Name: 基于化学发光的检测方法，用于检测自氧化和亚硝化化合物中的一氧化氮及其衍生物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学习使用化学发光检测法测量一氧化氮及其代谢产物。该方法具有高灵敏度，可检测生物样本中一氧化氮水平的微小变化，适用于神经科学、生物化学和药理学研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本手稿中报告的实验方案得益于马萨诸塞州总医院麻醉科重症监护麻醉研究实验室Warren Zapol博士实验室此前多位研究员的累积贡献。我们感谢Akito Nakagawa、Francesco Zadek、Emanuele Vassena、Chong Lei、Yasuko Nagasaka、Ester Spagnolli和Emanuele Rezoagli博士所做出的贡献。

L.B. 作为溶血和一氧化氮研究项目的首席研究员，获得美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（NHLBI NIH）K23 HL128882项目的薪金支持。L.B. 还获得乔治梅森大学莫卡特斯中心“新冠研究快速资助”（Fast Grants for COVID-19 research）以及iNO Therapeutics LLC公司提供的资助。B.Y. 获得美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（NHLBI）#R21HL130956项目以及美国国防部/日内瓦基金会（DOD/The Geneva Foundation，项目编号：W81XWH-19-S-CCC1，日志编号：DM190244）的资助。B.Y. 在麻省总医院（MGH）获得有关一氧化氮电化学生成技术的专利。
L.B. 和 B.Y. 已为一氧化氮递送在 COVID-19 疾病中的应用提交专利申请，PCT 申请号：PCT/US2021/036269，申请日期为 2021 年 6 月 7 日。RWC 作为技术开发项目的首席研究员，从 Unitaid 获得薪资支持，该项目旨在为资源匮乏地区儿童的结核病分散式诊断提供技术支持。

由于灵敏度较高，基于化学发光的NO及相关化合物检测方法存在较高的NO2-污染风险。实验中使用的每种试剂（尤其是NO2-阻断液）和稀释液（包括ddH2O）均应检测其NO2-含量，以校正背景信号。亚硝酸盐在全血中的半衰期约为10分钟，具有极高的反应活性，并迅速生成NO3-。因此，采血与离心或NO2-阻断之间的时间间隔可能导致分析前误差，应尽可能缩短15。在使用血浆样本的检测中，建议将血液采集至肝素抗凝管中，在加入40 μL由250 mg NEM溶于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）配制而成的200 nM NEM溶液封闭巯基后，于4 °C以750 × g离心5分钟。该储备液可保存于4 °C。某些抑制一氧化氮合酶（NOS）的化合物，如硝基精氨酸、硝普钠和硝酸甘油，会缓慢且非定量地转化为NO，导致基线升高。如果研究中需使用NOS抑制剂，建议选用不...

自从 Salvador Moncada 以及诺贝尔奖得主 Robert Furchgott、Louis Ignarro 和 Ferid Murad 确定一氧化氮（NO）即先前已知的内皮源性舒张因子（EDRF）以来，NO 在血管生物学、神经科学、代谢以及宿主反应等多个关键机制中的核心作用已被确立1,2,3,4,5,6,7。外源性给予 NO 气体已成为治疗新生儿因肺动脉高压导致呼吸衰竭的成熟疗法8。一氧化氮气体还被研究用于呼吸道合胞病毒（RSV）感染、疟疾及其他感染性疾病、缺血-再灌注损伤的治疗，以及用于接受心脏手术患者急性肾损伤的预防9,10,11,12。由于机制研究和干预性研究的需要，必须采用精确的检测技术来评估 NO 及其代谢物、靶蛋白和相关化合物的水平。
由于一氧化氮（NO）具有高反应活性，其可能发生的反应取决于其生成和/或释放所处的生物基质。在不存在血红蛋白（Hb）或其他含氧血红素蛋白的情况下，NO 几乎完全被氧化为亚硝酸根（NO2-）。
2NO + O2 → 2NO2
NO2 + NO → N2O3
N2O3 + H2O → NO2- + H+
一氧化氮（NO）首先与分子氧（O2）发生自氧化反应，生成二氧化氮（NO2），并进一步与NO2反应生成三氧化二氮（N2O3）。一个N2O3分子与水（H2O）反应生成两个亚硝酸根离子（NO2-）和一个质子（H+）13。在全血中14,15，NO和NO2-会迅速转化为硝酸根离子（NO3-），因为这些分子可与血红蛋白中的氧化型血红素基团[Hb-Fe2+-O2或氧合血红蛋白（oxyHb）]强烈反应，生成NO3-。该反应同时伴随着血红素基团向高铁状态的转变[Hb-Fe3+或高铁血红蛋白（metHb）]：
Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-
红细胞（RBC）屏障以及内皮细胞附近的微环境是限制该反应的主要因素，使得内皮释放的一氧化氮（NO）中有小部分能够发挥内皮源性舒张因子（EDRF）的作用16,17。事实上，循环中的无细胞血红蛋白（Hb）已被证实可在实验和临床条件下破坏血管舒张功能17,18。在红细胞内部，根据氧合状态和NO2-浓度的不同，部分NO会与脱氧血红蛋白（Hb-Fe2+）反应生成亚铁-亚硝酰基血红蛋白（Hb-Fe2+-NO 或 HbNO）：
Hb-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO
在红细胞（RBC）15,17中，NO2-可通过还原Hb-Fe2+生成Hb-Fe3+，从而释放NO，而NO又可结合Hb-Fe2+-O2（优先结合）或Hb-Fe2+。
不应将NO衍生物的生成视为严格的单向过程，因为在各种组织中，通过不同酶的作用（例如肠道细菌或线粒体内，尤其在缺氧条件下），NO可以从NO2-和NO3-重新生成19,20。
不同量的一氧化氮（NO）的产生（或施用）会通过硫醇转硝基化反应，主要在亲核试剂存在下由N2O3生成S-亚硝基硫醇，形成NO+供体中间体（Nuc-NO+-NO2-）：
N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-
生成S-亚硝基硫醇的另一种可能性是氧化型硫醇的亚硝基化反应（NO与氧化型硫醇反应）：
RS• + NO → RS-NO
该机制以及NO2对巯基的直接氧化作用可能仅在特定条件下发生，相关条件已在其他文献中描述21。S-亚硝基硫醇的种类涵盖从小分子（如S-亚硝基谷胱甘肽）到含巯基的大分子蛋白质。S-亚硝基血红蛋白（S-NO-Hb）是由血红蛋白β链上保守的半胱氨酸残基（β93C）的巯基发生亚硝基化反应而形成的22。
S-亚硝基硫醇的生成与代谢是重要调控机制的组成部分，例如对谷胱甘肽、半胱天冬酶、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和雷诺丁受体的调控23,24,25,26,27,28曾被认为是体内一氧化氮（NO）生物学作用的主要介质，亚硝基化白蛋白（S-硝基-白蛋白）似乎是一种NO/NO+ 不具有任何特定附加生物学活性的转运蛋白29.
在测定特定生物样本于生物基质中释放的一氧化氮（NO）及其衍生物浓度时，需考虑酸度、氧合状态、温度以及试剂存在的特性。示例包括外源性给予的NO供体，以及在急性炎症情况下存在的过氧化氢（H₂O₂）。2O2) 与一氧化氮（NO）反应2 导致过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）等自由基的超常浓度生成-)21除了所采用的分析方法外，样本制备与储存的分析前阶段也至关重要。无法真实反映样本原始状态的下游反应 体内 不应预测、考虑或阻断NO活性。一个合理的例子是S-NO-Hb的不稳定性，在针对其进行测定时，需要对血液样本采取专门的处理方法。22.
基于化学发光的检测方法是检测一氧化氮（NO）及其主要代谢物水平的金标准[NO2-，一氧化氮3-，S-亚硝基化合物和亚硝酰铁复合物（Fe-NO）] 在包括组织匀浆在内的任何生物流体中30,31. 这些方法依赖于化学发光检测器（CLD），该装置用于容纳一氧化氮（NO）与臭氧（O₃）之间的反应3），生成一氧化氮（NO）2 激发态（NO2•）一氧化氮的松弛作用2• 产生一个光子，该光子被光电倍增管检测到，生成一个与采样气体混合物中一氧化氮含量成正比的电信号32CLD 的简化示意图如图所示。
<img alt="化学发光检测示意图，显示NO与O₃的反应；光电倍增管装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：一氧化氮气体化学发光检测仪的简化示意图。 基于化学发光法检测一氧化氮（NO）的原理是，每进入化学发光检测器（CLD）的一个NO气体分子，会按化学计量关系产生一个光子。该化学发光反应在专用反应室中进行，反应室由内置臭氧发生器提供臭氧（O₃），并通过连接外部泵使反应室保持负压，从而实现样品气体的持续稳定流入。O₃的生成3 需要双原子氧（O₂）2）由专用的 O 供应2 与CLD相连的气罐（其他制造商提供的CLD可在环境空气下运行）。在反应室内，采样气体中含有的每个NO分子与氧气反应，生成一个处于激活态的二氧化氮分子（NO2*). 通过返回其基态，每个NO2* 分子释放一个光子，该光子由位于反应室旁边的光电倍增管（PMT）检测。PMT 与配套的放大器和中央处理单元产生一个与光子计数及反应室中 NO 分子数量成正比的信号。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
化学发光检测器（CLD）的样品入口可连接至含有液体样品反应室的玻璃装置系统。该系统持续用惰性气体（如氮气、氦气或氩气）吹扫，将一氧化氮（NO）从反应室转移至CLD。液相样品通过专用膜注入吹扫容器中。
<img alt="化学气体系统示意图，显示吹扫装置、NaOH 洗气瓶和气体流动设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：用于基于化学发光法检测一氧化氮气体的吹扫装置结构 吹扫装置（右侧）可用于检测一氧化氮（NO）气体，或任何在从液相试剂释放后可轻易转化为 NO 气体的化合物。惰性气体入口连接至惰性气体源（气瓶），如氩气、氙气或双原子氮气（N2）。针阀（向左打开）用于控制吹扫装置内的压力，必要时可完全拆卸以清洗装置。进样口由带隔膜垫的盖子密封，用于样品注入，隔膜应经常更换。加热套包裹反应室，并连接至热水浴，以进行 VCl3 在 HCl 中的测定。吹扫装置出口连接至化学发光检测器（CLD）或 NaOH 洗气瓶（VCl3 在 HCl 测定中必需使用）。要排空反应室内容物，首先关闭惰性气体入口和吹扫装置出口的旋塞，关闭针阀，取下进样口的盖子，最后打开排液口的旋塞。当进行 VCl3 在 HCl 中的测定时，由于 HCl 具有腐蚀性，必须在吹扫装置与 CLD 之间串联安装 NaOH 洗气瓶（左侧）。CLD 的连接处始终需要在 CLD 与吹扫装置出口（或所用的 NaOH 洗气瓶出口）之间安装强场介电（IFD）过滤器。IFD 过滤器可去除空气中的颗粒物，并阻止液体通过吹扫装置。PTFE = 聚四氟乙烯。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
因此，任何能够通过特定且可控的化学反应转化为NO的化合物，均可在各种生物液体和组织匀浆中被高灵敏度地检测到24。气相NO的直接测定可通过化学发光法在实验和临床环境中进行。这些技术在其他文献中已有详尽描述33,34,35。通过将样品加入含三碘化物（I3-）的反应体系中，可测定NO2-、S-亚硝基硫醇、S-亚硝基化蛋白以及Fe-NO复合物，该反应可按化学计量关系从上述所有化合物中释放出NO气体：
I3- → I2 + I-
2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O
I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+
2NO+ + 2I− → 2NO + I2
而 I3- 不与 NO3- 发生反应15。通过使用酸化磺胺（AS）有或无氯化汞（HgCl2）对样品等分试样进行预处理，可实现对每种化合物的精确定量。具体而言，使用 AS 预处理可去除所有 NO2- 含量。因此，化学发光检测器（CLD）测得的 NO 含量仅反映 S-NOs 与 Fe-NOs 浓度的总和。在加入 AS 前，向样品等分试样中注入 HgCl2，可使 S-NO 释放出 NO2-。随后经 AS 处理（导致 NO2- 被去除），可确保所测得的 NO 含量仅反映 Fe-NOs 的浓度。通过对各测定结果进行一系列差值计算，即可精确得出三种 NO 衍生物的浓度22。
<img alt="静态平衡图；化学分析方法；流程图；NO₂⁻、S-NOs、Fe-NOs 分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63107/63107fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：乙酸中 I3- 化学发光法样品制备步骤。 图示为乙酸中 I3- 化学发光法的逐步样品制备流程。必须使用避光离心管。试管 1、2 和 3 用于本分析法的样品准备。若需测定硝酸盐（NO3-），则需另取一份样品（试管 4）用于 HCl 中 VCl3 分析法。步骤以红色数字标示。在加入样品前，按指示预先加入磷酸盐缓冲液（PBS）或 HgCl2（步骤 1）。按指示加入样品体积（2），涡旋混匀，并在室温（RT）孵育 2 分钟。按指示加入 PBS 或酸化磺胺（AS）（3），涡旋混匀，并在室温孵育 3 分钟。进行检测（4）。该检测所测得的浓度为各试管下所列化合物浓度的总和。试管 1 可同时检测亚硝酸盐（NO2-）、S-亚硝基硫醇（S-NO）和铁-亚硝基复合物（Fe-NOs）的信号。为测定硝酸盐（NO3-），样品需同时进行乙酸中 I3- 和 HCl 中 VCl3 两种检测，试管 4 测得的数值应减去试管 1 的数值。*建议用于血红蛋白分析以测定残留 NO2-、S-亚硝基血红蛋白和铁-亚硝基血红蛋白的用量。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63107/63107fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
对于硝酸根（NO3-）的测定，使用盐酸（HCl）中的三氯化钒（VCl3）在吹扫容器中将 NO3- 转化为 NO，以便通过化学发光检测器（CLD）对 NO3- 进行化学计量测定：
2 NO3- + 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + 4H+
为了实现足够快的转化速率，反应需在90-95 °C下进行。NO3-还原为NO2-的过程与HCl存在下NO2-进一步还原为NO的过程相偶联。金属钒也可还原S-亚硝基化合物，释放其NO基团22,36。使用HCl中的VCl3通过CLD测得的最终浓度反映了NO3-、NO2及其他亚硝基化化合物的总浓度。将该值从I3-存在下CLD测得的浓度中减去，即可计算出NO3-的浓度36,37（图3）。
在NO消耗测定实验中，NO供体如(Z)-1-[2-(2-氨基乙基)-N-(2-铵乙基)氨基]重氮-1-烯-1,2-二醇盐（DETA-NONOate）在吹扫装置中持续释放NO，产生稳定信号，可用于定量注射样品中的无细胞氧合血红蛋白（oxyHb）。吹扫装置中消耗的NO量与样品中oxyHb的量之间存在化学计量关系38。
本文展示了在血浆样本中测定NO2-、NO3-、S-亚硝基硫醇、铁-亚硝酰基复合物以及无细胞血红蛋白对NO消耗的实验方案。针对红细胞环境中NO的研究，需要特定的样品处理，并结合排阻色谱法来测定极为不稳定的S-NO-Hb和Hb-NO，同时测定总血红蛋白浓度15,22。样品制备对于校正测定结果至关重要。H2O中NO2-的预先存在以及在检测过程中NO2-的释放，可能导致S-NO-Hb等NO衍生物的浓度被高估14,39。本文还介绍了样品制备中的关键要点。

<table><tbody><tr><td>乙酸</td><td>Sigma</td><td>45754</td><td>500 mL - 液体</td></tr><tr><td>抗泡沫剂B乳液</td><td>Sigma</td><td>A5757</td><td>250 mL - 液体</td></tr><tr><td>DETA NONOate</td><td>Cayman</td><td>82120</td><td>10 mg</td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1x)，无钙，无镁</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>盐酸 37% (1 M)</td><td>Sigma</td><td>258148</td><td>500 mL - 液体</td></tr><tr><td>碘</td><td>SAFC</td><td>207772</td><td>100 g - 固体</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>氯化汞(II) ACS级试剂&gt; 99.5%</td><td>Sigma</td><td>215465</td><td>100 g - 固体（溶于水）</td></tr><tr><td>Mili-Q 水纯化系统</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model 705 RN 50 &amp;mu;L 注射器</td><td>Hamilton</td><td>80530</td><td>微量注射器</td></tr><tr><td>Model 802 N 25 &amp;mu;L 注射器</td><td>Hamilton</td><td>84854</td><td>微量注射器</td></tr><tr><td>N-乙基马来酰亚胺</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td>25 g - 晶体</td></tr><tr><td>一氧化氮分析仪 + 套件软件 - 吹扫容器</td><td>Zysense</td><td>NOA 280i</td><td>化学发光检测器</td></tr><tr><td>Nonidet p-40&amp;nbsp; (NP-40)</td><td>ThermoFisher</td><td>85125</td><td>10% - 500 mL</td></tr><tr><td>六氰合铁酸钾(III) ACS级试剂&amp;ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>244023</td><td>100 g - 粉末</td></tr><tr><td>碘化钾 ACS级试剂&gt; 99%</td><td>Sigma</td><td>221945</td><td>100 g - 固体</td></tr><tr><td>硝酸钾晶体 分析纯 EMSURE ACS</td><td>Supelco</td><td>105067</td><td>250 g - 晶体</td></tr><tr><td>PowerGen 125</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-359-251</td><td>机械匀浆器</td></tr><tr><td>RV3 双级旋片泵</td><td>Edwards</td><td>A65201906</td><td>真空泵 - 与分析仪配套</td></tr><tr><td>肝素钠 - BD Hemogard Clo</td><td>BD Biosciences</td><td>BD367871</td><td>75 USP 单位</td></tr><tr><td>氢氧化钠无水 ACS级试剂 &amp;ge; 97%</td><td>Sigma</td><td>795429</td><td>1 kg - 颗粒</td></tr><tr><td>硝酸钠 ACS级试剂 &amp;ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>221341</td><td>500 g - 粉末</td></tr><tr><td>亚硝酸钠 &amp;ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>S2252</td><td>500 g - 晶体</td></tr><tr><td>磺胺 &amp;ge; 98%</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td>100 g - 固体</td></tr><tr><td>氯化钒(III)</td><td>Sigma</td><td>112393</td><td>25 g - 固体 - 注意（放热）</td></tr><tr><td>Whatman 1 号滤纸</td><td>Sigma</td><td>WHA10010155</td><td></td></tr></tbody></table>

基于化学发光的检测方法用于检测一氧化氮及其自氧化和亚硝化化合物衍生物

Chemiluminescence-based Assays for Detection of Nitric Oxide and its Derivatives from Autoxidation and Nitrosated Compounds

一氧化氮（NO）活性 体内 是其直接作用、由NO自氧化生成的衍生物的作用以及亚硝基化化合物效应的综合结果。测量NO代谢物对于研究NO在血管水平及其他组织中的活性至关重要，尤其是在给予外源性NO的实验条件下。基于臭氧的化学发光检测法能够精确测定液体（包括血浆、组织匀浆、细胞培养物）和气体混合物（如呼出气体）中的NO及其代谢物。NO与臭氧反应生成处于激发态的二氧化氮，随后释放的光信号可通过光探测器检测，并转化为反映样品中NO含量的电信号。同一样品的不同等分试样可用于测定特定的NO代谢物，如硝酸盐、亚硝酸盐、S-亚硝基硫醇和铁-亚硝酰复合物。此外，无细胞血红蛋白消耗的NO也可通过化学发光分析进行定量。本文对上述所有技术进行了图示说明。

在含有已知浓度无细胞氧合血红蛋白的样本中，采用无细胞血红蛋白（Hb）消耗一氧化氮（NO）的检测方法（图4）。由于在该检测中，每摩尔氧合血红蛋白的血红素可按化学计量关系释放一摩尔NO分子，因此使用纯化的无细胞氧合血红蛋白建立该检测的校准曲线（补充图3）。
在心脏手术中脱离体外循环（CPB）的患者中，游离血红蛋白（通过比色法测定）与一氧化氮（NO）消耗之间的剂量-反应关系如图5所示。可以认为，在脱离CPB后，游离血红蛋白中处于Hb-Fe2+-O2状态的血红素基团浓度较高（图5，红色曲线），相比之下，在CPB期间接受NO治疗的患者中，仅有少数游离血红蛋白的血红素基团消耗NO（图5，绿色曲线）。
用于评估无细胞血红蛋白（H...

本文介绍了利用基于化学发光的高灵敏度检测方法来检测一氧化氮及其生物学相关衍生物的实验方案。

一氧化氮（NO）在体内的活性是其直接作用、由NO自氧化生成的衍生物的作用以及……共同作用的结果。

本方案使研究人员能够熟练使用化学发光检测仪测量一氧化氮代谢物，而无需现场配备专业人员或承担相关费用。基于化学发光的检测方法是检测任何生物样本中一氧化氮及其代谢物水平微小变化的最灵敏方法。吸入性一氧化氮是一种用于治疗多种疾病的治疗性气体。准确地将疾病进展和恢复过程与一氧化氮代谢物水平相关联至关重要。吸入型一氧化氮作为一种抗菌剂，在治疗呼吸道感染性疾病患者方面展现出良好前景。化学发光法有助于深入理解一氧化氮剂量及其代谢物与微生物学及病理生理学变化之间的关联。配制 DETA-NONOate 溶液时，将 10 毫克 DETA-NONOate 加入 610 微升 pH 7.4 的 PBS 中含 10 毫摩尔的氢氧化钠溶液中，配制成 100 毫摩尔的 DETA-NONOate 溶液，并置于冰上保存。接下来，将氧气管路连接至化学发光检测器，并根据文中提供的制造商说明，调节氧气罐压力。然后，将强场介电滤光片管路连接至化学发光检测器。在化学发光检测器界面上，启动液相检测的检测程序，确保氧气供应充足，检测器将开始采样，并以毫伏为单位的信号显示检测结果；否则将提示负向诊断信号。准备吹扫容器时，通过将针阀完全向右旋紧，关闭吹扫容器的三个端口，并关闭进样口和出样口的旋塞阀。取下吹扫容器的盖子。向反应室中加入足量的、适用于预定检测的试剂，确保用于注入样品的注射器针头能够接触到液柱，同时验证是否存在稳定且理想的基线。启动吹扫气体流时，应确保惰性气体钢瓶配备双级减压阀，并将惰性气体钢瓶连接至容器的气体入口。然后打开吹扫容器的出口，并调节减压阀使出口气体压力为每平方英寸1至5磅。然后，打开吹扫瓶的入口，缓慢打开吹扫瓶的针阀，使气体流入，并观察吹扫瓶内是否有气泡产生以确认气体流动。为调节气体流量，使用化学发光检测器测量强场介电滤光线路采集环境空气时的池压力。重新放置吹扫瓶上的瓶盖，并将强场介电滤光线路连接至吹扫瓶。使用针阀调节，使化学发光检测器处的细胞压力达到与环境空气中所记录相同的压力值。要启动化学发光信号采集程序，需将化学发光检测器的串行端口连接至已安装采集程序的计算机串行端口，然后运行分析程序。单击“采集”，然后选择用于保存数据文件的文件夹，输入文件名，再单击“保存”。在准备进样时，通过单击最小值和/或最大值按钮并输入所需数值，调节屏幕上的电压刻度，以控制目标基线。进行样品进样时，在吸取每个样品前，先用去离子水和蒸馏水至少冲洗注射器两次或更多次，并确保在擦拭纸上能顺畅排出水流。然后，将注射器插入样品管中，同时握住注射器和样品管使其靠近，缓慢拉动活塞至所需体积，注意避免吸入气泡或未均质化的固体成分。用实验专用擦拭纸清洁注射器针头，将注射器插入进样口的进样垫中。确认针头位于液相内后，将样品注入反应室。在软件程序中标记进样时，点击“样本名称”下方的灰色框，输入样本名称，然后点击“标记进样”，同时确认进样导致信号上升，或在无细胞血红蛋白检测中导致一氧化氮消耗下降。通过体外循环后化学发光法测定无细胞血红蛋白与一氧化氮消耗之间的剂量反应关系。可以认为，氧化状态的血红素基团浓度较高，能够清除一氧化氮。在接受体外循环期间使用一氧化氮的患者中，大部分血红素基团处于还原状态，不会消耗一氧化氮。游离血红蛋白浓度的测定结果显示，体外循环后12小时内其从血浆中的清除较为缓慢。然而，一氧化氮的消耗在15分钟时达到峰值，并不反映游离血红蛋白的清除过程。无细胞血红蛋白对一氧化氮消耗的线性回归曲线显示，在体外循环术后15分钟，以氧化型且消耗一氧化氮的血红蛋白为主，而在基线以及体外循环术后4小时和12小时，则以还原型血红蛋白为主。同时监测了一氧化氮气体给药对一氧化氮消耗的影响。当患者在术中和术后接受一氧化氮气体治疗时，体外循环后游离血红蛋白的升高并未伴随一氧化氮消耗的增加。结果表明，外源性给予的一氧化氮可还原大部分游离血红蛋白，并防止一氧化氮被清除。仅当所有条件保持相同时，该实验才有效。若液面高度超过反应柱，必须停止实验并重新进行校准。

chemiluminescence-based-assays-for-detection-nitric-oxide-its

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

基于化学发光的检测方法，用于检测自氧化和亚硝化化合物中的一氧化氮及其衍生物

本文提出了一些简单的方法，用于检测和评估细胞中活性氧的存在。...

癌症中活性氧（ROS）的产生与检测

一氧化氮（NO）的内源性生成调控着多种生物学功能。越来越多的研究表明，基于NO的信号传导发生中断或失调与许多人类疾病相关。定量检测相关NO代谢物的方法可能为人类疾病提供新的诊断或预后生物标志物。...

用于评估一氧化氮生物活性的分析技术

NADPH 氧化酶是吞噬细胞中活性氧（ROS）的主要来源。由于 ROS 具有短暂存在的特性，因此在活体动物中测量和监测 ROS 水平十分困难。本文描述了一种在活体小鼠中连续定量检测 ROS...

不同动物模型中NADPH氧化酶活性的生物发光成像

本文介绍了一种改良的相对简便的方法，利用荧光染料二氨基荧光素-2 二乙酸酯（DAF-2DA）和二氢乙啶（DHE），对肥胖小鼠模型新鲜分离的完整主动脉进行内皮表面（en...

En Face 法检测完整动脉内皮层中的一氧化氮和超氧阴离子

本方案描述了一种新的术中成像技术，该技术利用钌配合物作为化学发光光源，从而在成像过程中产生高信噪比信号 体内...

一种在生物环境中生成并观察化学发光的新技术

一氧化氮（NO）是血管稳态中一种重要的信号分子。NO的生成 体内 过低而无法直接测量。化学发光为研究一氧化氮循环提供了有价值的见解 通过...

使用化学发光法测定生物材料中一氧化氮通路代谢物亚硝酸盐和硝酸盐的含量

本手稿介绍了利用新型基因编码的一氧化氮（NO•）探针（geNOps）结合荧光显微镜实时监测单细胞内NO•动态变化的实验方案。通过将geNOps与化学钙离子（Ca2+）传感器结合，实现了对单个内皮细胞水平上由Ca2+触发的NO•生成过程的可视化观测。...

应用基因编码的荧光一氧化氮（NO•）探针geNOps对单细胞中NO•信号进行实时成像

我们介绍了三种不同方法的实验方案，用于匀浆大鼠骨骼肌组织中的四个不同肌群，以测定和比较硝酸盐和亚硝酸盐的水平。此外，我们比较了不同的样品重量，以研究组织样本量是否影响匀浆结果。...

大鼠骨骼肌匀浆制备用于硝酸盐和亚硝酸盐测定

捕获无核红细胞中蛋白质活化过程的动态变化存在方法学上的挑战，例如如何保存急性刺激引起的动态变化以供后续分析。本方案描述了样本制备和染色技术，可实现相关蛋白质变化的保存与分析，并支持后续检测。...

基于免疫染色的红细胞蛋白质动态变化检测

本方案描述了一种通过三碘化物化学发光法测定顶端分泌物中的亚硝酸盐，从而量化气液界面（ALI）分化培养的气道上皮细胞中一氧化氮（NO）生成的方法。...

气液界面分化的小鼠气管上皮细胞培养物中一氧化氮生成的测定

学习使用化学发光检测法测量一氧化氮及其代谢产物。该方法具有高灵敏度，可检测生物样本中一氧化氮水平的微小变化，适用于神经科学、生物化学和药理学研究。

基于化学发光的检测方法用于检测一氧化氮及其自氧化和亚硝化化合物衍生物

探索更多视频