由去细胞化肺切片制备的工程肺组织
January 21st, 2022
该协议描述了一种通过用肺泡上皮2型细胞，成纤维细胞和内皮细胞重新填充去细胞化精密切割的肺切片来产生可重复的小规模工程肺组织的方法。
该方案能够重复使用完整的肺细胞外基质作为三维组织培养底物和中等通量。工程肺组织系统的主要优点是平台的灵活性。ELT可以适应使用各种组织支架，细胞或感兴趣的培养基。
一旦肺部被提取，用琼脂糖和HBSS填充10毫升注射器，不含酚红。通过气管套管用约10毫升的空气使肺部充气，然后立即通过气管套管注射制备的琼脂糖，直到肺叶的最远端尖端充气。通过将四向旋塞阀上的白色盖子连接到气管插管的雌性鲁尔锁上来盖住气管。
将肺放入150毫米的培养皿中，放在冰上，使琼脂糖凝固。根据手稿中的方案准备肺切片，然后在100毫米培养皿中填充1/3体积的PBS。使用镊子将盒式磁带和标签转移到培养皿中。
如果切片是冷冻的，通过倒入室温PBS一次解冻一个盘子。然后，将解冻的切片转移到150毫米的培养皿中。使用细镊子或止血剂轻轻展开切片，并小心地从组织周围吸出多余的PBS。
然后，将剃须刀片的全长压在盘子上并左右稍微摇晃，从切片上切下三毫米宽，至少九毫米长的条带。要将组织带夹入盒中，请将其漂浮在盒上方，小心地将其居中以穿过夹子两端的孔。用细镊子将卡舌部分放入孔的一端，轻轻拉直组织，然后设置第二个卡舌。
最后，使用镊子完全按下每个卡舌以固定组织。夹住所有侧面后，将包含盒式磁带的100毫米培养皿转移到层流罩中。使用弯曲的止血剂将盒转移到含有第一个去细胞化溶液的六孔板上，以抓住缺口侧。
然后，将六孔板以30 RPM的眼眶振荡器上放置10分钟。从每个孔中抽出流体，然后用每孔三毫升的第二个脱细胞溶液代替它。将板以30 RPM的轨道振荡器上放置，孵育五分钟。
对手稿中去细胞化方案中概述的每个溶液重复此过程。用PBS最后冲洗后，将组织转移到含有新鲜PBS的无菌六孔板中，加入抗生素和抗真菌药，并在37摄氏度下孵育48小时。使用抗生素和抗真菌药灭菌后，肺组织支架可以立即播种或在4摄氏度下储存长达30天。
在用于培养之前，将储存在4摄氏度的支架与新鲜的PBS和抗生素以及抗真菌药在37摄氏度下孵育过夜，作为额外的灭菌步骤。然后，用无菌PBS冲洗支架，每孔五毫升，三次，每次五分钟。在相差显微镜下以5倍放大倍率检查支架，以选择用于播种的组织。
在内皮培养基中以每毫升500万个细胞制备内皮细胞悬浮液，其中有足够的细胞每片接种500， 000个内皮细胞。将高压灭菌的播种浴置于100毫米培养皿中，并小心地将冲洗支架倒置到播种浴中。轻轻旋转准备好的细胞悬浮液以混合。
然后，小心地将100微升细胞直接移液到孔基部的每个组织的顶部，注意不要用移液器尖端损坏组织。将接种的组织转移到细胞培养箱中。内皮细胞接种24小时后，使用手动移液器向每个孔中加入900微升预热培养基，然后将板放回培养箱。
细胞接种24小时后，除去培养基，每孔更换一毫升新鲜内皮培养基。接种内皮细胞72小时后，使用血细胞计数器对AEC2或肺泡上皮II型细胞和成纤维细胞进行计数，并在AEC2生长培养基中以每毫升500万个细胞制备1:1的细胞悬浮液。从每个接种浴槽中移液培养基，并轻轻旋转准备好的细胞悬浮液。
将100微升细胞直接移液到孔基部每个组织的顶部。将接种的组织转移到细胞培养箱中。两小时后，向每个孔中加入900微升预热的AEC2生长培养基，然后将板返回到培养箱中。
用AEC2s和成纤维细胞培养24小时后，每孔每个盒制备12孔板，每孔一毫升预热的AEC2生长培养基。从播种浴的每个孔中移液800微升培养基，然后从播种浴中取出盒，并将它们右侧转移到制备的12孔板中，每孔一个盒。每隔一天使用玻璃巴斯德移液器仔细更换培养基，以获得所需的培养时间。
在整个培养过程中，通过相差显微镜以5倍放大倍率监测组织再填充的程度。组织支架的H和E染色显示去细胞化后肺泡结构保留，没有可见的细胞核。当通过相衬显微镜以5X放大倍率观察去细胞外基质支架时，观察到肺泡组织。
在一些切片中也可以看到大的分支气道和血管。在培养的第七天，相衬显微镜显示，在成功再造菌的情况下，工程肺组织中的再细胞化模式模拟了组织的肺泡结构。不良的再造细胞化也是可见的。
第七天或第八天的H和E染色显示肺泡隔再造。免疫荧光站立显示前胶原I型α1阳性成纤维细胞，ABCA3阳性AEC2s，CD31阳性内皮细胞，以及丰富的SPB阳性AEC2s。此外，胸苷测定显示许多增殖的AEC2。
该技术促进了肺组织工程策略的发展，并使得能够研究肺泡内支持II型细胞增殖和分化的队列。
概览
本协议描述了一种通过用肺泡上皮细胞2型细胞、成纤维细胞和内皮细胞重新人化脱细胞精确切割肺片来生成可重复、小规模工程化肺组织的方法。工程化肺组织系统在使用各种组织支架、细胞或培养基方面提供了灵活性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 组织工程
背景
- 脱细胞肺组织为细胞重新人化提供了支架。
- 肺泡上皮细胞2型细胞在肺功能中扮演着至关重要的角色。
- 了解组织工程可以推进再生医学的发展。
- 适中的通量方法对于重复性至关重要。
研究目的
- 开发一种可靠的工程化肺组织方法。
- 评估组织支架的适应性。
- 评估肺细胞重新人化的效率。
使用的方法
- 使用脱细胞协议制备肺支架。
- 播种内皮细胞和肺泡上皮细胞2型细胞。
- 通过相差显微镜监测组织重新人化。
- H和E染色用于评估组织结构。
主要结果
- 脱细胞后成功保存了肺泡结构。
- 通过显微镜观察到组织重新人化的证据。
- 注意到重细胞化模式的可变性。
- 免疫荧光染色证实支架中存在细胞。
结论
- 工程化肺组织系统是可适应和可重复的。
- 相差显微镜有效用于监测组织健康。
- 进一步优化可能会提高重细胞化结果。
常见问题
Executive Industry Relevance
Engineered lung tissues (ELTs) derived from decellularized precision-cut lung slices provide a physiologically relevant 3D model for studying alveolar biology, enabling mechanistic de-risking of pulmonary targets and pathways. This platform supports target validation by recapitulating native lung extracellular matrix and multi-cellular interactions, improving predictive confidence in early discovery. The system facilitates translational continuity from discovery through preclinical evaluation by maintaining alveolar epithelial type 2 cell function in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses within a native-like alveolar microenvironment comprising epithelium, mesenchyme, and endothelium.
- Operational Value: Supports functional target validation through recellularization of acellular scaffolds with primary lung cells, reducing mechanistic ambiguity.
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by modeling cell-cell and cell-matrix interactions within the alveolus, informing pathway clarification and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems with preserved alveolar architecture for downstream compound screening and biomarker assessment.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through cassette-based handling and parallel seeding of multiple ELTs.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by providing quantitative readouts via phase contrast microscopy, immunofluorescence, and hemocytometer-based cell counting.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease relevance through alveolar-like structures containing AEC2s, fibroblasts, and endothelial cells within native-like ECM.
- Operational Value: Ensures translational continuity by maintaining AEC2 phenotype and function for at least 7 days in serum-free, chemically-defined medium.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by modeling biochemical signals regulating AEC2s and their niche, enabling mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The ELT platform integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies, supported by its ability to model alveolar structure and function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling studies of cell-cell and cell-matrix interactions within the alveolus.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized cassette handling and parallel tissue preparation.
- Analytics: Provides quantitative measurements including phase contrast microscopy for repopulation monitoring, immunofluorescence for cell-specific markers (ABCA3, CD31, pro-collagen I), and hemocytometer-based counting of AEC2s and fibroblasts.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through preserved alveolar septa repopulation and sustained AEC2 marker expression (SPB, ABCA3) over culture duration.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform adaptable to various tissue scaffolds, cell types, and culture media, supporting scalable workflows across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic de-risking of alveolar targets and reduction of biological uncertainty in pulmonary programs.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via cassette system and parallel processing of multiple ELTs.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by enabling early assessment of target engagement in a native-like lung microenvironment.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on functional readouts of AEC2 proliferation, differentiation, and niche interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, primary cell culture, and decellularization protocols.
- Dependent on instrumentation for precision slicing (450 µm thickness), orbital shaking (30 RPM), and phase contrast microscopy (5X magnification).
- Necessitates cross-team standardization for cassette preparation, sterile seeding, and medium exchange procedures.
- Involves adaptation considerations when applying the system to human or disease-model lung scaffolds.
- Practical limitations include variability in recellularization patterns and dependence on optimal cell seeding density and medium conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:35
Harvest of Rat Lungs
1:15
Cutting and Clipping the Lung Slices
2:25
Slice Decellularization
3:35
Slice Recellularization and Culture
6:20
Results: Visualization of the Structure of Decellularized Lung Scaffolds and Recellularized Engineered Lung Tissues (ELTs)
7:35
Conclusion
