用于迭代表观基因组分析的可重复使用的单细胞
February 11th, 2022
本协议描述了一种使用可重复使用的单细胞进行迭代表观基因组分析的单细胞方法。可重复使用的单细胞允许分析同一单细胞中的多个表观遗传标记并对结果进行统计验证。
这种实验方法允许长期储存可重复使用的单细胞用于表观基因组测试。它还允许分析同一单细胞中的许多表观遗传标记和转录因子。在目前的单细胞表观基因组分析方法中，无法重新分析相同的单细胞。
但是，对于可重复使用的单细胞，可以多次重新分析相同的单细胞。该技术可用于表观遗传治疗的诊断和设计，特别是当患者细胞数量有限时。该方法最适合表观基因组的研究、基因表达的调控和其他系统，只要有表观遗传标记的特异性抗体即可。
首次尝试此技术时，我们建议您对不太珍贵的样本进行练习，并使用浅层测序（如 MiSeq 或 iSeq 100）验证实验。首先，在干净的层流罩中，混合一毫升细胞悬液和199毫升含有DNA插层染料的一毫摩尔EDTA PBS。混合后，将200微升细胞悬液转移到平底96孔板的每个孔中。
将盖子放在96孔板上，并使用扫描显微镜扫描板。接下来，倾斜板并等待几分钟，直到单个细胞沉到孔的下边缘。然后将移液器吸头放在底角，并将单个细胞和缓冲液转移到PCR管中。
使用荧光显微镜检查孔以确认转移。如果单个细胞仍在孔中，则每孔加入200微升含有DNA嵌入剂染料的一毫摩尔EDTA PBS，并重复转移。转移后，将盖子放在96孔PCR板上，并使用摆动转子不间断地离心板。
离心后，将板放在自动液体处理机器人的甲板上。接下来，将补充代码一拖放到液体处理机器人的软件窗口中，然后运行程序以非常慢的移液速度去除195微升上清液。加入 50 微升 4% TEMED 或矿物油，并在室温下孵育板过夜。
第二天，通过移液除去矿物油，并用200微升TP镁负性缓冲液洗涤细胞五次。最后一次洗涤后，除去上清液，加入15微升退火缓冲液，并在冰上孵育一小时。孵育后，将PCR管放在热循环仪上，并在94摄氏度下加热三分钟。
然后将试管转移到冰冷的金属块中并孵育两分钟。接下来，加入四微升硫酸镁-氯化钠，DNTP混合并以最大速度涡旋混合。然后加入一微升BST聚合酶大片段，涡旋混合，并在摇床上孵育4小时。
孵育后，将PCR管放在热循环仪上，并按照文本中所述运行四小时或过夜程序。对于抗体结合，向管中加入1.625微升氯化钠EDTA BSA溶液。通过低速涡旋混合，并将试管在冰上孵育一小时。
然后加入每毫升抗体0.1微克，并与抗体探针偶联的对照IgG。加入抗体后，将试管在冰上轻轻摇动孵育。第二天，用200微升TPM-T缓冲液在冰上洗涤细胞两次。
然后除去上清液并用T4 DNA连接酶缓冲液洗涤一次。接下来，加入 19 微升连接适配器溶液，并在 25 摄氏度下孵育一小时。然后，加入一微升T4 DNA连接酶，并通过中速涡旋混合管。
将试管放在热循环仪上并运行邻近连接程序。运行后，用 200 微升 BST 镁阴性 EDTA 阳性缓冲液洗涤细胞两次，并将细胞在 4 摄氏度下储存过夜。第二天，用200微升BST镁阴性EDTA阴性缓冲液洗涤细胞两次，并加入20微升含有BST，DNTP和硫酸镁的混合物。
然后与涡旋混合器混合，并将管在轨道振荡器上孵育四小时。孵育后，将试管放在热循环仪上，并按照文本手稿中的说明运行完整的扩展程序。接下来，对于多次置换扩增，加入0.4微升100微摩尔第二随机引物，并通过涡旋混合。
然后，将试管在轨道振荡器上孵育两个小时，然后将试管放在热循环仪上以94摄氏度加热。三分钟后，将试管放入冰冷的金属块中，并加入一微升BST DNA聚合酶。以缓慢的速度涡旋管。
然后将试管放在热循环仪上以运行多位移扩增程序。程序结束后，将大约20微升上清液转移到PCR管中，并将其储存在零下80摄氏度。接下来，将 20 微升 0.05% 吐温 20 和 0.1X TE 缓冲液加入包含可重复使用单细胞的 PCR 管中，并将管在 4 摄氏度下孵育过夜。
第二天，收集上清液并将其与先前收集的上清液合并。然后，浸泡含有 50% 甘油、5 毫摩尔 EDTA、0.5% BSA 和 0.05% 吐温 20 的可重复使用的单细胞和 TBS 缓冲液，然后在轨道振荡器上孵育 30 分钟。孵育后，将可重复使用的单个细胞储存在零下20摄氏度直至进一步使用。
最后，加入40微升Exo阴性预混液，并将试管放在热循环仪上以按照文本手稿中的说明运行该程序。使用该协议生成K562可重复使用的单细胞。将单个细胞嵌入聚丙烯酰胺微球的外层，并使用用于DNA染色的插层染料进行可视化。
此处显示了BciVI消化前后的DNA产物。限制性内切酶消化产生了预期的19至20个、31至32个、49个和大于49个碱基对片段。此外，通过毛细管电泳分析构建的DNA文库以获得目标产物。
测序结果表明，抗组蛋白H3乙酰化赖氨酸27和抗组蛋白H3三甲基化赖氨酸27的独特映射读数明显多于对照IgG。通过将 REpi 测序数据与批量 ChIP 测序数据进行比较来评估 REpi 测序信号。平均而言，在批量 ChIP 测序中，来自 REpi 测序的组蛋白 H3 乙酰化赖氨酸 27 信号中约有 91% 与组蛋白 H-3 乙酰化赖氨酸 27 峰重叠。
REpi测序对无活性组蛋白标记、组蛋白H3三甲基化赖氨酸27的测序精度为52%分析REpi测序的灵敏度，以测量REpi测序再现读取检测到的批量ChIP测序的峰数。组蛋白H3乙酰化赖氨酸27的REpi测序灵敏度为55.30%，组蛋白H3三甲基化赖氨酸27的REpi测序灵敏度为50.94%。请确保您使用无 DNS 的试剂。
此外，所有涉及开管引线或试剂引线的操作都应在干净的罩子中进行。该过程的DNA产物被测序，然后映射到基因组以揭示存在哪些组蛋白修饰，在单个细胞中基因组的哪些区域。这项技术使得分析同一单细胞中的多个表观遗传标记成为可能，并为任何单个细胞中的多组学分析铺平了道路。
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概述
本协议概述了一种使用可重复使用单细胞进行迭代表观基因组分析的新型单细胞方法。该方法能够在同一个细胞内分析多种表观遗传标记，从而促进结果的统计验证。
关键研究组成部分
科学领域
- 表观基因组学
- 细胞生物学
- 遗传学
背景
- 目前的单细胞表观基因组分析方法不允许对同一细胞进行重新分析。
- 该方法解决了表观遗传学研究中患者细胞可用性的局限性。
- 该技术需要用于表观遗传标记的特定抗体。
- 可重复使用的单细胞可长期存储以进行持续的表观基因组测试。
研究目的
- 开发一种允许对同一个单细胞进行多次分析的方法。
- 增强对基因表达调控的理解。
- 促进表观遗传治疗的设计。
所用方法
- 用于表观基因组分析的可重复使用单细胞技术。
- 单细胞的长期存储技术。
- 各种表观遗传标记和转录因子的分析。
- 多次分析结果的统计验证。
主要结果
- 证明了重新分析同一单细胞的可行性。
- 展示了同时分析多种表观遗传标记的能力。
- 提供了对基因表达调控的洞察。
- 突出了改进表观遗传治疗设计的潜力。
结论
- 可重复使用的单细胞方法显著推进了表观基因组研究。
- 该技术在患者细胞有限时尤为有益。
- 未来的研究可以利用这种方法对表观遗传机制进行更深入的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Iterative epigenomic analysis using reusable single cells addresses a critical bottleneck in single-cell profiling by enabling multiple rounds of data collection from rare or precious samples. This approach increases predictive confidence in epigenetic target validation and supports robust mechanistic de-risking at early discovery and translational inflection points. The method enhances portfolio value by maximizing data density from limited patient-derived or disease-relevant cells.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables repeated interrogation of epigenetic marks in the same cell, reducing biological noise.
- Supports functional target validation by allowing direct comparison of multiple modifications within a single cell.
- Improves predictive confidence for pathway analysis and mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated single-cell systems for downstream multi-omic workflows.
- Enables assay standardization and reproducibility by controlling for cell-to-cell variability.
- Provides quantitative outputs for reliable compound or antibody screening in epigenetic contexts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by maximizing data from rare patient samples.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal single-cell analysis.
- Reduces risk in translational biomarker development by increasing within-cell data density.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling iterative hypothesis testing and multi-marker profiling within the same single cell.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by allowing repeated epigenetic measurements in individual cells.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility through standardized single-cell reuse.
- Analytics: Delivers quantitative readouts and statistical outputs for comparing antibody and control IgG signals within the same cell.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by storing and reusing rare or patient-derived cells for extended analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable single-cell platform for multi-omic and iterative epigenetic studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in epigenetic target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows and enhances reproducibility by minimizing inter-cell variability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by extracting maximal data from limited samples.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of epigenetic targets and biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell handling, epigenomic assays, and proximity ligation techniques.
- Demands access to sequencing platforms and analytical infrastructure for multi-marker data integration.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptation may be needed for different cell types or disease models based on antibody availability.
- Long-term storage and reuse protocols must be validated for each application to ensure data integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:32
Preparation of Reusable Single Cells: Manual Version
3:09
Random Primer Annealing and Extension
4:09
Antibody Binding and Proximity Ligation of Antibody Probe and Proximally Extended Random Primer
5:25
Full Extension of the 1st Random Primer and Multiple Displacement Amplification
7:32
Results: Single Cell Multiepigenomic Analysis
9:26
Conclusion
