分析测定切除实体瘤匀浆物的线粒体功能
2021年8月6日
我们开发了一种实用的方案和分析方法来评估新鲜肿瘤匀浆中的线粒体氧化磷酸化和电子转移能力。该协议可以很容易地用于调查有助于癌症发生，进展和治疗反应的各种线粒体功能。
该协议描述了一种用于测量肿瘤线粒体功能的简单而快速的方法。该协议广泛适用于临床转化肿瘤学，并将有助于加强对线粒体在癌症发作和进展中的作用的诊断和机制解释。该技术的主要优点是应用组织均质化来简化制备并最大化线粒体的产量，同时减轻扩散的局限性。
该技术在临床和诊断环境中提供了潜在的应用，使用新鲜活检或切除的肿瘤组织对肿瘤线粒体功能进行定量评估。首先将含有一毫升线粒体呼吸培养基或MiR05的玻璃均质机放在湿冰上紧密贴合的玻璃杵中。将组织置于冰冷的培养皿中的一毫升活检保存溶液或BIOPS中。
将肿瘤切成每块约5至10毫克的小块，并将剩余的肿瘤块放回10毫升BIOPS中，保存在冰上。在滤纸上小心地擦拭组织切片后，将它们放在一个小的塑料去皮秤上，并记录最初的湿重。将未使用的碎片放回BIOPS的10毫升锥形管中以继续保存。
将组织切片浸入含有MiR05的冰冷均质机中，并在称重船上记录剩余重量。使用间隙范围为0.09至0.16毫米的玻璃杵，通过完成五到七次向下和向上的行程来轻轻破坏肿瘤组织。每次击打时，以顺时针/逆时针旋转杵三次，同时向下推动杵，并在将杵拉回时再旋转三次。
在两次划水之间，让组织沉降到均质机的底部，但避免将杵完全置于液体体积之上以防止起泡。将匀浆倒入15毫升的锥形管中，并将其放在冰上。将一到三毫升新鲜MiR05移取在杵上，然后放入均质机中，以洗涤任何剩余的组织匀浆。
将MiR05洗涤液倒入含有均质物的锥形管中。重复此步骤两到三次，以确保匀浆的完全转移。为了准确计算组织均质浓度，请仔细检查均质机和均质液中剩余的非均质材料，其中包括结缔组织。
为了从均质机中除去镊子无法到达的非均质材料，将MiR05加入均质机后，用移液管吸出体积（包括组织），并将内容物移动到培养皿中。通过用移液管吸出锥形管底部大块沉降的非均质材料，将其从均质液中取出，并将它们放在锥形管的盖子上。用镊子从培养皿或锥形管盖中取出组织，并将其擦拭在滤纸上。
将剩余的均质物从锥形管盖中重新加入锥形管中。盖上管子，然后倒置混合。重新检查均质器和均质器是否有任何额外的非均质材料，并根据需要重复步骤以去除非均质材料。
称重并记录从均质机回收的非均质材料的质量。检查匀浆制剂中是否有任何完全完整的转移组织，并取出非均质片并根据需要称重。从称重船、均质机和均质中减去从初始湿重中回收的组织重量，以计算最终样品重量。
使用最终样品重量，添加额外的MiR05以使匀浆达到所需浓度。一旦称量并制备了匀浆，请尽快进行测定。将样品储存在湿冰上，直到转移到仪器上。
校准仪器并制备样品后，以扭曲的运动取出塞子，并将MiR05从腔室中吸出，避免膜暴露在腔室内。将匀浆混合均匀，并向腔室中加入2.25毫升匀浆。假设将一种匀浆液添加到多个腔室中，一次将一毫升匀浆移入每个腔室中，同时混合均质以确保均匀的组织分布。
单击 F4 以命名事件并为其添加时间戳，然后单击"确定"。使用钝的18号针头将来自氧气罐的氧气填充50毫升注射器，氧气罐带有调节器和气体管。将氧气直接注入腔室中，使其过氧化为约500微摩尔氧。
松散地插入塞子并等待关闭，直到氧气达到约480微摩尔。通过扭曲运动，慢慢关闭腔室，让呼吸平衡约15至20分钟。如有必要，用MiR05填充塞子的中央毛细管。
使用专用的微量注射器将底物、解偶合器和抑制剂注射到完全封闭的腔室中，以实时命名每个腔室的事件并加盖时间戳。选择 F6 可根据需要调整氧浓度和氧斜率负刻度。每次注射后，将注射器在水中洗涤三次水溶性化合物，70%乙醇洗涤乙醇溶解化合物。
加入五微升0.8摩尔苹果酸盐，并立即进行下一次注射。将注射器在水中洗涤三次。立即加入5微升1-摩尔丙酮酸，等待呼吸稳定。
清洗注射器后，加入10微升0.5摩尔ADP，等待ADP反应稳定。清洗注射器，加入5微升2-摩尔谷氨酸盐，等待呼吸稳定。清洗注射器，然后加入五微升4毫摩尔细胞色素-C，等待呼吸稳定。
清洗注射器后，加入20微升1摩尔琥珀酸盐，等待呼吸稳定。以 0.5 至 1 μL 的 1 毫摩尔 FCCP 为增量滴定，并等待每次注射后呼吸稳定。继续，直到呼吸没有额外增加。
将注射注射器在70%乙醇中洗涤三次。加入两微升150微摩尔鱼藤酮，等待呼吸稳定。再加入一微升鱼藤酮，以确保没有进一步的抑制。
如果呼吸减少，继续额外注射，直到呼吸没有减少，然后用70%乙醇洗涤注射器三次。加入两微升125微摩尔抗霉素A，等待呼吸稳定。再加入一微升抗霉素A，以确保没有进一步的抑制。
如果呼吸减少，继续额外注射，直到呼吸没有减少。用70%乙醇洗涤注射器三次。检查腔室的氧气浓度。
如果浓度低于125微摩尔，则向室内空气再加氧，或轻度超氧，以确保氧气不会限制呼吸通量。加入5微升0.8摩尔抗坏血酸盐。将注射器在70%乙醇中洗涤三次。
立即加入10微升0.2摩尔TMPD，等待呼吸增加。用乙醇洗涤注射器后，当抗坏血酸TMPD的呼吸通量稳定时，立即加入25微升4摩尔叠氮化钠。通过单击"文件"，"保存并断开连接"来结束。
观察到每毫升组织匀浆40毫克导致快速耗氧。氧气消耗量显着减慢，每毫升组织匀浆30和20毫克，但在没有底物或ADP的情况下，仍然在短时间内迅速下降。每毫升浓度为10毫克的组织匀浆导致最佳的耗氧率。
使用SUIT方案评估NADH和琥珀酸盐连接的氧化磷酸化和电子转移，以及复合物IV活性。在丙酮酸盐和苹果酸盐或琥珀酸盐和鱼藤酮存在的情况下评估细胞色素C释放，这两者都表明匀浆制剂不会损害线粒体。还发现NADH连接的氧化磷酸化在EO771肿瘤中可以忽略不计。
FCCP的滴定以驱动最大电子流显示，在EO771肿瘤中，磷酸化而不是氧化限制了呼吸。肿瘤均质呼吸谱与未植入的、洋地黄素透化的EO771细胞相似，除了肿瘤中N和S连锁底物支持的最大电子转移减少。通过逐步滴定亚饱和ADP直到达到最大速率，进一步评估琥珀酸盐的呼吸动力学。
在琥珀酸盐和鱼藤酮存在下，ADP的半最大浓度为37.5-微摩尔，而最大速率约为每秒10.5皮摩尔，每毫克。在常规护理和组织处理中设置的仪器对于这些实验的成功至关重要。遵循这些程序，可以根据感兴趣的问题应用其他质量或标记特异性方法来进行速率归一化。
常见的衡量标准包括总蛋白定量和柠檬酸合酶的酶活性，但因模型系统、统计设计和研究问题而异。
概述
本协议描述了一种简单快速的肿瘤线粒体功能测量方法，适用于临床转化肿瘤学。它增强了对癌症中线粒体作用的诊断和机制解释。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 线粒体生物学
背景
- 线粒体在癌症的发生和发展中起着至关重要的作用。
- 了解线粒体功能可以改善治疗反应。
- 现有的方法在评估线粒体能力方面可能存在局限性。
- 本协议旨在简化肿瘤样本的准备以供分析。
研究目的
- 开发评估线粒体氧化磷酸化的协议。
- 评估新鲜肿瘤均质物中的电子转移能力。
- 提供可适应各种线粒体功能的方法。
使用的方法
- 使用玻璃均质器制备肿瘤样本。
- 使用线粒体呼吸介质（MiR05）进行均质化。
- 定量评估新鲜活检组织的线粒体功能。
- 小心去除未均质的材料以确保准确的结果。
主要结果
- 该协议允许高效评估线粒体功能。
- 它最大限度地提高线粒体产量，同时最小化扩散问题。
- 结果可以增强对癌症中线粒体作用的理解。
- 强调了在临床和诊断环境中的潜在应用。
结论
- 这种方法提供了研究肿瘤线粒体的实用方法。
- 它可以适应肿瘤学中的各种研究需求。
- 未来的研究可以利用这一协议深入了解癌症生物学。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of mitochondrial function in excised solid tumor homogenates addresses a critical gap in oncology discovery workflows by enabling direct measurement of oxidative phosphorylation and electron transfer capacity. This protocol supports mechanistic de-risking and target validation for metabolic vulnerabilities in cancer, enhancing predictive confidence at early discovery and translational inflection points. Its reproducibility and adaptability across tumor types position it as a reusable capability for enterprise R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial bioenergetics as a functional readout for target validation in oncology.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying OXPHOS and electron transfer in tumor tissue.
- Facilitates portfolio triage by revealing metabolic dependencies and vulnerabilities in tumor models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tumor homogenates for downstream high-resolution respirometry assays.
- Standardizes quantitative measurement of mitochondrial function for reproducible screening outputs.
- Enables assay scalability and platform reuse across species and tumor types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial functional readouts with disease-relevant tumor models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic insight into metabolic phenotypes.
- Facilitates biomarker development through quantitative assessment of mitochondrial activity.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the oncology discovery continuum from early target validation through preclinical model characterization, supporting both hypothesis testing and translational research.
- Discovery Biology: Quantifies mitochondrial respiration to clarify metabolic pathway involvement in tumor progression.
- Screening: Provides standardized, reproducible functional assays for compound evaluation in tumor homogenates.
- Analytics: Delivers quantitative oxygen consumption and electron transfer measurements for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by enabling functional biomarker assessment in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable protocol adaptable to diverse tumor types and research questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in metabolic target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of mitochondrial functional assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust functional readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets based on metabolic phenotype.
Implementation Considerations
- Requires technical proficiency in tissue homogenization and high-resolution respirometry.
- Demands access to specialized instrumentation and analytical infrastructure for oxygen consumption measurement.
- Necessitates cross-team standardization of tissue handling and assay protocols for reproducibility.
- Adaptable across species and tumor types, but normalization strategies may vary by model system.
- Sample preparation and instrument calibration are critical for reliable quantitative outputs.
