分离与 体外 骨髓来源巨噬细胞的培养用于一氧化氮氧化还原生物学研究

本方案通过使用精确定义的培养基和低BH4及硝酸盐含量的血清，有助于培养来源于iNOS或BH4缺陷型小鼠的骨髓来源巨噬细胞，以避免对氧化还原机制的干扰。通过严格控制培养过程中潜在污染物的含量，可限制一氧化氮的干扰，确保模型系统的准确性和可重复性。该方法能够准确测定生物蝶呤、一氧化氮以及与这些关键化合物相关的任何下游因子。

本实验操作将由本实验室的博士后研究员 Dr. Thomas Nichol 示范。首先，将腿部组织置于 70% 乙醇中浸泡两分钟，以去除任何毛发或残留物。随后，将腿部组织转移至一个洁净无菌的细菌培养用培养皿中。

用刀沿骨骼长轴仔细刮除，切断肌腱，将肌肉从骨骼上剥离。当骨骼上的肌肉清除干净后，在胫骨近端靠近膝关节处的骨骺位置进行切割，位置位于膝关节下方。在胫骨远端靠近与腓骨交界处的上方，将胫骨横断切断。

最后，在股骨两端靠近膝关节和髋关节处切断骨骺。为冲洗骨髓，用10毫升PBS填充一支10毫升注射器，并连接针头，然后将针头插入骨的髓腔内。

用一到两毫升的PBS轻轻冲洗，上下移动针头。然后将悬液在1毫升注射器中反复抽吸五到十次以分散组织。将悬液收集至1毫升注射器中，通过70微米细胞滤筛过滤到一个干净的50毫升离心管中。

最后，将样品置于冰上。如需冷冻骨髓以备后续使用，将细胞在室温下以 1000 ×g 离心 5 分钟。弃去上清液，将红色沉淀重悬于 2 mL 防冻液中。

然后在 80 摄氏度下孵育过夜。如果处于冷冻状态，则在 37 摄氏度下迅速解冻悬浮液。将细胞悬浮液转移至含有 3 毫升 DMEM/F-12 培养基的洁净无菌试管中。

接下来，通过离心收集细胞沉淀。弃去上清液，并将沉淀重悬于3 mL已配制好的DMEM/F-12培养基中。计数细胞，并将其接种于未经组织培养处理（non-TC）的塑料器皿中，使用已配制好的DMEM/F-12培养基进行培养。

接着，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。第五天，通过加入相当于原始体积50%的DMEM/F-12培养基对细胞进行换液。第六天，将预先配制的GM-CSF直接加入细胞培养基中，使其终浓度达到50纳克每微升，以刺激细胞。

第7天，移除细胞中的所有培养基。随后，用预热的PBS短暂洗涤细胞，并加入含有2%低内毒素FBS、1倍青霉素或链霉素、L-谷氨酰胺、25纳克/微升M-CSF和50纳克/微升GM-CSF的DMEM/F-12培养基。最后，将细胞在培养基中过夜孵育，以激活巨噬细胞至M0表型。

对于M1表型，使用100纳克/微升LPS和10纳克/微升IFN-γ刺激细胞；对于M2表型，使用100纳克/微升IL-4刺激细胞。将细胞孵育过夜。

第8天，细胞可根据研究人员的需求进行收获或后续处理。添加10% FBS的培养基中，无论是否含有M-CSF和GM-CSF或LCM，亚硝酸盐和四氢生物蝶呤水平相似。但添加LCM的培养基中总生物蝶呤水平较高。

然而，不同LCM批次之间观察到更大的变异性。PCR结果显示，野生型小鼠产生1030 bp的扩增产物，而GCH基因敲除小鼠产生1392 bp的产物，证实关键外显子已被切除。他莫昔芬处理消除了敲除细胞中的GCH蛋白。

在LPS和IFN刺激后，基因敲除细胞和对照细胞仍产生iNOS。由条件性GCH基因敲除小鼠培养的BMDM表现出显著降低的四氢生物蝶呤水平和减少的亚硝酸盐。在LCM培养基中培养的相同细胞无GCH1表达。

然而，细胞在基因敲除后产生了大量的四氢生物蝶呤和亚硝酸盐。在第八天，不同浓度他莫昔芬处理的非激活对照组与GCH基因敲除的BMDM在形态上无显著差异。BMDM表现出未受刺激巨噬细胞的典型特征，呈圆形贴壁细胞并具有伸长的突起。

处理此类原代细胞时，必须彻底灭菌所有组织和设备。此外，选择合适的培养基和添加剂对于维持低一氧化氮和BH4环境至关重要。细胞沉淀和培养基可用于多种下游应用，重点研究一氧化氮、生物蝶呤或细胞氧化还原状态的作用。

可能包括高效液相色谱（HPLC）、定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹（Western blot）等。