Name: 分析测定切除实体瘤匀浆物的线粒体功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 学习使用玻璃匀浆器和MiR05培养基快速测定切除实体瘤匀浆物的线粒体功能。该方法简化样本制备流程，最大化线粒体产量，适用于临床转化肿瘤学研究。

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感谢Pennington生物医学研究中心比较生物学核心团队在动物护理方面提供的帮助。本研究部分得到了美国国立卫生研究院基金U54GM104940（JPK）和KL2TR003097（LAG）的支持。所有涉及动物的实验和操作程序均经Pennington生物医学研究中心机构动物护理和使用委员会批准。

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作者与本工作无利益冲突。

目前对癌症中线粒体呼吸功能的评估方法主要局限于体外模型13,14,15,16。尽管已有研究通过化学透化法成功测量了肿瘤组织中的线粒体呼吸活性6,7,17，但尚无一种统一的、可作为金标准的方法能够普遍适用于不同类型肿瘤并实现数据间的直接比较。此外，由于缺乏一致的数据分析和报告规范，限制了研究结果的普适性与可重复性。本文所述方法提供了一种简便且相对快速的技术流程，用于检测新鲜切除的实体瘤组织中分离所得线粒体的呼吸功能18。实验所用肿瘤由原位移植的鼠源Luminal B型、ERα阴性EO771乳腺癌细胞诱导生成19。
仔细谨慎地处理组织样本将显著提高耗氧速率测定的准确性和标准化水平。若样本未保持低温、未始终浸没于保存液中，或操作过度，则组织和线粒体极易受损，导致基础呼吸和氧化磷酸化（OXPHOS）速率不理想。此外，均质化组织的湿重测定极为关键，因为这是主要的标准化方法。也可考虑其他标准化方法，例如总蛋白含量或线粒体特异性标志物（如柠檬酸合酶活性）。20此外，还需解决组织异质性问题，并确定实验中应包含的肿瘤区域 先验的 坏死、纤维化及结缔组织可能难以充分匀浆和/或呼吸，应避免使用，除非有意检测这些肿瘤区域。值得注意的是，肿瘤组织可能因类型和切除部位不同而具有较强黏性，导致准确称重和转移更加困难。匀浆时应优化研磨次数，以确保线粒体充分制备，同时尽量减少对外膜的损伤。
为了提高准确性和可重复性，建议针对匀浆制备时的研磨次数、组织浓度以及底物、解偶联剂和抑制剂的浓度进行优化实验。研究可以比较不同的研磨次数，并分析其与细胞色素 c 加入后反应性之间的关系，以及与最大线粒体呼吸能力的关联21。尽管普遍认为细胞色素 c 的反应越小越好——因为加入细胞色素 c 后耗氧量增加可能提示线粒体外膜受损——但目前尚无统一的金标准来界定各类组织的阈值，需通过实验确定，以确保组织未被过度处理或准备不足。在本项肿瘤组织研究中发现，细胞色素 c 的反应低于约30%时不会损害呼吸功能。若检测结果呈阳性，则使用细胞色素 c 对准确量化呼吸能力至关重要。在此情况下，外源添加可补充内源性细胞色素 c，若其缺失，则会导致呼吸速率被低估。
可在一系列可行浓度范围内进行组织浓度滴定实验，理想情况下应使用研究中将要检测的SUITs进行。呼吸能力会因肿瘤类型和组成而异。因此，线粒体含量丰富或呼吸能力较高的肿瘤需要较低的浓度（0.5–5 mg/mL）；而线粒体较少或呼吸能力较低的肿瘤则需要较高的浓度（7–12 mg/mL）。此外，对于较长或底物消耗较多的SUITs，可能需要减少组织用量，以避免反应室重新氧合或ADP受限。某些组织的耗氧量呈线性关系，而另一些组织则在特定浓度范围内表现出更高的敏感性和最大氧化速率。所选择的组织浓度应优化至在最大限度提高氧通量的同时，减少重新氧合事件的发生次数。此外，通常更建议高估组织需求量，或以浓度范围的上限为目标。当使用较大数量的线粒体时，用于定量呼吸通量的关键抑制剂的作用将更为精确。
另一个重要的考虑因素是实验方案中所用药物的浓度。匀浆浓度的变化可能改变底物、解偶联剂和抑制剂达到最大反应所需的浓度。因此，在确定最佳浓度范围后，应进行实验以测试SUIT方案所需的剂量。可额外添加ADP，以确保腺苷酸浓度不会限制呼吸通量。化学解偶联剂（如FCCP或CCCP）在较高浓度下会抑制呼吸作用22。因此，必须以小剂量逐步滴加以揭示所达到的最大速率。抑制剂（如鱼藤酮和抗霉素A）最好在首次注射时即达到饱和。尽管最优浓度已在预实验中确定，但我们还观察到不同处理对抑制剂反应的差异，因此通常会追加一次抑制剂注射，以证明达到最大抑制效果，因为由此得到的速率是定量分析的基础。抗坏血酸/TMPD的化学抑制对于准确的分析还原至关重要，因为TMPD会发生自氧化23。我们通过添加叠氮化钠（一种公认的CIV抑制剂）来控制抗坏血酸/TMPD/细胞色素c的自氧化。在Km研究中，仅在存在琥珀酸时加入鱼藤酮，可防止草酰乙酸积累，后者在低浓度下可能抑制琥珀酸脱氢酶活性24。ADP的体积和浓度高度依赖于线粒体对当前底物组合的敏感性。对ADP高度敏感的线粒体制备物需要较低的起始浓度。此外，使用经过验证的化学品，并正确配制药物，注意pH值、是否避光（如适用）以及储存温度，是实验成功的关键。
仪器的设置和日常维护对这些实验的成功至关重要。充分且正确的腔室清洁对于实验的可重复性以及防止生物、蛋白质、抑制剂或解偶联剂污染至关重要。克拉克型电极和O2k系统采用玻璃反应腔室，相比依赖耗材的基于板的系统，具有显著的成本优势。然而，玻璃腔室必须彻底清洗，否则可能成为后续研究中抑制剂污染的来源。在清洗过程中，使用富含线粒体的样本（例如分离的心脏或肝脏线粒体）进行孵育，可降低实验污染的风险，建议在稀释和基于酒精的清洗程序之外额外采用此步骤。若连续进行多个实验，使用乙醇和线粒体进行清洗可最大程度减少抑制剂污染的可能性。建议在每次实验前对氧传感器进行校准，以获得相对于当前氧分压的准确呼吸测量值。如果无法进行多次校准，只要在清洗程序后氧浓度保持稳定且一致，则每日校准一次可能已足够。
上述方案利用Oroboros O2k仪器，在肿瘤切除后4小时内测定肿瘤组织的耗氧量，所用保存液和呼吸介质均为先前设计并优化的配方25,26,27。本实验方案中的多个参数可根据后续应用需求进行调整。仪器的设置与校准、组织制备所用的匀浆器，以及匀浆物和反应室中最佳氧浓度等条件，均可适配于其他具备氧监测功能的仪器。例如，在向反应室加入匀浆物时可略微过量填充，从而确保反应室完全封闭后毛细管内仍充满液体。这会导致反应室内部分氧气被消耗&#160;，但通过优化样品浓度，我们可在确定初始氧浓度时对此消耗予以校正。另一种方法是在关闭反应室前让样品在环境氧浓度下平衡，但这通常会延长实验开始前的准备时间，并延迟底物的添加。尽管本方案中使用的匀浆器易于获取，也可采用其他商业化的匀浆技术，例如组织剪切仪或自动匀浆仪28。
此外，该组织制备和仪器操作方法可结合多种不同的SUITS方案，用于研究不同耦合状态和通路控制状态下的呼吸调控29。这些SUITS方案旨在测定功能容量，因此潜在内源性底物的贡献不会影响容量测定结果。我们通过减去抗霉素A-鱼藤酮或叠氮化钠不敏感的耗氧速率，视情况对非线粒体耗氧和/或匀浆残留耗氧进行分析校正。线粒体在BIOPS或类似配制的保存液中可长时间保持活性（&#62;24 h），具体时长取决于组织类型及其完整性30,31。可预先开展研究以确定时间储存限度，因为特定底物的氧化磷酸化（OXPHOS）可能存在不同的限制因素。若实验无法在组织切除或活检后数小时内进行，此步骤尤为关键。37°C是评估大多数哺乳动物系统呼吸功能的最优且生理相关的温度。然而，若检测温度可能干扰评估结果32，可在较宽的温度范围（25–40 °C）内开展比较研究，以确保足够的反应灵敏度。仪器限制可能会影响此类研究的实施。
上述方法的主要局限性包括：1）机械匀浆可能对线粒体造成损伤；2）匀浆制备物中存在ATP酶或其他亚细胞生化物质，可能干扰ATP或其他目标变量的同步测定，因而可能需要额外的校正方法或使用抑制剂33；3）由于一台仪器一次仅能进行两个实验，且连续实验之间需要清洗和重新设置，因此对大量样品和/或每个样品进行多个SUIT检测时较为耗时。通过优化实验条件和保持样品制备的一致性，可最大限度地减少显著的线粒体损伤，从而避免数据不一致。
与现有或替代方法相比，该方法的优势在于起始材料用量更少、线粒体分离难度更低，以及组织透化技术挑战更小，因而可行性显著提高。制备匀浆的速度更快，氧气限制因素大大减少，且相较于透化组织，实验结果受操作人员差异的影响更小。尤为重要的是，几乎所有类型的样本均适用于匀浆制备，从而允许在不同组织间进行比较分析。高分辨率呼吸测定法是线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）和电子传递链（ET）检测的金标准。该方法在临床前及临床癌症研究中的应用，有望将当前的体外（in vitro）研究拓展至离体（ex vivo）研究，并在临床和诊断领域展现出潜在应用价值。

所有细胞都因其需要产生和消耗三磷酸腺苷（ATP）——这一分子能量货币——而紧密关联。当细胞发生突变并导致肿瘤形成时，线粒体通过能量生成方式的多样化来确保细胞存活，这种代谢特征通常在表型上可与非癌组织相区分1,2,3。因此，迫切需要快速而深入地分析线粒体呼吸功能，以促进&#160;肿瘤类型分类、癌症发生、进展及治疗反应的评估。
切除组织标本的呼吸功能无法完整评估，因为氧化磷酸化（OXPHOS）的主要底物不可穿透细胞膜。为克服这一限制，可通过线粒体分离、化学透化或机械匀浆的方法来制备线粒体。长期以来，线粒体分离被认为是评估呼吸功能的金标准。然而，该方法需要大量组织，耗时较长，得率较低，并可能对某些线粒体亚群产生选择性偏差4。透化法包括机械分离，并将组织切片或肌纤维束暴露于温和的去污剂中，以选择性降解质膜5。透化法常用于骨骼肌和心肌等横纹肌组织，因为这些组织中的单个肌纤维束易于分离。与分离法相比，透化法可获得处于天然细胞环境和物理形态下的更多线粒体5。透化法已成功应用于肿瘤6,7和胎盘8等其他组织；然而，由于解剖操作的一致性以及需克服扩散限制所带来的氧气需求，透化纤维制备的可重复性可能较差9。此外，在细胞密度高且纤维化程度高的某些肿瘤类型中，透化纤维可能不适用。组织匀浆通过机械破坏质膜而获得，在线粒体得率和完整性方面与透化纤维相似10。组织匀浆还能最大限度减少氧气扩散的限制，并可通过优化机械力广泛应用于多种组织类型11,12。
本文概述了一种简单且快速的方法，用于定量分析新鲜切除的实体瘤匀浆中氧化磷酸化（OXPHOS）和电子传递（ET）的速率。该方案最适合使用Oxygraph-2k（O2k）高分辨率呼吸测量仪评估新鲜组织，操作前需掌握仪器的设置与校准知识，但也可适配于任何类型的克拉克电极、Seahorse分析仪或酶标仪。该方法可在不同物种和肿瘤类型中重复应用，并可调整用于评估多种线粒体电子传递通路。

<table><tbody><tr><td>2-(N-吗啉代)乙磺酸水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>腺苷5′&amp;prime;二磷酸钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>抗霉素A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白，第五组分，热激，无脂肪酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117057001</td><td>罗氏</td></tr><tr><td>BD 50 mL 鲁尔锁注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-689-8</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Vacutainer 通用采血针</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-021-020</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td></td></tr><tr><td>羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>来自马心的细胞色素c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>Datlab 7.4 软件</td><td>Oroboros Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Amresco</td><td>N182</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>D-蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Dumoxel，可高压灭菌</td></tr><tr><td>Dumont #7 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td>Dumoxel，可高压灭菌</td></tr><tr><td>数显卡尺 150 mm/6 in</td><td>World Precision Instruments</td><td>501601</td><td></td></tr><tr><td>EO771 细胞</td><td>CH3 BioSystems</td><td>SKU：&amp;nbsp;94APV1-小瓶-预混液</td><td>病原体检测</td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基乙基醚)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;prime;，N&amp;prime;&lt;/em&gt;四乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>雌性C57BL/6J小鼠</td><td>&amp;nbsp;杰克逊实验室</td><td>品系编号 #000664</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>L-(&amp;minus;)-苹果酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>乳糖酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2398</td><td></td></tr><tr><td>苹果酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6413</td><td></td></tr><tr><td>基质胶矩阵</td><td>康宁</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>微量注射器</td><td>Hamilton</td><td>87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;prime;，N&amp;prime;四甲基对苯二胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7394</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10023-03</td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph-2k 荧光呼吸测量仪</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10003-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸肌酸二钠盐水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸（二钠）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W327700</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 滤纸，5号规格</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1005-090</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Tenbroeck 组织研磨器，7 mL</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>357424</td><td></td></tr><tr><td>直头显微解剖剪</td><td>Roboz</td><td>RS-5914SC</td><td></td></tr><tr><td>非安全型手术刀11号</td><td>McKesson</td><td>1029065</td><td></td></tr><tr><td>BD Precision Glide 针头 27 G × 1/2</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>BD Precision Glide 针头 18 G × 1</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>BD 1 mL 滑动接头注射器</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 可重复使用培养皿，60 mm</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>316060</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物极高脂肪饮食&amp;nbsp; 60% 千卡来自脂肪，20% 千卡来自蛋白质，20% 千卡来自碳水化合物</td><td>研究饮食</td><td>D12492</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 表面皿，100 mm</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S34819</td><td></td></tr></tbody></table>

离体实体瘤匀浆线粒体功能的分析测定

Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates

线粒体通过能量产生、活性氧调控以及大分子合成，在肿瘤的发生和发展过程中发挥着关键作用。线粒体在遗传和功能上对肿瘤微环境的适应性改变，驱动了肿瘤的增殖和转移潜能。DNA和RNA测序技术的出现，消除了评估肿瘤发生相关遗传介质的关键障碍。然而迄今为止，用于评估肿瘤线粒体功能的方法学仍不完善，且需要较高的技术熟练度，限制了其可行性，最终削弱了在实验和临床环境中的诊断与预后价值。本文中，我们&#160;介绍一种简单且快速的方法，利用高分辨率呼吸测定法，对新鲜切除的实体瘤匀浆样本中的氧化磷酸化（OXPHOS）速率和电子传递（ET）能力进行定量分析。该方案可跨物种和肿瘤类型重复应用，并可调整用于评估多种线粒体电子传递通路。通过本方案，我们证明了携带腔面B型乳腺癌的小鼠表现出烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）依赖性呼吸功能缺陷，并依赖于琥珀酸通过氧化磷酸化生成三磷酸腺苷（ATP）。

初期研究发现，EO771 肿瘤的氧化水平较低，因此需要较高的匀浆浓度才能获得足够的 O2 通量评估。为确定本研究中组织匀浆的最佳浓度范围，进行了优化实验。肿瘤匀浆初始制备浓度为40 mg/mL，随后进行线性稀释。O2 以组织质量归一化的通量在不同浓度下保持一致（图1A-D）。观察发现，40 mg/mL 的浓度会导致氧气迅速耗尽，不适合用于实验（图1A). 在无底物或ADP存在的情况下，30 mg/mL和20 mg/mL组的耗氧速率显著减慢，但仍于短时间内迅速下降图1B，C）。10 mg/mL 浓度下获得了最佳的氧气消耗速率（图1D）以支持更长的90分钟SUIT方案。
采用 SUIT 协议评估 NADH 和琥珀酸盐连接的氧化磷酸化（OXPHOS）和电子传递（ET），以及复合体 IV（CIV）活性（图 2A）。在无 ADP 的条件下，将丙酮酸和苹果酸加入组织匀浆中，以驱动经 NADH 的泄漏呼吸（L）。随后加入饱和浓度的 ADP 以驱动最大 NADH 连接的 OXPHOS（P），然后加入谷氨酸。接着加入细胞色素 c 以检测外膜完整性；所有样品中呼吸速率的增加均低于 20%（图 2B）。鉴于 NADH 连接底物的反应极低，也在琥珀酸盐和鱼藤酮存在下评估细胞色素 c 的释放，结果仅观察到细胞色素 c 刺激作用微弱（图 2B）。有趣的是，在 EO771 肿瘤中，NADH 连接的 OXPHOS 几乎可忽略不计（图 2C）。随后在丙酮酸、苹果酸和谷氨酸存在下加入琥珀酸，以刺激经琥珀酸脱氢酶的电子流。然后滴定 FCCP 以驱动最大电子流（E），结果表明在 EO771 肿瘤中，呼吸受限的主要因素是磷酸化而非氧化（图 2C）。随后滴定鱼藤酮和抗霉素 A，分别抑制复合体 I 和复合体 III。然后加入抗坏血酸和 TMPD，以驱动经 CIV 的最大电子流，该过程随后被叠氮化钠抑制。表 1 展示了将原始数据（表 2）进行分析化简的方程式，用于定量 图 2C 中绘制的呼吸参数。总体而言，肿瘤匀浆的呼吸谱（图 2C）与未移植的经二癸基硫酸钠透化的 EO771 细胞相似（图 2D），但肿瘤中由 N- 和 S-连接底物支持的最大电子传递能力有所降低。
由于NADH相关的呼吸作用可忽略不计，因此通过逐步滴加亚饱和浓度的ADP，进一步评估了琥珀酸盐的呼吸动力学，直至达到最大速率（VMAX）（图3A、3B）。在琥珀酸盐 + 鱼藤酮存在条件下，ADP的半最大浓度（KM）为37.5 µM，而VMAX 约为10.5 pmol/s/mg（图3C）。因此，尽管EO771肿瘤的氧化速率相对较低，但其对ADP高度敏感，能够在相对较低的ADP浓度下维持ATP合成。
选择原始数据中适当的区域进行提取，对于实验的可重复性和准确量化至关重要。对于细胞色素c，需在注射前立即处于稳态的阶段选择一个标记点（图4A，标记1）。注射后常会出现初始的注射干扰，随后可能有一段时期（约5-10分钟），期间O2通量尚未达到稳定。细胞色素c效率的评估应在O2通量稳定后再次选择标记点进行（图4A，标记2）。在添加底物、ADP或大多数抑制剂后，其选择标记也应在注射干扰消失且O2通量稳定后进行（图4B）。用于确定最大解偶联呼吸的选择，应取在FCCP滴定过程中达到呼吸峰值的时刻，而该峰值通常并非最后一次注射所对应的时间点（图4C）。对于TMPD的测量，应在加入抗坏血酸和TMPD之后，并在呼吸速率达到峰值时进行选择（图4D，标记1）。在此峰值刚过之后，加入抑制剂叠氮化钠，其会迅速降低呼吸速率，但通常也会出现低于抑制后呼吸速率的注射干扰（图4D）。抑制剂标记点应在注射干扰结束后立即选取（图4D，标记2）。此时O2通量通常不会趋于稳定，而是持续下降。
表1：呼吸符号表示法与解析推导。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%201.docx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：管腔B型乳腺肿瘤匀浆样本及呼吸特征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/TABLE%202.docx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
<img alt="氧气通量随浓度变化的曲线图，分析不同浓度下随时间变化的氧气消耗。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：肿瘤匀浆液浓度的优化。O2 通量（红色）和 O2 浓度（蓝色）在乳腺肿瘤匀浆液中的变化，匀浆浓度分别为（A）40 mg/mL、（B）30 mg/mL、（C）20 mg/mL 和（D）10 mg/mL。Thom：组织匀浆呼吸。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="氧通量分析；O₂通量/流速图；细胞色素c释放；实验比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2通过高分辨率呼吸测定法评估新鲜切除肿瘤匀浆中的氧化磷酸化和电子传递链能力 (A代表性曲线图，显示底物、抑制剂、解偶联剂实验过程中耗氧量（红色）与浓度（蓝色）的变化。PM：丙酮酸 + 苹果酸，D：ADP，G：谷氨酸，c：细胞色素 c，S：琥珀酸，F：FCCP，Rot：鱼藤酮，Ama：抗霉素A，Asc/TMPD：抗坏血酸/四甲基对苯二胺。B) O的百分比增加2 细胞色素添加后的通量变化 c. (C-D) 在存在ADP、FCCP以及抗坏血酸/TMPD的条件下，由苹果酸、丙酮酸、谷氨酸和琥珀酸支持的呼吸作用CEO771 来源的肿瘤匀浆物以及（D非植入型EO771细胞经皂苷（digitonin）透化处理。Thom：组织匀浆呼吸；PM：丙酮酸 + 苹果酸；PMG：丙酮酸 + 苹果酸 + 谷氨酸；PMGS：丙酮酸 + 苹果酸 + 谷氨酸 + 琥珀酸；CIV：复合物IV；-L：泄漏态；-P：氧化磷酸化态；-E：电子传递态；N连接：O2 由特定NADH生成底物组合支持的通量；NS连接：O2 由特定NADH生成底物组合与琥珀酸盐的汇聚所提供的通量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="线粒体呼吸图，O2通量与ADP；动力学曲线和柱状图；研究数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：EO771乳腺肿瘤表现出对ADP（腺苷5′-二磷酸）的高度敏感性。（A）S型ADP滴定实验中氧消耗（红色）和浓度（蓝色）的代表性曲线。Thom：组织匀浆呼吸；S/Rot：琥珀酸/鱼藤酮；D：ADP。（B）在鱼藤酮存在下，琥珀酸支持的呼吸作用随ADP浓度递增（0 µM ADP = S/Rot-L）。（C）在琥珀酸 + 鱼藤酮存在条件下，ADP的呼吸最大速率（VMAX）和半最大效应浓度（KM）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="O₂ 流量与浓度关系图；氧气消耗研究；时间变化分析，实验数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62875/62875fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：代表性轨迹图，展示用于数据提取的原始 O2 流量标记选择。（A）细胞色素 c 选择：在注射细胞色素 c 之前的选择点 1，以及注射后 O2 流量稳定时的选择点 2。c：细胞色素 c。（B）底物、ADP 和抑制剂选择：在注射后（本代表性图中为琥珀酸）O2 流量稳定时的选择点 1。S：琥珀酸。（C）解偶联剂选择：在解偶联剂滴定过程中呼吸速率达到峰值时的选择点 1。在本代表性 FCCP 滴定图中，第三次注射略微降低了呼吸速率，因此不用于选择。F：FCCP。（D）TMPD 选择：在抗坏血酸和 TMPD 注射后呼吸速率达到峰值时的选择点 1。叠氮化钠选择：在急性注射伪影之后，当呼吸速率最初下降并恢复时的选择点 2。As/Tm：抗坏血酸/TMPD；Azd：叠氮化物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62875/62875fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们开发了一种实用的实验方案和分析方法，用于评估新鲜肿瘤匀浆中线粒体的氧化磷酸化和电子传递能力。该方案可轻松调整，用于检测多种与肿瘤发生、发展及治疗反应相关的线粒体功能。

线粒体通过能量产生、活性氧调控以及大分子物质代谢，在癌症的发生和发展过程中发挥着重要作用。

本方案描述了一种简单且快速的肿瘤线粒体功能检测方法。该方案广泛适用于临床转化肿瘤学研究，有助于增强对线粒体在癌症发生和发展过程中作用的诊断性与机制性理解。该技术的主要优势在于采用组织匀浆法，简化了样品制备过程，最大化线粒体得率，同时减轻了扩散限制带来的影响。该技术在临床和诊断领域具有潜在应用价值，可利用新鲜活检或切除的肿瘤组织对肿瘤线粒体功能进行定量评估。首先，将含有1毫升线粒体呼吸介质（MiR05）的玻璃匀浆器连同紧密配合的玻璃研杵置于湿冰上。将组织置于冰冻的培养皿中，加入1毫升活检组织保存液（BIOPS）。将肿瘤切成每块约5至10毫克的小片，将剩余的肿瘤组织放回盛有10毫升冰上保存的BIOPS溶液的容器中。用滤纸小心吸干组织切片后，将其置于已去皮重的小型塑料称量舟中，记录初始湿重。将未使用的组织块放回10毫升锥形管中的BIOPS溶液中，以继续保存。将组织切片浸入含有 MiR05 的冰浴匀浆器中，并记录称量舟中剩余的重量。使用间隙范围为 0.09 至 0.16 毫米的玻璃研杵，通过完成五到七次上下移动轻柔地破碎肿瘤组织。每次移动时，在向下推动研杵的过程中顺时针/逆时针旋转三次，向上拉回研杵时再额外旋转三次。在研磨间隙让组织沉降到匀浆器底部，但避免将研杵完全提离液面，以防产生泡沫。将匀浆液倒入一个15毫升的锥形管中，并置于冰上。用移液器吸取1至3毫升新鲜的MiR05溶液，加在研杵上方并注入匀浆器中，以冲洗残留的组织匀浆。将MiR05洗涤液倒入含有匀浆液的锥形管中。重复此步骤两到三次，以确保匀浆液完全转移。为了准确计算组织匀浆液的浓度，需仔细检查匀浆器和匀浆液中是否残留未匀浆完全的物质，包括结缔组织。为了去除匀浆器中无法用镊子触及的未匀浆组织，在向匀浆器中加入MiR05后，用移液器吸取包括组织在内的液体，并将内容物转移至培养皿中。用移液器吸取匀浆液中沉降至锥形管底部的大块未匀浆组织，并将其置于锥形管盖上。用镊子从培养皿或锥形管盖上取下组织，并在滤纸上轻轻吸干。将锥形管管帽中残留的匀浆液加回锥形管中。盖紧管盖，倒置混匀。重新检查匀浆器和匀浆液中是否存在未匀浆完全的组织，如有需要，重复上述步骤以去除未匀浆完全的物质。称量并记录从匀浆器中回收的未匀浆组织的质量。检查匀浆液制备物中是否存在明显完整转移的组织，必要时移除未匀浆的组织块并进行称量。从初始湿重 中减去从称量舟、匀浆器及匀浆液中回收的组织重量，以计算最终样品重量。根据最终样品重量，加入额外的MiR05缓冲液，使匀浆达到所需浓度。样品称重并制备完成后，应尽快进行检测。在转移至仪器前，始终将样品置于湿冰上保存。仪器校准完毕且样品制备完成后，以旋转方式取下塞子，从腔室中吸出MiR05，注意避免接触腔室内暴露的膜。充分混匀匀浆液，然后向腔室中加入2.25毫升匀浆液。若将同一份匀浆液加入多个腔室，应每次向各腔室中移取1毫升匀浆液，并在加样过程中持续混匀匀浆液，以确保组织分布均匀。单击 F4 以命名并记录事件的时间戳，然后单击“确定”。使用带有调节器和气体导管的氧气罐，通过钝头18号针头将50毫升注射器充满氧气。将氧气直接注入腔室，使腔室中的氧浓度升高至约500微摩尔。松松地插入塞子，待氧气浓度降至约 480 微摩尔时再完全关闭。通过旋转动作缓慢关闭腔室，并让呼吸反应平衡约 15 至 20 分钟。如有需要，用 MiR05 填充塞子的中央毛细管。使用专用微量注射器将底物、解偶联剂和抑制剂注入完全封闭的反应室中，并为每个反应室的事件实时命名和打时间戳。根据需要按 F6 键调整氧气浓度和氧气消耗速率的负向刻度。每次注射后，用水清洗注射器三次（适用于水溶性化合物），或用 70% 乙醇清洗三次（适用于乙醇溶解的化合物）。加入5 µL 0.8摩尔的苹果酸，并立即进行下一次注射。用清水冲洗注射器三次。立即加入5 µL 1摩尔的丙酮酸，并等待呼吸速率稳定。清洗注射器后，加入 10 微升 0.5 摩尔的 ADP，并等待 ADP 反应稳定。再次清洗注射器，加入 5 微升 2 摩尔的谷氨酸，并等待呼吸速率稳定。再次清洗注射器，然后加入 5 微升 4 毫摩尔的细胞色素 C，并等待呼吸速率稳定。清洗注射器后，加入 20 µL 1-摩尔的琥珀酸，并等待呼吸作用稳定。以 0.5 至 1 µL 的增量逐次滴加 1-毫摩尔 FCCP，并在每次注射后等待呼吸作用稳定。重复此步骤，直至呼吸作用不再进一步增加。 用70%乙醇清洗注射器三次。加入2 µL 150 µM的鱼藤酮，并等待呼吸稳定。再加入1 µL鱼藤酮，以确保无进一步抑制作用。如果呼吸作用降低，则继续进行额外注射，直至呼吸作用不再降低，然后用70%乙醇清洗注射器三次。加入2微升125微摩尔的抗霉素A，并等待呼吸作用稳定。再加入1微升抗霉素A，以确保无进一步抑制作用。如果呼吸速率下降，则继续进行额外注射，直至呼吸速率不再下降。用70%乙醇清洗注射器三次。检查腔室中的氧气浓度。如果浓度低于125微摩尔，需重新暴露于室内空气或轻度高氧环境中，以确保氧气不限制呼吸通量。加入5微升0.8摩尔的抗坏血酸。用70%乙醇清洗注射器三次。立即加入10微升0.2摩尔的TMPD，并等待呼吸速率上升。当抗坏血酸-TMPD的呼吸通量达到平台期时，用乙醇清洗注射器后立即加入25微升4摩尔的叠氮化钠。通过点击文件、保存并断开连接来结束实验。观察到，每毫升组织匀浆含40毫克时，会导致氧气迅速耗尽。当每毫升组织匀浆为30毫克和20毫克时，耗氧速度显著减慢，但在缺乏底物或ADP的情况下，短时间内仍会快速下降。每毫升组织匀浆含10毫克时，可获得最佳的氧气消耗速率。采用SUIT方案评估了NADH和琥珀酸连接的氧化磷酸化及电子传递，以及复合体IV的活性。在丙酮酸和苹果酸，或琥珀酸和鱼藤酮存在下检测了细胞色素C的释放，两种条件均表明匀浆制备过程未损伤线粒体。此外还发现，EO771肿瘤中NADH连接的氧化磷酸化作用可忽略不计。通过滴定FCCP以驱动最大电子流发现，在EO771肿瘤中，限制呼吸作用的因素是磷酸化而非氧化。肿瘤匀浆的呼吸特征与未移植的、经皂苷（digitonin）透化的EO771细胞相似，但肿瘤中由N链和S链底物支持的最大电子传递能力有所降低。通过逐步滴加亚饱和浓度的ADP直至达到最大速率，进一步评估了琥珀酸的呼吸动力学。在存在琥珀酸和鱼藤酮的情况下，ADP 的半最大浓度为 37.5-微摩尔，而最大速率为每秒每毫克约 10.5 皮摩尔。常规护理中仪器的设置以及组织处理对这些实验的成功至关重要。遵循这些步骤后，可根据具体研究问题采用其他基于质量或标记物特异性的速率标准化方法。常用的检测指标包括总蛋白定量和柠檬酸合酶的酶活性，但具体选择取决于模型系统、统计设计和研究问题。

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科研

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