Name: 由去细胞化肺切片制备的工程肺组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习利用去细胞化肺切片与肺泡上皮二型细胞、成纤维细胞及内皮细胞构建工程化肺组织的方法。该技术为再生医学研究提供了可重复的三维组织培养平台。

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作者感谢Lorenzo Sewanan和Jorge Nunez在开发本方案所用组织培养盒设计方面的工作，感谢Kaminski实验室提供振动切片机的使用，感谢Maurizio Chioccioli和Jessica Nouws在肺组织切片方面的协助，感谢Allie LaRocco在初始预实验中的帮助，以及感谢Hong Qian对本方案的仔细审阅。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金F30HL143880（K.L.L.）、医学科学家培训项目培训基金T32GM136651（K.L.L.）和U01HL145567（L.E.N.）的支持，以及Humacyte公司提供的无限制研究赠款（L.E.N.）。

本文所述所有动物实验程序均经耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 组织培养盒与接种浴槽的制备
注意：组织培养盒和接种浴制备完成后，可经高压灭菌并重复用于多轮 ELT 培养。
<ol>
	<li>组织培养盒
	<ol>
		<li>根据补充文件1和补充文件2中提供的设计，使用激光切割机将厚度为3/32英寸的聚四氟乙烯（PTFE）切割成组织培养盒的框架和夹片。根据补充文件3，使用激光切割机将厚度为1/16英寸的PTFE切割成组织培养盒的标签卡。使用30 W激光切割机，以80%功率和15%速度切割轮廓，重复切割3次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种浴槽
	<ol>
		<li>使用接种浴槽的CAD文件（补充文件4和补充文件5），分别采用透明树脂3D打印接种浴槽模具的底座和环形部件。</li>
		<li>使用前，将模具浸泡在含10%泊洛沙姆407的蒸馏水溶液中过夜，以利于聚二甲基硅氧烷（PDMS）脱模。取出后自然晾干，将环形部件套在模具底座上，并用柔性塑料薄膜包裹，以帮助防止泄漏。</li>
		<li>按10:1的比例将PDMS弹性体与固化剂混合，每套模具至少配制60 g聚二甲基硅氧烷（PDMS），然后倒入3D打印的模具中。将PDMS置于真空干燥器中脱气30分钟，以去除所有气泡。</li>
		<li>在60 °C下烘烤接种浴槽8小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 大鼠肺组织精密切割肺片的制备
<ol>
	<li>器官获取
	<ol>
		<li>准备一个包含重力驱动和泵驱动支路的分路灌注系统，如图1所示。将肺动脉（PA）插管连接至管路末端，该插管由一个1/16英寸带倒刺的Y型接头、一段½英寸长的LS 14硅胶管和一个3/32英寸雌性鲁尔锁接头组成（见图1）。此时不要在插管上安装单向阀。</li>
		<li>用含有100 U/mL肝素和0.01 mg/mL硝普钠（SNP）的PBS预充管路，分别用于抗凝和血管扩张。预先将灌注泵设定为30 mL/min。 
		注：将SNP新鲜加入肝素溶液中，并避光保存。</li>
		<li>对成年（8–12周龄，约300–350 g）Sprague-Dawley大鼠进行腹腔注射（IP）肝素400 U/kg以抗凝，随后注射氯胺酮（75 mg/kg）和赛拉嗪（5 mg/kg）进行麻醉。通过无有害刺激反应（如脚趾夹捏）确认达到外科麻醉深度。</li>
		<li>使用电动剃毛器修剪胸部和腹部毛发，然后喷洒70%乙醇，并用10%聚维酮碘擦拭3次。</li>
		<li>用鼠齿镊夹住膈肌水平以下的皮肤，用精细剪刀在皮肤上做一长约½英寸的横向切口。用镊子夹住暴露的腹筋膜，同样做一½英寸横向切口，然后将切口沿上腹部宽度方向延伸，贯穿皮肤和筋膜。</li>
		<li>用精细剪刀尖端在前部膈肌中央做一个小切口（不超过1/8英寸），使肺在胸腔内回缩。将膈肌切口横向完全延伸至整个胸腔宽度。</li>
		<li>沿肋骨向颈部方向做两条贯穿全高的纵向切口，注意避免损伤肺组织。将左侧肋骨切口延伸，切断锁骨并沿颈部侧面切至喉部水平，暴露气管。</li>
		<li>游离气管周围结缔组织及食管。在靠近喉部的两个软骨环之间，于气管前半部做一横向切口。将一根4-0聚丙烯缝线从气管后方穿过切口下方水平，松散地预打外科结的第一半（两圈扭转）。</li>
		<li>将一个由1/16英寸带倒刺Y型接头、单向单向阀和½英寸长LS 14硅胶管（末端为3/32英寸雌性鲁尔锁接头）组成的插管（见图1）插入气管，使Y型接头的一支沿切口方向朝肺部插入。</li>
		<li>将预打的缝线环置于插管插入部位的气管水平，收紧缝线固定Y型接头位置，再加两个单圈结扎完成打结。</li>
		<li>用10 mL注射器抽取空气，连接至气管插管的鲁尔锁接口。</li>
		<li>用弯止血钳夹闭靠近膈肌的下腔静脉，然后通过右心室（RV）注射150 U肝素（1000 U/mL）。</li>
		<li>部分打开重力灌注支路的旋塞阀，使步骤2.1.1中准备的PA插管缓慢而稳定地滴出PBS/肝素/SNP溶液。</li>
		<li>将4-0聚丙烯缝线针从右心室（RV）发出的肺动脉（PA）根部后方穿过，在PA根部用外科结的第一半预打一个松散的缝线环。</li>
		<li>使用精细剪刀在PA下方垂直于其走向处做一小切口（不超过1/8英寸），然后将PA插管Y型接头的一支插入PA根部。收紧缝线固定PA及插入的接头，并加一个单圈结完成外科结。 
		注：在流动条件下进行PA插管可防止空气泡进入血管系统，避免影响肺组织的有效冲洗。</li>
		<li>在PA导管Y型接头的另一端连接一个单向阀，然后剪除心脏心尖部分，使血液可通过左心室流出。 
		注：若在启动泵灌注前未剪除心尖，可能导致气血屏障受损，引起液体渗入肺泡腔。</li>
		<li>通过连接两支管路的旋塞阀切换至泵驱动支路，启动泵并设定流速为30 mL/min。在经PA灌注肺的同时，通过10 mL气管注射器手动通气，频率约为10–15次/分钟，以促进血液清除。持续灌注直至肺组织基本变白，通常需40 mL PBS/肝素/SNP或更少。 
		注：若肺内血液清除不充分，可能影响后续脱细胞处理效果。</li>
		<li>在气管插管上方水平处切断后部气管，然后彻底游离肺和心脏周围残留的结缔组织，整块取出肺和心脏（en bloc）。</li>
		<li>用10 mL注射器吸取2%低熔点琼脂糖溶于无酚红Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，预热至42 °C。 
		注：所需琼脂糖的确切体积因肺大小而异。较大肺（例如来自体重超过400 g的大鼠）需要超过10 mL的琼脂糖。</li>
		<li>通过气管插管手动向取出的肺注入10 mL空气，重复3次（即&#160;达到约总肺容量），以帮助复张塌陷的肺实质。</li>
		<li>立即通过气管插管以约40 mL/min的速度手动注入已准备好的琼脂糖，直至肺叶最远端完全膨胀。若远端区域仍有塌陷，可额外注入1–2 mL琼脂糖。</li>
		<li>将四通旋塞的白色帽盖连接至气管插管的雌性鲁尔锁接口，封闭气管。将肺置于盛有冰块的150 mm培养皿中，使琼脂糖凝固。 
		注：取出后尽快充气对确保肺实质均匀填充及后续成功切片至关重要。若肺充气极不均匀，则不应继续切片，否则切片质量将较差。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肺组织切片 
	注：精确的切片程序可能需要根据所使用的振动切片机（vibratome）进行调整；已有文献报道了使用不同组织切片机制备PCLS的其他示例32,33,34。
	<ol>
		<li>将金属冷却块预冷至-20 °C，在非使用期间保持置于冰上。</li>
		<li>使用少量氰基丙烯酸酯胶水将刀片固定在刀片架上。使用内六角扳手小心将刀片架安装到振动切片机上，使其与插入缓冲槽中的样本管末端对齐。</li>
		<li>准备6孔板，每孔加入3 mL无酚红的无菌冰浴HBSS，用于收集切片。</li>
		<li>使用手术刀切割一块约1–1.5 cm3的肺组织。 
		注：左肺下叶和中叶以及右肺中叶和下叶的组织最易获得较大的组织切片，从而最大化肺泡面积。若存在未充气区域或结缔组织区域，可用剪刀修剪去除，或将该部分朝下放置于推杆方向；此类组织通常难以整齐切割。</li>
		<li>在样本管推杆上滴一小滴氰基丙烯酸酯胶水。将肺组织在纸巾上轻蘸以去除多余水分，然后立即用镊子将其放置在推杆顶部。</li>
		<li>将样本管的金属套管向上滑动至组织顶部水平并固定，此时推杆处于回缩状态。用移液器将预热的2% HBSS琼脂糖溶液注入管顶，完全包围组织。</li>
		<li>将冰浴冷却块围绕组织放置约1分钟，使琼脂糖凝固。</li>
		<li>将样本管插入缓冲槽中，向槽内加入冰浴PBS至组织块一半高度。将电机盒开关拨至快进（FF）位置，推动电机盒推杆直至刚好接触样本管底部。</li>
		<li>设定所需的切片厚度、切割速度和振荡频率，例如450 µm厚度、速度4、振荡频率5。选择连续模式，然后将开关拨至开启开始切片。</li>
		<li>当组织切片落入缓冲槽时，使用接种环或刮铲将其转移至已准备好的6孔板中。</li>
		<li>当样本管中剩余组织厚度约为2 mm时停止切片，以避免损坏刀片或切割到含胶水的组织。</li>
		<li>根据需要重复上述步骤，切取更多肺组织。</li>
		<li>立即对切片进行脱细胞处理以制备支架，或速冻后于-80 °C保存最多2个月。冷冻时，将4–6个切片转移至35 mm培养皿中，小心吸除切片周围的多余液体。将培养皿置于干冰与100%乙醇混合浴中速冻，然后用铝箔包裹，密封于塑料袋中，转移至-80 °C保存。 
		&#8203;注：切勿将新鲜切片直接放入-80 °C冰箱，因冷冻速率相对较慢可能导致冰晶形成，从而损伤组织。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 肺组织支架的制备
<ol>
	<li>材料与脱细胞溶液的准备
	<ol>
		<li>将支架、夹子和标签进行高压灭菌。</li>
		<li>按照表1所述配制脱细胞溶液。 
		注意：使用前立即向预热的缓冲液中加入苯甲酸核酸酶，并进行无菌过滤。Triton X-100 和脱氧胆酸钠（SDC）溶液应在脱细胞操作前 24–48 小时内配制。抗生素/抗真菌剂溶液和苯甲酸核酸酶缓冲液可提前 30 天配制，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肺组织切片的切割与夹持 
	注意：虽然切割和夹持步骤可在实验台非无菌条件下进行，但第 3.3 节中的脱细胞步骤以及后续所有对组织支架的操作均必须在层流罩内完成。
	<ol>
		<li>在直径 100 mm 的培养皿中加入约三分之一体积的 PBS。用镊子将盒式支架（每个含两个夹子）和标签转移至培养皿中。</li>
		<li>若使用冷冻切片，每次仅解冻一个培养皿，将室温 PBS 倒入培养皿中以浸没切片，其余培养皿保持在干冰上。</li>
		<li>将解冻后的切片转移至直径 150 mm 的培养皿中。如有需要，使用精细镊子轻轻展开切片，使其平铺，然后小心吸除组织周围的多余 PBS。</li>
		<li>使用剃须刀片并以直尺为引导，将刀片全长紧贴培养皿底部，刀刃固定位置后轻微左右摆动，从切片上切下一条 3 mm 宽的组织条。或者，可使用改装了两个平行刀片的旋转切割器，两刀片之间用 3 mm 的定制间隔物（例如聚甲醛 [聚氧亚甲基]）隔开，以切割组织条。避免切到撕裂处、孔洞、大支气管或血管，以及厚的结缔组织。 
		注意：为确保夹持成功，组织条长度至少需达到 9 mm。</li>
		<li>用镊子将组织条转移至已准备好的 100 mm 培养皿中。</li>
		<li>将组织条夹入盒式支架中：将组织漂浮于支架上方，使其居中并对准两端夹子上的孔洞，使组织略微悬垂于孔外。用精细镊子将一个标签部分插入一端的孔中，轻轻拉直组织，再插入第二个标签。双手各持一把镊子，将两个标签完全压入孔中以固定组织。 
		注意：若在夹持前难以固定组织位置，可吸除部分 PBS 以降低液面高度。安装第二个夹子时注意不要拉伸组织，以免造成撕裂。</li>
		<li>根据需要，重复步骤 3.2.2–3.2.6 进行多次组织的解冻、切割和夹持。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织切片脱细胞
	<ol>
		<li>所有切片夹持完成后，将装有支架的 100 mm 培养皿转移至层流罩内。</li>
		<li>开始脱细胞方案的第一步（见表2）：使用弯头止血钳夹住每个支架的凹槽侧边，将支架转移至 6 孔板中（每孔 2 个组织），每孔加入 3 mL 含离子和抗生素/抗真菌剂的 PBS（溶液配方见表1）。</li>
		<li>将 6 孔板置于摇床上，30 rpm 振荡 10 分钟。</li>
		<li>继续进行脱细胞方案的第二步（见表2）：吸除每孔中的液体，更换为每孔 3 mL 含离子的 PBS，将板置于摇床上以 30 rpm 振荡，并孵育 5 分钟。</li>
		<li>按照表2中脱细胞方案所列的溶液种类和对应时间，重复步骤 3.3.4。</li>
		<li>完成含抗生素/抗真菌剂的 PBS 最终冲洗步骤后（表2第 20 步），将组织转移至装有新鲜含抗生素/抗真菌剂 PBS 的无菌 6 孔板中，在 37 °C 孵育 48 小时。 
		&#8203;注意：经抗生素/抗真菌剂灭菌后，肺组织支架可立即接种细胞，或于 4 °C 保存最多 30 天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 组织切片再细胞化与培养
注意：图2 展示了组织接种与培养的建议时间线，其中先将切片接种大鼠肺微血管内皮细胞，并在低血清内皮细胞培养基中培养；随后接种大鼠AEC2细胞和大鼠肺成纤维细胞，并使用无血清AEC2生长培养基（改编自Jacob等13和You等35）；有关细胞来源的附加说明见结果部分，培养基详细信息见表3。该策略可生成包含AEC2单层的肺泡样结构。
<ol>
	<li>准备接种用组织支架（第 -4 天或 -3 天）
	<ol>
		<li>若使用储存在 4 °C 的组织支架，接种前需在 37 °C 下用新鲜 PBS + 抗生素/抗真菌剂（PBS 中含 10% 青霉素/链霉素、4% 两性霉素 B、0.4% 庆大霉素）孵育过夜。</li>
		<li>用无菌 PBS 清洗支架 3 次（每次 5 mL/孔），每次 5 分钟。</li>
		<li>在相差显微镜下以 5 倍放大倍数观察支架，选择适合接种的组织。 
		注意：最佳接种支架应无撕裂或孔洞，且不含大支气管或大血管。尽管具有上述结构的支架也可成功接种，但其再细胞化模式可能与肺泡区域的观察结果不同。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>内皮细胞接种（第 -3 天）
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板计数内皮细胞，并在内皮细胞培养基（见表 3）中制备浓度为 5 × 106 个细胞/mL 的细胞悬液，确保细胞总量足以每片接种 500,000 个内皮细胞（例如，对于 12 片，将 6 × 106 个细胞重悬于 1.2 mL 培养基中）。</li>
		<li>将已灭菌的接种浴槽放入 100 mm 培养皿中。将清洗后的支架倒置转移至接种浴槽：使用精细弯头止血钳夹住盒式支架的带槽侧边，用直头止血钳或镊子夹住支架一端（注意不要触碰组织本身），翻转后，再用弯头止血钳的尖端通过带槽侧边的小孔夹住支架，将其放入接种浴槽的孔中。对剩余支架重复此操作。 
		注意：正确放置时，支架应居中且倒置位于每个孔的底部。如有需要，可用止血钳尖端轻轻按压支架一角，确保其平整贴合于孔底。支架放置不当可能导致组织接种效果不佳。孔内残留少量 PBS 是可接受的。</li>
		<li>轻轻混匀已制备的细胞悬液，然后使用手动移液器将 100 µL 细胞悬液直接滴加至每个孔底部的组织表面，注意避免移液枪头损伤组织。</li>
		<li>将接种后的组织转移至 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中孵育。</li>
		<li>2 小时后，使用手动移液器向每孔加入 900 µL 预热的培养基，然后放回培养箱。若加入培养基后支架盒浮起，可用移液枪头轻轻按压其一角，使其平整贴合于孔底。</li>
		<li>在第 -2 天更换培养基。通过倾斜培养皿，并将移液枪头轻置于孔的一角手动吸出培养基，注意不要扰动支架盒。每孔更换 1 mL 新鲜内皮细胞培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>AEC2 与成纤维细胞接种及组织培养（第 0 天）
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板计数 AEC2 和成纤维细胞。在 AEC2 生长培养基（上皮基础培养基 + AEC2 添加剂；见表 3）中制备 AEC2 与成纤维细胞 1:1 的混合细胞悬液，总细胞浓度为 5 × 106 个细胞/mL，确保细胞总量足以每片接种 500,000 个细胞（即 250,000 个 AEC2 和 250,000 个成纤维细胞）（例如，对于 12 片，将 3 × 106 个 AEC2 与 3 × 106 个成纤维细胞共同重悬于 1.2 mL 培养基中）。</li>
		<li>按照步骤 4.2.6 所述方法吸出接种浴槽每孔中的培养基。轻轻混匀细胞悬液，然后向每孔底部的组织表面直接滴加 100 µL 细胞悬液。 
		注意：在进行 AEC2/成纤维细胞接种前，孔内残留少量内皮细胞培养基是可接受的。</li>
		<li>将接种后的组织转移至 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中孵育。</li>
		<li>2 小时后，向每孔加入 900 µL 预热的 AEC2 生长培养基，然后放回培养箱。</li>
		<li>培养 24 小时后（第 1 天），准备 12 孔板，每孔每片加入 1 mL 预热的 AEC2 生长培养基。</li>
		<li>从接种浴槽每孔中吸出 800 µL 培养基。取出支架盒：用精细弯头止血钳通过带槽侧边的小孔夹住支架，转移至直头止血钳或镊子夹住其一端并翻转，再用弯头止血钳夹住带槽侧边，将支架正面朝上逐个转移至已准备好的 12 孔板中，每孔一片。</li>
		<li>从第 1 天起每隔一天更换 12 孔板中的培养基，直至第 7 天或达到所需培养时间：使用玻璃巴斯德吸管小心吸出每孔培养基，注意避免触碰组织；每孔加入 1 mL 新鲜 AEC2 生长培养基。 
		&#8203;注意：在整个培养期间，可通过 5 倍放大倍数的相差显微镜监测组织再细胞化的程度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 组织采集与样品分析
<ol>
	<li>为进行组织学和免疫荧光染色而固定ELT，将组织培养盒转移至10%中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下于摇床上孵育3-4小时。使用尖头镊子的尖端在组织与标签连接处剪切，将组织从盒中取出。按照常规方法进行石蜡包埋和组织学处理；无需特殊技术。</li>
	<li>为进行qRT-PCR处理ELT，先将培养盒中的组织用PBS冲洗2次，然后取出组织并速冻，或直接进行裂解以提取RNA。 
	注意：将至少2个接种了1 × 106 个细胞并培养7天的切片合并，应能获得足量RNA用于后续PCR分析。</li>
</ol>

L.E.N. 是 Humacyte 公司的创始人和股东，该公司是一家再生医学企业。Humacyte 利用同种异体平滑肌细胞生产工程化血管，用于血管外科手术。L.E.N. 的配偶持有 Humacyte 的股权，且 L.E.N. 本人在 Humacyte 董事会任职。L.E.N. 是多项专利的发明人，这些专利已授权给 Humacyte，并为其带来专利使用费收入。L.E.N. 曾获得一笔无限制的研究资助，用于支持其在耶鲁大学实验室的研究工作。Humacyte 未对本报告中研究的实施、描述或研究结果的解释产生影响。

本文介绍了一种利用脱细胞化精密切割肺组织切片作为体外构建工程化肺组织的平台，该平台可生成包含多谱系肺泡样结构的工程化肺组织。in vitro。通过结合我们先前开发的用于重建高保真无细胞ECM肺支架以进行全肺组织工程的策略22,31，以及我们成熟的微型工程化心肌组织培养系统30，本实验方案实现了以生理相关性良好的肺ECM作为组织培养基质，并以可重复且中等通量的方式进行应用。
本文所述方法详细介绍了从大鼠肺脏制备ELT支架的过程，大鼠肺脏易于获取，可被提取 整块 可直接进入完整的气道进行琼脂糖灌注，且肺的尺寸大于小鼠肺。然而，任何能够通过琼脂糖灌注并产生至少9 mm长组织切片的肺组织均可适用于本系统。无论组织来源如何，使用琼脂糖对肺组织进行均匀灌注是确保后续组织切片、夹持及操作成功最关键的步骤。灌注不足的肺组织难以获得清晰的切片，而过度灌注的组织则可能在夹持过程中发生撕裂。在琼脂糖凝胶化后，灌注适当的组织区域应质地坚实，但在用镊子轻压时可略有弹性。对于完整的鼠肺，我们发现：在取出肺组织后，先用空气预灌注数次，并在取出后尽快进行琼脂糖灌注，可获得最佳的切片效果及高质量的组织支架。琼脂糖的合适用量需通过实验经验优化；对于大鼠肺，将肺充气至总肺容量所需的琼脂糖体积约为30 mL/kg动物体重（例如，350 g大鼠的肺组织所需琼脂糖体积约为10.5 mL）。对于气道通路较不直接的较大切除肺组织（如来自人类供体的肺组织），可能需要通过支气管进行额外的调试以实现有效灌注。32在后续的肺组织切片过程中，将组织正确选择并定向放置于推杆上是另一个重要步骤，其目的为：1）确保切片足够大，能够制备出可夹入组织培养盒中的组织条；2）最大化实质（肺泡）组织面积，同时避免包含较大的气道或血管。
将PCLS剪切成组织培养夹具最初可能是一个具有挑战性的步骤，但夹具在脱细胞和接种过程中极大地简化了组织处理。可能出现的两个潜在问题是组织撕裂（可能发生在夹持过程中或脱细胞期间），或组织在夹具中的位置不当导致后续接种效果不佳（例如无接种，或仅在末端接种）。撕裂可能是由于琼脂糖过度膨胀、标签插入过程中组织过度拉伸，或标签插入时留出的边缘过短而无法提供足够的组织夹持力所致。需要注意的是，若切片在一端夹具处发生撕裂，仍可能成功接种，但在培养期间显微镜下观察较为困难，因为组织无法保持平整。组织接种不良（如图6C所示）很可能是由于切片未在两个夹具之间保持平整，导致翻转后与接种浴孔底部接触不良。另一个可能的原因是夹具未正确就位在接种浴孔的底部。在夹持操作方面，安装第二个夹具时可对组织施加稍大的张力，以帮助其保持平整。某些切片具有轻微的凹面；在这种情况下，应将切片的凸面朝上进行夹持。通过练习，我们通常的接种失败率低于2%。
本方案的一个局限性在于需要一些专用设备——激光切割机和3D打印机——以制备ELT所需的初始材料。然而，一旦组织培养盒和接种浴槽制备完成，后续步骤便不再需要其他特殊材料。肺组织切片及脱细胞化步骤耗时中等；但这些步骤可预先完成，或批量制备以同时满足多个实验的需求。单个肺脏可切割出大量PCLS（若优化 parenchymal 区域，可超过&#62;100片），并可速冻保存以备后续使用。尽管单次冻融循环可能对细胞外基质（ECM）造成轻微的超微结构损伤46，但已有研究表明，即使经历多次冻融循环，也不会导致ECM发生显著损失23,47。PCLS也可在实验前预先剪裁并完成脱细胞化处理，并在一个月内使用。（值得注意的是，本文所述的脱细胞化方案约需6小时即可完成，相较于以往需要一天或更长时间的方法具有显著优势27,28。）一旦支架制备完成，细胞接种过程简便快捷，且ELT的培养无需特殊技术。
所述ELT方法的一个局限性在于缺乏区域特异性接种，即无法将AEC2s特异性地递送至肺泡腔，或无法将内皮细胞特异性地递送至血管腔。尽管如此，尽管细胞只是简单地接种在组织支架的表面，再细胞化的模式却并非随机，而是呈现出一定程度的类似肺泡的结构组织，包括上皮环状结构。我们推测，细胞间的相互作用以及细胞外基质（ECM）组成和几何结构的局部差异20,21可能共同促成了所观察到的再细胞化模式。支持这一假设的证据来自一项先前发表的研究，该研究将成纤维细胞非特异性地接种到脱细胞肺组织切片上，结果表明，组织再定植的模式及相关细胞表型在显微组织区域和ECM支架来源（例如健康与病变组织）之间存在显著差异27。此外，成纤维细胞还被观察到会侵入间质区——这正是其在天然肺组织中的定位1,27。我们所能设想的、在真正区域特异性条件下于肺组织切片上培养细胞的主要替代方法，是通过气道31,48和血管腔49,50对完整的脱细胞肺进行接种，随后对再细胞化的组织进行切片。然而，这种替代方法存在以下问题：1）成本、时间和资源消耗显著更高；2）通量较低；3）需要使用更多的实验动物；4）由于全肺培养及接种后肺组织切片操作的技术挑战，污染风险增加。尽管ELT平台未能完全重现天然细胞组织的所有特征，但它使得更多实验室能够在生理相关的ECM基质上进行肺细胞培养。
ELT 系统的灵活性是该平台的主要优势，能够支持使用任意类型的组织支架、细胞或培养基进行小规模肺组织培养。使用来源于病变组织或损伤模型的支架可能有助于研究在疾病所致细胞外基质（ECM）改变背景下发生的细胞-细胞或细胞-基质相互作用27,29,51。但需注意，脱细胞化方案可能需要根据不同物种间的基质差异进行调整52。所述的接种策略适用于任何类型的细胞，且培养时间线可根据研究人员的具体需求进行调整。作为起始参考，每支架接种 1 × 106 个细胞可在培养 7 天内形成细胞密度较高的组织，而总细胞数为 1 × 105 时则导致细胞密度不足。在对时间线进行任何调整时，均应在最后一次组织接种后 24 小时将组织培养盒从接种浴中取出。本文中，为模拟肺泡部分细胞复杂性，我们描述了一种三重共培养的再细胞化策略，该方法可在类肺泡结构中维持新生小鼠 AEC2 细胞的良好分化状态至少 7 天。我们的结果还表明，成纤维细胞和内皮细胞均能在 ELT 中成功植入，突显了该培养基质的广泛适用性及其在共培养研究中的适宜性。在 ELT 中接种成体细胞可能有助于模拟更为静息状态的肺泡结构，而接种人多能干细胞（PSC）来源的 AEC2 细胞（包括经基因修饰的细胞）则可能推动人类疾病的转化医学研究13,53。总体而言，ELT 平台所实现的自下而上构建策略，为探究特定细胞类型对特定检测指标（如 AEC2 的增殖或分化状态）的贡献提供了新的研究机会。
总之，本方案概述了一种可靠的系统，用于在无细胞ECM肺组织切片支架内生成工程化肺组织，以开展AEC2、成纤维细胞和内皮细胞的共培养研究。工程化肺组织（ELTs）代表了一种针对原代AEC2的新型三维培养策略，而此类细胞以往通常依赖于生理模拟性较差的凝胶类基质来维持其良好分化表型。6,11,12该现有平台是在先前脱细胞肺切片再细胞化研究的基础上建立起来的24,25,26,27,28,29，但具有多项优势：1）采用组织培养盒系统，便于在脱细胞、接种和培养过程中对ELT进行操作；2）定制的接种浴槽，可精确地将已知数量的细胞接种至每一片支架上；3）采用上皮细胞、间充质细胞和内皮细胞共培养的三重接种策略，实现肺泡组织的再细胞化。因此，ELT代表了在构建可重复的 体外 能够模拟天然肺泡的细胞与基质复杂性以及AEC2干细胞微环境的模型。

肺泡是远端肺的功能单位，由进行气体交换的气腔网络构成，其内衬为肺泡上皮Ⅰ型细胞（AEC1s）和Ⅱ型细胞（AEC2s）。上皮下方分布着密集的毛细血管网和支持性间充质，整个结构由细胞外基质（ECM）支架支撑，为这些精细的气囊提供强度与弹性1肺泡也是多种肺部疾病的损伤部位，包括特发性肺纤维化。2急性呼吸窘迫综合征3，以及重症冠状病毒病-19（COVID-19）4尽管过去十年的研究揭示了肺上皮组织具有显著的可塑性，但某些情况下远端肺组织能够修复的机制，以及另一些情况下修复无法进行的原因，仍是当前深入研究的领域。5. 改进型技术的开发 体外 用于模拟肺泡的平台将有助于开展肺泡生物学、再生及治疗学研究。
AEC2细胞能够自我更新并分化为AEC1细胞，因此被认为是远端肺的主要干细胞6,7,8然而，这些细胞对 体外 鉴于在不丢失表型的情况下培养原代AEC2s存在困难，该研究具有重要意义9在传统的二维（2D）培养中，AEC2细胞变扁平并表现出某些类似AEC1细胞的特征10相比之下，三维培养策略（最常见的是类器官）能够支持原代AEC2细胞分化特征的维持6,11,12 并支持多能干细胞（PSC）来源的AEC2细胞的长期培养13,14类器官已被用于模拟远端肺的发育过程15病毒性感染11,15以及与AEC2相关的遗传性疾病13,16,17，从而为AEC2生物学特性与再生机制提供了重要见解。然而，这些培养模型通常仅包含一到两种细胞谱系，且将细胞嵌入凝胶类基质中，无法重现天然肺泡的结构或细胞外基质（ECM）微环境。
细胞外基质（ECM）通过分子、拓扑和力学信号，对细胞表型和行为起关键调控作用；是调控干细胞命运的组织特异性微环境的关键组分；同时作为储存库，调节局部分泌的生长因子的可利用性18,19,20,21。因此，在天然ECM上培养细胞可能提高体外（in vitro）系统模拟体内（in vivo）组织生物学行为的预测能力。脱细胞化是一种通过去污剂、酶、物理或其他方法去除组织中细胞成分的过程，在操作得当的情况下，可在很大程度上保留天然器官的ECM支架结构22,23。此类支架可重新接种细胞，用于三维仿生培养。然而，尽管脱细胞化支架已广泛应用于组织工程领域，但其在常规细胞培养中的应用仍有限。已有若干前期研究报道了肺组织切片或小段肺组织的脱细胞化及再细胞化。除概念验证研究24,25,26外，再细胞化的肺切片已被用于研究成纤维细胞与基质的黏附27,28，以及探究病变肺基质对成纤维细胞表型的影响27,29。随着精密切割组织切片技术的进步，脱细胞化的肺切片有望成为一种便捷且小规模的细胞培养平台，同时保留肺泡、气道和血管等亚结构。引入多种细胞类型将有助于在生理相关的三维环境中研究细胞间的相互作用。然而，仍需改进策略，以方便在整个培养过程中对组织的操作，并确保以已知数量的细胞实现可控且可重复的组织接种。
本文介绍了一种通过将原代内皮细胞、AEC2细胞和成纤维细胞重新接种到脱细胞化的精密切割肺片（PCLS）中，以生成工程化肺组织（ELTs）的实验方案。在我们先前报道的工程化心肌组织系统30以及全肺脱细胞-再细胞化策略22,31的基础上，本文描述了从大鼠肺组织中切割PCLS并将其固定于可重复使用的组织培养盒中的操作流程，该设计简化并标准化了后续操作。固定后的肺片经脱细胞处理形成无细胞的细胞外基质（ECM）支架，并在定制的接种槽中重新接种细胞。肺片支架可保留关键的ECM组分和组织结构，并支持AEC2细胞在类肺泡的多谱系结构中生长至少7天。ELTs代表了一种存在于生理相关三维基质中的新型肺泡共培养体系，不仅有助于推动肺组织工程策略的发展，也将促进对AEC2细胞及肺泡的基础生物学研究。

<table><tbody><tr><td>3D 打印机：Form 2</td><td>Formlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>8-溴环磷酸腺苷（8-Bromo cAMP）</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖，UltraPure LMP</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B</td><td>Sigma</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>带倒钩的变径接头，3/8 英寸 × 1/4 英寸</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K271</td><td></td></tr><tr><td>苯甲酸核酸酶（Benzonase nuclease）</td><td>Sigma</td><td>E1014</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）第五组分</td><td>Gemini</td><td>700-104P</td><td>用于 AEC2 生长培养基</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），标准级</td><td>Gemini</td><td>700-100P</td><td>用于苯甲酸核酸酶缓冲液</td></tr><tr><td>止回阀，聚丙烯材质，1/8 英寸软管接头</td><td>Cole-Parmer</td><td>SK-98553-10</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>PeproTech</td><td>2520691</td><td></td></tr><tr><td>透明树脂，1 L</td><td>Formlabs</td><td>RS-F2-GPCL-04</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水，例如 Krazy Maximum Bond Permanent Glue</td><td>任意五金、手工或药店</td><td>KG483 或类似产品</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（低葡萄糖）</td><td>Gibco</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（高葡萄糖）</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DNA 检测试剂盒（Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒）</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>EDTA，0.5 M，pH 8.0</td><td>AmericanBio</td><td>AB00502-01000</td><td></td></tr><tr><td>EdU 检测试剂盒（Click-iT EdU 细胞增殖成像试剂盒，Alexa Fluor 647）</td><td>Invitrogen</td><td>C10340</td><td>按制造商说明使用</td></tr><tr><td>弯头接头，3/8 英寸</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K907</td><td></td></tr><tr><td>F12 培养基</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），经鉴定</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Gemini</td><td>400-100P</td><td>用二水重蒸水（diH₂O）重悬，配制成 50 mg/mL 储存液</td></tr><tr><td>电推剪</td><td>Wahl</td><td>MiniArco</td><td></td></tr><tr><td>无酚红汉克氏平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>肝素钠注射液，USP，1000 U/mL</td><td>Sagent</td><td>NDC: 25021-400-30</td><td>用于腹腔和心脏内注射</td></tr><tr><td>肝素钠盐</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td>用于肺动脉灌注；用 PBS 配制成 100 U/mL 储存液</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Corning</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>直通三通接头，3/8 英寸 × 1/8 英寸</td><td>McMaster-Carr</td><td>5121K851</td><td></td></tr><tr><td>一次性接种环</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-600</td><td></td></tr><tr><td>牛胰岛素</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮注射液，100 mg/mL</td><td>Covetrus（Butler Animal Health）</td><td>010177</td><td></td></tr><tr><td>KGF，重组人源</td><td>PeproTech</td><td>100-19</td><td></td></tr><tr><td>激光切割机，VLS 3.50 30 瓦</td><td>Universal Laser Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁母接头，3/32 英寸</td><td>Cole-Parmer</td><td>45508-02</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁公接头，1/8 英寸</td><td>Cole-Parmer</td><td>30800-24</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁公接头，1/4 英寸</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K146</td><td></td></tr><tr><td>MCDB-131 完全培养基（无血清）</td><td>VEC Technologies</td><td>MCDB-131 WOFBS</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl₂），1 M</td><td>AmericanBio</td><td>AB09006-00100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>American Bioananalytical</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺，10X</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td>用二水重蒸水（diH₂O）稀释至 1X</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺</td><td>Gibco</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>PDMS - SYLGARD 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（10,000 U/mL 青霉素 / 10,000 &amp;mu;g/mL 链霉素）</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，150 mm</td><td>Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>塑料薄膜（Parafilm）</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Pharmed BPT 管，LS 16</td><td>Masterflex</td><td>06508-16</td><td></td></tr><tr><td>Pharmed BPT 管，LS 17</td><td>Masterflex</td><td>06508-17</td><td></td></tr><tr><td>铂固化硅胶管，LS 14</td><td>Masterflex</td><td>96420-14</td><td></td></tr><tr><td>铂固化硅胶管，LS 16</td><td>Masterflex</td><td>96420-16</td><td></td></tr><tr><td>铂固化硅胶管，LS 36</td><td>Masterflex</td><td>96410-36</td><td></td></tr><tr><td>泊洛沙姆 407（Pluronic F-127）</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮/碘消毒垫，10%</td><td>Dynarex Corporation</td><td>1108</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 板，0.060 英寸（1/16 英寸）厚</td><td>ePlastics</td><td>PTFENAT0.060X12X12</td><td>用于组织培养盒标签</td></tr><tr><td>PTFE 板，0.093 英寸（3/32 英寸）厚</td><td>ePlastics</td><td>PTFENAT0.093X12X12</td><td>用于组织培养盒框架和夹子</td></tr><tr><td>蠕动泵驱动器：Masterflex L/S 可调速数字驱动器</td><td>Cole-Parmer</td><td>ZM-07528-30</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵头：Masterflex L/S Easy-Load II 泵头</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-77202-60</td><td></td></tr><tr><td>大鼠，Sprague Dawley 品系</td><td>Charles River</td><td>品系编号：400</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>任意五金或手工店</td><td>Personna 94-120-71 或类似产品</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>旋转刀片，28 mm</td><td>Omnigrid</td><td>2046</td><td></td></tr><tr><td>旋转切割器，28 mm</td><td>Olfa</td><td>型号 9551</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠（SDC）</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>亚硝基铁氰化钠（SNP）</td><td>Sigma</td><td>71778</td><td></td></tr><tr><td>四通旋塞阀</td><td>Edwards</td><td>594WSC</td><td></td></tr><tr><td>缝合线，4-0 单丝聚丙烯</td><td>Covidien</td><td>VP-557-X</td><td></td></tr><tr><td>注射器，10 mL</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>注射器，50 mL</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿，35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿，100 mm</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>组织培养板，6 孔</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>组织培养板，12 孔</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>人转铁蛋白</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Tris，1 M 溶液，pH 8.0</td><td>AmericanBio</td><td>AB14043-01000</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02025-00500</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机，Compresstome VF-300-0Z</td><td>Precisionary Instruments LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪，100 mg/mL</td><td>Henry Schein</td><td>NDC: 11695-4022-1</td><td></td></tr><tr><td>Y 型连接器，1/16 英寸带倒钩</td><td>Cole-Parmer</td><td>30614-43</td><td></td></tr></tbody></table>

由脱细胞肺切片制备的工程化肺组织

Engineered Lung Tissues Prepared from Decellularized Lung Slices

需要改进的三维（3D）肺模型，以更好地模拟天然肺泡的结构和细胞复杂性 离体近年来开发的类器官模型促进了肺上皮前体细胞的扩增与研究 体外但这些平台通常依赖于小鼠肿瘤来源的基质和/或血清，并且仅包含一种或两种细胞谱系。本文介绍了一种基于去细胞化精准切割肺片（PCLS）多谱系重细胞化的工程化肺组织（ELTs）构建方案。ELTs包含类似肺泡的结构，由肺泡上皮、间充质和内皮组成，其细胞外基质（ECM）支架与天然肺组织高度相似。组织构建过程中，首先用琼脂糖灌注大鼠肺脏，切成450 µm厚的肺片，裁剪成条状后进行去细胞化处理。所得无细胞ECM支架随后接种原代内皮细胞、成纤维细胞和肺泡上皮Ⅱ型细胞（AEC2s）。在无血清、化学成分明确的培养基中，AEC2s可在ELT培养体系中维持至少7天。在整个制备与培养过程中，肺片被固定于一种盒式系统中，便于操作并实现多个ELT的平行化标准化接种。该ELT体系是一种类器官培养平台，有望促进肺泡内细胞间及细胞-基质相互作用的研究，以及AEC2s及其微环境调控信号的探索。

生成工程化肺组织（ELT）的流程概述——包括肺组织切片、切片固定与脱细胞化以及支架重细胞化——如图3所示。本研究所展示的ELT使用原代大鼠肺微血管内皮细胞（见材料表）、新生大鼠AEC2细胞以及富含脂成纤维细胞的新生大鼠肺成纤维细胞进行培养36。AEC2细胞通过磁珠分选法新鲜分离，方法如前所述37；其他分离方案已在别处详细描述并讨论38,39,40。分离所得大鼠AEC2细胞的纯度可通过流式细胞术检测大鼠特异性AEC2表面标志物RTII-7041进行评估，或通过对细胞离心涂片样本染色检测RTII-70或前表面活性蛋白C（pSPC）进行评估。大鼠肺成纤维细胞根据已发表方案的改良方法从出生后第7至9天的大鼠幼崽中分离获得，并在第1至2代使用42；其他分离方法在其他文献中已有描述43,44。分离所得成纤维细胞的纯度可通过培养细胞或细胞离心涂片样本对间充质标志物波形蛋白（vimentin）染色进行评估，而脂成纤维细胞的富集程度则可通过油红O染色进行评估45。
当肺组织被琼脂糖均匀充盈，并且组织块经过策略性选取和定向切片以最大化总组织和实质组织面积时，一只大鼠的肺可提供用于 &gt;100 个肺泡样 ELTs。PCLS 条带具有足够的机械完整性，可用组织包埋盒夹持，仅需少量（&lt;5%）撕裂情况图3B).
肺组织切片脱细胞的实验方案主要基于我们先前发表的全肺脱细胞方案，该方案通过定量蛋白质组学分析证实，能够保留多种细胞外基质（ECM）成分，其含量与天然肺组织相比无显著差异22。脱细胞后的切片支架在苏木精-伊红（H&amp;E）染色（图4A、B）和相差显微镜观察（图4C）下均显示出肺泡的天然结构。我们通常排除含有大支气管或血管（图4D）或存在撕裂的支架，但若研究需要，也可保留前者。脱细胞处理可使组织DNA含量降低96%（通过双链DNA检测法测定，参见材料表；天然组织与脱细胞组织分别为0.50 µg/mg ± 0.073 µg/mg 和 0.018 µg/mg ± 0.0035 µg/mg，均值±标准误）（图5A），且苏木精染色未见任何DNA残留（图4B）。对脱细胞支架进行组织学和免疫荧光染色显示，胶原蛋白、弹性蛋白、IV型胶原和层粘连蛋白等ECM蛋白得以保留，其结构和含量与天然肺切片相似（图5B-E）。需注意的是，在三色染色（用于胶原）和EVG染色（用于弹性蛋白）中，天然组织的细胞核呈蓝/黑色。免疫荧光染色操作如前所述，采用组织染色的标准方法37。所用抗体及其相应浓度列于表4中。
成功的支架再细胞化在7天后可形成细胞密度极高的工程化肺组织（ELT），光镜下可见类似肺泡的再细胞化模式（图6A-C）。在某些细胞密度极高的情况下，可能观察到类器官样结构（图6A、B）。组织接种失败的情况可在培养过程中通过相差显微镜观察到（图6C）。在使用AEC2、成纤维细胞和内皮细胞对组织支架进行培养后，ELT中可密集再生出包含全部三种细胞谱系的肺泡样结构（图6D、E）。在第7或第8天，AEC2仍维持立方状形态，并表达表面活性蛋白B（SPB）和板层小体蛋白ABCA3，未见明显向AEC1分化迹象（图6E、F）。AEC2在ELT中具有高度增殖活性，经10 µM EdU脉冲标记2小时后，通过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）掺入实验可证实其增殖状态（图6G）。
<img alt="灌注系统示意图，包含注射器、脉动阻尼器、用于输送肝素/硝普钠的蠕动泵。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：肺组织提取与清除用灌注系统的示意图。（A）灌注系统包括一个重力驱动支路，用于在流动条件下初步插管肺动脉；以及一个泵驱动支路，用于在初步插管后高效清除肺内物质。泵管路中包含一个“脉动阻尼器”，可减弱由泵引起的压力波动。左侧详细展示了气管和肺动脉插管的设计。SNP = 硝普钠。（B）脉动阻尼器组件的细节。BPT 和硅胶指不同类型导管。（C）肺组织提取过程中气管和肺动脉插管的放置位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="AEC2 细胞培养时间线示意图；接种、换液、组织收获过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：三谱系重细胞接种的培养时间线。 三谱系 ELT 接种与培养的建议时间线，包括两阶段接种的时间安排。图中注明了各阶段的接种细胞数量及培养基类型。培养基详情见表 3。AEC2 = 肺泡上皮 II 型细胞。EC = 内皮细胞。FB = 成纤维细胞。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肺组织工程过程：示意图展示切片、脱细胞化、支架培养装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：工程化肺组织制备示意图。（A）使用振动切片机将天然肺组织切成薄片。（B）将精密切割的肺组织切片进一步切成标准化的3 mm宽条状，夹入聚四氟乙烯（PTFE）组织培养盒中，并通过去污剂处理进行脱细胞化，获得无细胞的细胞外基质支架。（C）将支架置于特制的接种浴中重新接种，以限制接种区域与组织区域一致，随后在标准孔板中进行培养。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="天然组织与脱细胞组织切片；显微镜图像显示结构差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：脱细胞肺支架的结构。 天然（A）和脱细胞（B）肺切片的 H&amp;E 染色显示脱细胞后肺泡结构得以保留。（C,D）通过相差显微镜以 5 倍放大观察脱细胞 ECM 支架的示例，主要包含肺泡组织（C），或含有较大的分支气道和血管（D，黑色和红色箭头所示）。比例尺：50 µm（A,B）；500 µm（C,D）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学与荧光分析：天然/脱细胞组织中的DNA含量、胶原蛋白、层粘连蛋白" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5脱细胞肺支架中DNA的去除与基质的保留。 (A) 天然肺组织切片与脱细胞肺组织切片中DNA含量的定量分析（均值 ± 标准误，n = 5）。Welch's t 测试，**P &lt; 0.01. Decell = 去细胞化。 (B，C) 对天然和脱细胞肺组织切片进行胶原蛋白的组织学染色（B）和弹性蛋白（C）。箭头所示为脱细胞组织肺泡入口环中保留的弹性蛋白。D，E) 对天然和脱细胞肺组织切片进行胶原蛋白IV的免疫荧光染色（D）以及层粘连蛋白（laminin）E比例尺， 50 µm在所有图中，虚线框标出了各自图中右侧放大的图像区域。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肺组织分析，免疫荧光显微镜，DAPI SPB ABCA3 标记物，细胞形态。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63151/63151fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：工程化肺组织的细胞再增殖。（A-C）培养第7天时再细胞化的工程化肺组织（ELT）示例，通过相差显微镜在培养过程中观察。再细胞化模式与组织的肺泡结构相一致。在细胞密度较高的区域，可能形成类器官样结构（箭头）。图（A）和（B）代表成功的细胞再增殖，而图（C）则显示培养7天后细胞再增殖程度较差。（D-G）培养第7或第8天时对再细胞化的ELT进行染色。（D）H&amp;E染色显示肺泡隔的细胞再增殖。（E）免疫荧光染色标记了移植的proCollagenIα1+成纤维细胞、ABCA3+ AEC2细胞和CD31+内皮细胞。（F）在此条件下，组织中含有丰富的SPB+ AEC2细胞，但RTI-40（podoplanin）+ AEC1细胞较少。（G）通过EdU掺入检测发现，ELT中有大量AEC2细胞处于增殖状态。比例尺：500 µm（A-C）；25 µm（D-G）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/63151fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
表1：脱细胞溶液。 脱细胞溶液的配制细节。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%201%20-%20Decellularization%20solutions_Revised.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：脱细胞化方案。 肺组织切片脱细胞化处理方案的详细步骤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%202%20-%20Decellularization%20protocol.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：培养基。 内皮细胞和AEC2生长培养基的制备细节。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%203%20-%20Culture%20media.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表4：免疫染色所用抗体。免疫染色所用抗体及其浓度的详细信息。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Table%204%20-%20Antibodies%20used%20for%20immunostaining.xlsx" target="_blank">请点击此处下载本表。</a>
补充文件1：用于激光切割组织培养盒框架的设计文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：用于激光切割组织培养盒夹具的设计文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%202.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3：用于激光切割组织培养盒标签的设计文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%203.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 4：用于制备接种浴模具底座的 CAD 文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%204.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 5：用于接种浴模具环的 CAD 文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63151/Supplementary%20File%205.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种通过使用肺泡上皮II型细胞、成纤维细胞和内皮细胞重新接种脱细胞化精密切割肺组织切片，以生成可重复且小规模工程化肺组织的方法。

需要改进的三维（3D）肺模型，以重现天然肺泡的结构和细胞复杂性

该方案可实现完整肺细胞外基质作为三维组织培养基质的重复利用，并具备中等通量。工程化肺组织系统的主要优势在于其平台的灵活性。ELTs 可根据需要适配不同的组织支架、细胞或培养基。肺脏取出后，用一个10毫升注射器吸取琼脂糖和不含酚红的HBSS。通过气管套管向肺脏注入约10毫升空气，使肺膨胀，然后立即通过同一气管套管注入配制好的琼脂糖，直至肺叶最远端完全膨胀。使用三通阀的白色帽盖连接气管套管的雌性鲁尔锁接口，封闭气管。将肺组织置于冰上的150毫米培养皿中，使琼脂糖凝固。根据论文中的方案制备肺组织切片，然后在100毫米培养皿中加入1/3体积的PBS。用镊子将包埋盒和标签转移至培养皿中。如果切片处于冷冻状态，需逐个解冻，方法是加入室温的磷酸盐缓冲液（PBS）。然后将解冻后的切片转移至一个150毫米的培养皿中。使用精细镊子或止血钳轻轻展开切片，并小心吸除组织周围的过量PBS。然后，用剃须刀片紧贴培养皿，沿其全长用力按压并轻轻左右摇动，从切片上切下一宽约三毫米、长度至少九毫米的组织条。将组织条装入包埋盒时，先使其漂浮在包埋盒上方，仔细居中对齐，确保组织两端略微伸出夹片上的孔洞。用精细镊子将一个标签部分插入一端的孔中，轻轻拉直组织，再固定第二个标签。最后，使用镊子将每个标签完全压紧，以固定组织。夹紧所有侧边后，将装有包埋盒的100毫米培养皿转移至超净台中。使用弯头止血钳夹住带缺口的一侧，将包埋盒转移至含有第一种脱细胞溶液的六孔板中。然后，将六孔板置于30 RPM的摇床上，振荡10分钟。吸去每孔中的液体，每孔加入3毫升第二种脱细胞溶液。将六孔板置于30 RPM的摇床上，孵育5分钟。按照文稿中脱细胞化方案所述，依次对每种溶液重复此步骤。用 PBS 最终冲洗后，将组织转移至含有新鲜 PBS（含抗生素和抗真菌剂）的无菌六孔板中，在 37 摄氏度孵育 48 小时。经抗生素和抗真菌剂灭菌后，肺组织支架可立即接种细胞，或在 4 摄氏度保存长达 30 天。在用于培养之前，将保存于4摄氏度的支架与新鲜的PBS以及抗生素和抗真菌剂一起，在37摄氏度下孵育过夜，作为额外的灭菌步骤。然后，用无菌PBS以每孔5毫升的量清洗支架，每次5分钟，共清洗三次。在5倍放大倍数的相差显微镜下检查支架，以选择适合接种的组织。用内皮细胞培养基制备内皮细胞悬液，浓度为每毫升500万个细胞，并准备足够数量的细胞，以每片支架接种50万个内皮细胞。将经高压灭菌的接种浴置于100毫米的培养皿中，并小心地将冲洗后的支架倒置转移至接种浴中。轻轻涡旋混匀已制备的细胞悬液。然后，使用移液器小心地将 100 µL 细胞悬液直接加至每个孔底部组织的上方，注意避免移液器枪头损伤组织。将接种了细胞的组织转移至细胞培养箱中。内皮细胞接种 24 小时后，使用手动移液器向每个孔中加入 900 µL 预先温育的培养基，然后将培养板放回培养箱中。细胞接种24小时后，吸除培养基，并为每孔更换1毫升新鲜的内皮细胞培养基。接种肺泡内皮细胞72小时后，使用血细胞计数板对AEC2（肺泡上皮II型细胞）和成纤维细胞进行计数，并用AEC2生长培养基制备浓度为每毫升500万个细胞的1:1细胞悬液。用移液器吸出每个接种孔中的培养基，然后轻轻混匀已制备的细胞悬液。用移液器将100微升细胞直接加到每个孔底部组织的上方。将接种了细胞的组织转移至细胞培养孵育箱中。两小时后，向每个孔中加入900微升预热的AEC2生长培养基，然后将培养板放回孵育箱。在与AEC2细胞和成纤维细胞共培养24小时后，按每孔每插件加入一毫升预热的AEC2生长培养基，准备12孔板。用移液器从接种浴的每个孔中吸出800微升培养基，然后将插件从接种浴中取出，正面朝上转移至已准备好的12孔板中，每孔放置一个插件。在所需的培养期间内，每隔一天使用玻璃巴斯德吸管小心更换培养基。在整个培养过程中，通过5倍放大倍数的相差显微镜监测组织再细胞化的程度。组织支架的苏木精和伊红染色显示，脱细胞后肺泡结构得以保留，且无可见的细胞核。在5倍放大倍数下通过相差显微镜观察脱细胞后的细胞外基质支架时，可见肺泡组织结构。一些切片中还可观察到较大的分支气道和血管。培养第7天，相差显微镜显示，在成功再细胞化的案例中，工程化肺组织的再细胞化模式模拟了肺泡结构。再细胞化不良的情况也同样可见。第7天或第8天的苏木精和伊红染色显示肺泡隔重新定植。免疫荧光染色显示存在I型前胶原α1阳性的成纤维细胞、ABCA3阳性的AEC2、CD31阳性的内皮细胞以及大量SPB阳性的AEC2。此外，胸苷检测显示许多AEC2处于增殖状态。该技术促进了肺组织工程策略的发展，并推动了肺泡内支持Ⅱ型细胞增殖与分化的微环境研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

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