可重复使用的单细胞用于迭代表观基因组分析

该实验方法允许对可重复使用的单细胞进行长期保存，以用于表观基因组检测。同时，它还能够在同一个单细胞中分析多种表观遗传标记和转录因子。在现有的单细胞表观基因组分析方法中，无法对同一单细胞进行重复分析。

然而，使用可重复利用的单细胞，可以对相同的单个细胞进行多次重新分析。该技术在诊断和设计表观遗传治疗方案中具有重要价值，尤其是在患者细胞数量有限的情况下。只要存在针对表观遗传标记的特异性抗体，该方法便适用于表观基因组、基因表达调控及其他相关系统的研究。

初次尝试该技术时，我们建议您使用不太珍贵的样品进行练习，并通过浅层测序（如 MiSeq 或 iSeq 100）验证实验结果。开始操作时，在洁净的超净工作台中，将 1 毫升细胞悬液与 199 毫升含有 DNA 插入染料的 1 毫摩尔 EDTA PBS 混合。混匀后，将 200 微升细胞悬液转移至平底 96 孔板的每个孔中。

将盖子盖在96孔板上，使用扫描显微镜对板进行扫描。接着倾斜孔板，静置数分钟，直至单个细胞沉降至孔的底部边缘。然后将移液器吸头置于孔的底部角落，将单个细胞及其缓冲液转移至PCR管中。

使用荧光显微镜检查孔内情况以确认转移效果。如果孔中仍有单个细胞，则每孔加入 200 µL 含有 DNA 插入染料的 1 mM EDTA PBS，并重复转移步骤。转移完成后，盖上 96 孔 PCR 板的盖子，并使用水平转子离心机离心该板，离心时不要刹车。

离心后，将培养板放置在自动液体处理机器人的工作台上。接下来，将补充代码一拖放到液体处理机器人的软件窗口中，并运行程序，以极慢的移液速度去除195 µL上清液。加入50 µL 4% TEMED或矿物油，并在室温下孵育过夜。

第二天，用移液器吸除矿物油，再用200微升TP镁阴性缓冲液洗涤细胞5次。最后一次洗涤后，吸去上清液，加入15微升退火缓冲液，冰上孵育1小时。孵育结束后，将PCR管置于热循环仪中，94摄氏度加热3分钟。

然后将试管转移至冰上预冷的金属块中，孵育两分钟。接着加入4 µL硫酸镁-氯化钠溶液和dNTP混合液，最大速度涡旋混匀。然后加入1 µL BST DNA聚合酶大片段，涡旋混匀后，在摇床中孵育4小时。

孵育后，将PCR管置于热循环仪中，按照文中所述运行4小时或过夜程序。进行抗体结合时，向管中加入1.625 µL氯化钠EDTA BSA溶液。低速涡旋混匀，并将管置于冰上孵育1小时。

然后加入终浓度为0.1微克/毫升的抗体以及与抗体探针偶联的对照IgG。加入抗体后，将试管置于冰上，轻轻振荡孵育。次日，在冰上用200微升TPM-T缓冲液洗涤细胞两次。

然后去除上清液，并用T4 DNA连接酶缓冲液洗涤一次。接着，加入19微升连接接头溶液，在25摄氏度下孵育1小时。随后，加入1微升T4 DNA连接酶，用中等速度涡旋振荡混匀管内溶液。

将离心管放入热循环仪中，运行邻近连接程序。程序结束后，用200微升BST镁离子阴性、EDTA阳性缓冲液洗涤细胞两次，并将细胞在4摄氏度下过夜保存。次日，用200微升BST镁离子阴性、EDTA阴性缓冲液洗涤细胞两次，然后加入20微升含有BST、dNTPs和硫酸镁的混合液。

然后使用涡旋混合器混匀，并将离心管置于摇床中孵育4小时。孵育结束后，将离心管放入热循环仪中，按照文本稿件中的描述运行完整的延伸程序。接下来，进行多重置换扩增时，加入0.4 µL浓度为100 µM的第二轮随机引物，通过涡旋混合均匀。

然后，将离心管置于摇床中孵育两小时，随后将离心管放入热循环仪中，在94摄氏度下加热。三分钟后，将离心管置于冰上冷却的金属块中，并加入1 µL BST DNA聚合酶。以低速涡旋振荡离心管。

然后将试管放入热循环仪中，运行多重置换扩增程序。程序结束后，转移约 20 µL 上清液至一个 PCR 管中，并在 -80 °C 下保存。接下来，向含有可重复使用单细胞的 PCR 管中加入 20 µL 0.05% TWEEN 20 和 0.1X TE 缓冲液，在 4 °C 条件下过夜孵育。

次日，收集上清液，并将其与之前收集的上清液合并。然后，将可重复使用的单细胞浸泡于含有50%甘油、5 mmol/L EDTA、0.5% BSA和0.05% TWEEN 20的TBS缓冲液中，在摇床中孵育30分钟。孵育结束后，将可重复使用的单细胞置于-20°C保存，以备后续使用。

最后，加入40 µL Exo阴性主混合液，将试管置于热循环仪中，按照文本稿件中描述的程序运行。使用本方案生成了可重复利用的K562单细胞。单细胞被包埋在聚丙烯酰胺微球的外层，并利用DNA嵌入染料进行染色后观察。

BciVI 酶切前后 DNA 产物如图所示。限制性酶切产生了预期的 19 至 20、31 至 32、49 以及大于 49 个碱基对的片段。此外，通过毛细管电泳对构建的 DNA 文库进行了分析，以检测目标产物。

测序结果表明，抗组蛋白H3乙酰化赖氨酸27和抗组蛋白H3三甲基化赖氨酸27的唯一比对读段数量显著多于对照IgG。通过将REpi测序数据与整体ChIP测序数据进行比较，评估了REpi测序信号。平均而言，约91%的REpi测序获得的组蛋白H3乙酰化赖氨酸27信号与整体ChIP测序中的组蛋白H3乙酰化赖氨酸27峰重叠。

REpi测序对失活组蛋白标记——组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（histone H3 trimethylated lysine 27）的精确度为52%。通过分析REpi测序能够检测到多少个bulk ChIP测序的峰，并以重现性读段进行衡量，评估REpi测序的灵敏度。REpi测序在组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（histone H3 acetylated lysine 27）中的灵敏度为55.30%，在组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化中的灵敏度为50.94%。请确保使用无DNase的试剂。

此外，所有涉及打开管盖或试剂管盖的操作均应在洁净罩内进行。该实验所获得的DNA产物经过测序后，可比对至基因组，以揭示单个细胞中基因组哪些区域存在何种组蛋白修饰。该技术使得在同一个单细胞中分析多种表观遗传标记成为可能，并为任意单细胞的多组学分析奠定了基础。