整合型细胞信号分析工具包：力学、运动、形态与荧光

贴壁细胞会对其周围环境施加作用力，这些力包括细胞对基底施加的力（图中以绿色显示）以及细胞对邻近细胞施加的力（图中以红色显示）。这些力可通过一种称为单层应力显微镜的技术在细胞单层中进行测量。简而言之，该技术包括制备含有微小荧光微球的水凝胶，这些微球位于凝胶顶部表面下方，同时在玻璃表面固定较大的荧光微球。

在此水凝胶上，可观察细胞并培养至汇合状态或任何需要测量力的细胞状态。力的测量需要对细胞单层进行成像，获取细胞的透射光图像以及微米和大尺寸微珠的荧光图像。这些图像均在同一焦平面上采集。

这些图像是在细胞附着于水凝胶和从水凝胶上脱离时采集的。通过比较这两组图像，我们可以获得量化所有这些力所需的数据。这正是AcTrM和AnViM发挥作用的地方。

接种细胞后，若需在任意理想时间点对完全相同的位置进行成像，该操作流程可被编程输入至 AcTrM 中，随后用于分析数据并可视化结果，这正是 AnViM 的设计目的。接下来几分钟内，我们将为您演示如何获取汇合单层细胞的图像。操作步骤零会提示用户选择成像类型。

选择全新采集以开始新实验，或选择继续采集以恢复之前的实验。点击“全新采集”以创建位置列表。操作步骤一将列出您接下来的所有步骤。

这些操作将在阶段位置列表窗口中进行。在 Micro-Manager 中点击“实时”以查看样品并进行手动调整。在实时视图中，我们将观察相位。

此处结果清晰可见。现在需要观察珠子，此处珠子可在荧光下观察到。

因此请选择适用于上层微珠的通道。同时，您也需要能够看到一些下层微珠，因此我们来看一下下层微珠的通道。此处您看到的是下层微珠的模糊图像，只要能辨认出下层微珠的存在即可，而在此图像中您完全可以做到这一点。

选择位置列表，点击“标记”。这就是创建位置列表的方法。在创建位置列表后（如上一个视频所述），请使用多维采集窗口按照操作步骤二中列出的步骤进行操作。

假设我们要进行长时间的延时成像。在这里，我将设定需要采集的图像数量。第一个通道将是相差通道。

接下来是上层珠子，再下一个是底层珠子。在多维采集窗口中点击“关闭”，然后在AcTrM第二步中点击“确定”。输出结果将保存在多维采集窗口中指定的目录中。

第三步操作将询问实验是否需要恢复。答案通常是“是”。此处 iTACS 会进一步询问，我们是否需要执行精细恢复？

第一部分将使我们接近精确的复位效果，而底部区域将进一步提高复位的准确性。如果复位将使用有限视野进行，则可选择此选项，但在本实验中，我们不会选择该选项。至此，一组参考图像的采集已完成，可以关闭 Micro-Manager。

进行图像采集时，需先启动 AcTrM。选择放大倍数，并选择包含数据文件夹的目录。选择用于重新定位载物台的位置选项以及用于重新定位的通道。

提供一个界面，用于将摄像头当前所见内容与已保存的图像进行匹配。如果存在重叠，图像将显示红色、绿色以及黑色，并可进行手动调整。否则，点击接受，采集将继续进行。

现在我们可以启动 FIJI。在标记为预处理的 MSM 下拉菜单中选择第一个选项，然后选择包含 tnimgs 文件夹的文件夹。

接下来，我们需要确定每个通道对应的是哪幅图像。在此示例中，通道 0 是透射光图像，即细胞的相差图像。底部微珠图像为通道 2，顶部微珠图像为通道 1。

然后，系统会询问细胞跨越的位置以及图像的哪一侧。本例中，细胞为单层，正向右侧边缘移动，因此我们将取消选择“右侧”，然后继续。此处顶部珠子的一个小区域位于单层细胞较远的位置，其作用与底部珠子图像相同，而底部珠子图像相比此处显示的会显得更稀疏且更大。

现在系统会询问我们是否需要调整亮度和对比度，以便使微珠清晰可见。我们可通过菜单中的滑动条进行调节，当微珠清晰显现后，点击“确定”。接下来，我们将进行位置校正。如果存在任何位移，该步骤将予以消除。

完成后，系统将创建分析文件夹。在分析文件夹内，会生成位置文件夹 P0，而之前预处理菜单中所做的选择则存储在“分析选择”中，例如所跨越的边界、像素大小、哪幅图像是相差图像等其他设置。在单层应力显微镜（MSM）下拉菜单中，选择 MSM 凝胶形变。

接下来，我们将选择适合我们微珠分布的选项。在数据处理过程中，您会看到在位置文件夹中出现了一个新的位移文件夹。所有输出文件都将存储在此处。

这表明分析已完成。接下来，我们将探讨如何计算单层细胞中细胞-细胞外基质连接处、细胞-细胞连接处以及各个细胞的细胞骨架所受的作用力。为此，请选择第三个选项。

然后选择包含 tnimgs 和 analysis 文件夹的目录，这意味着应选择示例目录，而不是这些目录中的任何一个。点击“选择”后，系统会询问您：“该凝胶的剪切模量是多少？”本示例中，剪切模量为 1250，水凝胶的厚度为 118 微米。

此处提供了预期的噪声水平。接着是平均位移为零的标志，在本例中该标志未被选中。单击“确定”后，将通过 MATLAB 函数执行计算牵引力的实现过程，这也是 AnViM 当前版本中的实现方式。

现在可以开始计算细胞间或细胞骨架的受力。首先需要确认的问题是：单层细胞是否已达到汇合状态？在本例中，我们观察到细胞单层正在向前推进，图像帧的右侧存在一个无细胞区域。

因此答案是单层细胞未达到汇合状态，所以我们选择“否”。现在要求我们在最大的非细胞物体周围绘制一个多边形。我们选择适当的分割方法。

此处要求我们标注方法三和方法四中细胞的颜色，这里的细胞为黑色，因此我们选择黑色。这些不同方法生成的分割结果在细胞单层中会留下一些孔洞，以及在无细胞区域出现一些白色区域。在此我们可以选择“自动填充斑点”并点击“确定”。现在，单层细胞以及无细胞区域中的所有斑点均已填充完毕。

然后，我们将计算细胞单层中的力学应力。我们已经完成了第一部分，即从无细胞区域中分割出细胞，因此本步骤从第二部分开始，即对图像中的单个细胞进行分割。需选择对单个细胞的分割。

此处要求我们选择位置目录。这些参数还提供了更多信息。然后，系统会要求您在最小的正常细胞周围绘制一个多边形。

因此，此处绘制的内容将用于计算面积，并规定任何小于此面积的物体不被定义为细胞。接下来，系统会要求确定最大的细胞。然后，我们在最大的正常细胞周围绘制一个多边形，随后系统会询问哪一个更亮？

细胞与细胞之间的界面更亮，还是细胞中心更亮？在这种情况下，细胞与细胞之间的界面更亮，因此我将选择细胞-细胞界面。这表示计算已经完成。

首先选择细胞强度图谱。iTACS 会提示用户选择位置目录，即 P0 文件夹。完成后，点击选择。

然后，系统会询问用户是否希望 iTACS 检测细胞分裂或定量细胞荧光。在本例中，由于细胞内没有任何荧光蛋白，因此我们将选择检测细胞分裂。下一张幻灯片允许用户定义邻近区域的大小，这是 AnViM 执行的一种独特分析方法，它不仅考察单个细胞的特性，还分析该细胞周围邻近区域的特性。

此处，用户可以选择细胞邻近区域的宽度。在本例中，我们将邻近区域定义为60像素。第一个复选框询问我们是否希望iTACS收集细胞的属性，是的，我们需要；而这个复选框询问我们是否希望iTACS收集邻近细胞的属性，是的，我们也希望iTACS执行此操作。

在这些复选框下方，iTACS 提供了有关复选框的更多信息，供希望了解每个复选框详细信息的用户参考。这表示分析已完成。同样，iTACS 会提示用户选择位置目录。

然后，用户可以选择映射力数据、创建力数据图像、映射速度数据，以及创建速度数据图像。需要注意的是，生成图像需要一定时间，因此用户可选择立即生成或稍后进行。这就是为何系统会提供选项，允许用户自行决定是否进行这些操作。

此处，iTACS 会再次要求用户确定邻近区域的大小，您可以使用之前在映射强度时确定的相同尺寸，本例中为 60 个像素。同样，系统会提示用户收集细胞及其邻近区域的各项属性。这表明分析已全部完成。

在单层应力显微镜（MSM）下拉菜单中，选择结果轨迹数据。首先，iTACS 会提示用户选择位置目录，即 P0 文件夹。完成后，点击“选择”。

此处，iTACS 询问用户希望从哪一帧开始跟踪数据。通常从第二帧开始跟踪是较为稳妥的，因为第一帧无法计算速度。此处，iTACS 要求用户指定同时填充的最大图表数量。

这实际上是一种加快数据追踪的方法。完成后，单击“确定”，系统将以类似于生成热图选项的方式，显示追踪过程中选择变量的选项。窗口顶部的文本框中提供了常见的关注属性。

但如果您希望自定义变量，只需删除文本框中的所有内容，并选择下方列出的特定属性。在单层应力显微镜（monolayer stress microscopy，MSM）的下拉菜单中，选择结果图（results plot）。随后，iTACS 会询问用户是否希望将绘图限制于具有连续轨迹的细胞。

如果您不希望将绘图限制在连续轨迹上，请点击“否”。但如果您希望仅对具有连续轨迹的细胞进行绘图，请点击“是”。此时，iTACS 会询问用户希望程序绘制多少个变量。iTACS 最多可绘制三个变量，而在此案例中，我们将仅绘制两个变量，以观察这些因素之间的关系。在单层应力显微镜（MSM）下拉菜单中，选择结果图像。

这是位置目录，完成后点击“选择”。iTACS 随后会提示我们选择起始帧。此处我们选择了第二帧。

制作热图的选项以类似于绘制单个细胞时间轨迹的方式呈现。至此，我们已介绍完如何制作热图。此处展示的是细胞编号一的细胞在细胞骨架张力条件下的细胞速度时间轨迹。

各项属性显示在共用的垂直轴上，水平轴表示时间点编号，其中图像帧以每15分钟间隔采集。第二个输出为实验进行一小时后的热图数组。此处显示的属性包括单个细胞的铺展面积、取向、圆度、速度、运动方向、最大张力取向、细胞骨架张力、基底牵引力以及张力各向异性。

因此，这仅展示了其中一组实验。在其他多种实验情境中，AnViM 和 AcTrM 也能帮助用户以可重复的方式开展实验，相关应用场景已在论文中列出。iTACS 的一些关键特性包括实验流程的自动化、数据的自动分析，且无需使用者具备工程学背景。