。符号表示组间差异具有统计学意义（p &lt; 0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的高清版本。</a>
<img alt="一氧化氮合成机制、基因修饰示意图、电泳及蛋白质检测结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：R26CreERT2 小鼠模型的引入。（A）示意图展示 BH4 作为 NOS 辅因子在氧化还原生物学中的作用。（B）示意图详细说明在此小鼠模型中，由于两侧存在 loxP 位点，Gch1 基因的关键外显子（外显子2和3）被切除，且 Cre-ERT2 可通过他莫昔芬实现条件性激活。（C）PCR 结果（代表 n = 3 只独立动物）显示，当 BMDM 细胞经他莫昔芬处理后，关键外显子被成功切除。野生型小鼠产生 1030 bp 的 PCR 产物，而在 Cre 存在时则产生 1392 bp 的产物，证实关键外显子已被切除。（D）iNOS、GCH 和 β-tubulin 的免疫印迹结果（代表 n = 3 只独立动物）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Gch1、BH4、亚硝酸盐水平的基因表达柱状图；LPS/IFNγ、4-OHT 实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：巨噬细胞中 BH4 缺乏的表征。（A, B）qRT-PCR 验证了经他莫昔芬处理的 R26-CreERT2Gchfl/fl 模型中 Gch1 表达的缺失。蓝色 = 新型 MCSF 方法，绿色 = 经典 LCM 方法。（C, D）通过 HPLC 分析细胞内 BH4 水平，结果显示 0.1 µM 和 1.0 µM 的浓度足以显著降低 BH4 水平。（E, F）使用格里斯（Griess）法测定培养基中亚硝酸盐含量，结果显示未刺激的 BMDM 不产生可检测水平的亚硝酸盐，而 Gchfl/fl 和 R26-CreERT2Gchfl/fl BMDM 在 LPS/IFNγ 存在下可产生亚硝酸盐。值得注意的是，对 R26-CreERT2Gchfl/fl 进行他莫昔芬处理可显著降低刺激后 BMDM 中的亚硝酸盐水平。数据以 (n = 3) 的均值 ± 标准差表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行多重比较分析数据。符号表示组间差异具有统计学意义（p &lt; 0.05）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞对他莫昔芬的反应；显微镜图像；剂量依赖性的细胞形态变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62834/62834fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：BMDMs 细胞形态的比较。通过光学显微镜在第 8 天观察经不同浓度他莫昔芬处理的 BMDMs 所获得的图像。图像中标注了比例尺。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62834/62834fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>培养皿</td>
			<td>培养基体积</td>
			<td>接种密度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 孔板</td>
			<td>1 mL</td>
			<td>500,000 个细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 孔板</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>1,000,000 个细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm 培养皿</td>
			<td>10 mL</td>
			<td>3,000,000 个细胞</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 培养瓶</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>5,000,000 个细胞</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：代表性接种密度。

本方案旨在培养缺乏四氢生物蝶呤（BH4）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的原代小鼠巨噬细胞，以研究一氧化氮-氧化还原生物学。该研究重点在于减少传统分离和培养方法中可能存在的BH4污染及其他人为假象，这些因素可能干扰实验结果并影响对数据的正确解读。

巨噬细胞来源于全身的造血祖细胞，在炎症过程中起核心作用，并参与先天性和适应性免疫反应。

本方案通过使用精确定义的培养基和低BH4及硝酸盐含量的血清，有助于培养来源于iNOS或BH4缺陷型小鼠的骨髓来源巨噬细胞，以避免对氧化还原机制的干扰。通过严格控制培养过程中潜在污染物的含量，可限制一氧化氮的干扰，确保模型系统的准确性和可重复性。该方法能够准确测定生物蝶呤、一氧化氮以及与这些关键化合物相关的任何下游因子。本实验操作将由本实验室的博士后研究员 Dr. Thomas Nichol 示范。首先，将腿部组织置于 70% 乙醇中浸泡两分钟，以去除任何毛发或残留物。随后，将腿部组织转移至一个洁净无菌的细菌培养用培养皿中。用刀沿骨骼长轴仔细刮除，切断肌腱，将肌肉从骨骼上剥离。当骨骼上的肌肉清除干净后，在胫骨近端靠近膝关节处的骨骺位置进行切割，位置位于膝关节下方。在胫骨远端靠近与腓骨交界处的上方，将胫骨横断切断。最后，在股骨两端靠近膝关节和髋关节处切断骨骺。为冲洗骨髓，用10毫升PBS填充一支10毫升注射器，并连接针头，然后将针头插入骨的髓腔内。用一到两毫升的PBS轻轻冲洗，上下移动针头。然后将悬液在1毫升注射器中反复抽吸五到十次以分散组织。将悬液收集至1毫升注射器中，通过70微米细胞滤筛过滤到一个干净的50毫升离心管中。最后，将样品置于冰上。如需冷冻骨髓以备后续使用，将细胞在室温下以 1000 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液，将红色沉淀重悬于 2 mL 防冻液中。然后在 80 摄氏度下孵育过夜。如果处于冷冻状态，则在 37 摄氏度下迅速解冻悬浮液。将细胞悬浮液转移至含有 3 毫升 DMEM/F-12 培养基的洁净无菌试管中。接下来，通过离心收集细胞沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于3 mL已配制好的DMEM/F-12培养基中。计数细胞，并将其接种于未经组织培养处理（non-TC）的塑料器皿中，使用已配制好的DMEM/F-12培养基进行培养。接着，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。第五天，通过加入相当于原始体积50%的DMEM/F-12培养基对细胞进行换液。第六天，将预先配制的GM-CSF直接加入细胞培养基中，使其终浓度达到50纳克每微升，以刺激细胞。第7天，移除细胞中的所有培养基。随后，用预热的PBS短暂洗涤细胞，并加入含有2%低内毒素FBS、1倍青霉素或链霉素、L-谷氨酰胺、25纳克/微升M-CSF和50纳克/微升GM-CSF的DMEM/F-12培养基。最后，将细胞在培养基中过夜孵育，以激活巨噬细胞至M0表型。对于M1表型，使用100纳克/微升LPS和10纳克/微升IFN-γ刺激细胞；对于M2表型，使用100纳克/微升IL-4刺激细胞。将细胞孵育过夜。第8天，细胞可根据研究人员的需求进行收获或后续处理。添加10% FBS的培养基中，无论是否含有M-CSF和GM-CSF或LCM，亚硝酸盐和四氢生物蝶呤水平相似。但添加LCM的培养基中总生物蝶呤水平较高。然而，不同LCM批次之间观察到更大的变异性。PCR结果显示，野生型小鼠产生1030 bp的扩增产物，而GCH基因敲除小鼠产生1392 bp的产物，证实关键外显子已被切除。他莫昔芬处理消除了敲除细胞中的GCH蛋白。在LPS和IFN刺激后，基因敲除细胞和对照细胞仍产生iNOS。由条件性GCH基因敲除小鼠培养的BMDM表现出显著降低的四氢生物蝶呤水平和减少的亚硝酸盐。在LCM培养基中培养的相同细胞无GCH1表达。然而，细胞在基因敲除后产生了大量的四氢生物蝶呤和亚硝酸盐。在第八天，不同浓度他莫昔芬处理的非激活对照组与GCH基因敲除的BMDM在形态上无显著差异。BMDM表现出未受刺激巨噬细胞的典型特征，呈圆形贴壁细胞并具有伸长的突起。处理此类原代细胞时，必须彻底灭菌所有组织和设备。此外，选择合适的培养基和添加剂对于维持低一氧化氮和BH4环境至关重要。细胞沉淀和培养基可用于多种下游应用，重点研究一氧化氮、生物蝶呤或细胞氧化还原状态的作用。可能包括高效液相色谱（HPLC）、定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹（Western blot）等。

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