Name: 用于迭代表观基因组分析的可重复使用的单细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 了解可重复使用单细胞技术用于迭代表观基因组分析的方法。该技术支持对同一细胞进行多次表观遗传标记分析，特别适用于患者细胞数量有限的情况，有助于基因表达调控研究和表观遗传治疗设计。

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我们感谢 David Sanchez-Martin 博士和 Christopher B. Buck 博士在本项目构思阶段提出的宝贵意见。我们还感谢美国国立卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心基因组学核心实验室在初步实验中提供的帮助，以及癌症研究中心协作生物信息资源（CCR, NCI, NIH）在计算分析方面给予的建议。我们感谢 Anna Word 女士在优化本方法所用DNA聚合酶过程中提供的协助。本研究使用了美国国立卫生研究院高性能计算生物云集群（NIHHPC Biowulf cluster，http://hpc.nih.gov）的计算资源。本项目得到了国家癌症研究所癌症研究中心院内计划、国家癌症研究所主任创新奖（#397172）以及美国国家癌症研究所合同编号 HHSN261200800001E 项下联邦资金的资助。我们感谢 Tom Misteli 博士、Carol Thiele 博士、Douglas R. Lowy 博士以及细胞肿瘤学实验室全体成员提出的富有建设性的意见。&#160;

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<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781(2018).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+potential+identified+by+shared+single-cell+profiling+of+RNA+and+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra+high-throughput+method+for+single-cell+joint+analysis+of+open+chromatin+and+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).</li>
<li>Zhu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+profiling+of+histone+modifications+and+transcriptome+in+single+cells+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain.</a> Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).</li>
<li>Mimitou, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable%2C+multimodal+profiling+of+chromatin+accessibility%2C+gene+expression+and+protein+levels+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells.</a> Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).</li>
<li>Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+epigenomic+analyses+in+the+same+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Iterative epigenomic analyses in the same single cell.</a> Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).</li>
<li>Tosato, G., Ohnuki, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTosato%2C+G+%22Methods+of+preparing+a+re-usable+single+cell+and+methods+fro+analyzing+the+epigenome%2C+transcriptome%2C+and+genome+of+a+single+cell%22">Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell</a>. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).</li>
<li>Harada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+integration+labelling+method+enables+epigenomic+profiling+with+lower+input%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input.</a> Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
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<li>Weast, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeast%2C+RC+%22Handbook+of+chemistry+and+physics%3A+a+ready-reference+book+of+chemical+and+physical+data.+56th+edn%22">Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn</a>. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).</li>
<li>Aydin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+history%2C+principles%2C+and+types+of+ELISA%2C+and+our+laboratory+experience+with+peptide%2Fprotein+analyses+using+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.</a> Peptides. 72, 4-15 (2015).</li>
<li>Gan, S. D., Patel, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+and+enzyme-linked+immunosorbent+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).</li>
<li>Porstmann, T., Kiessig, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassay+techniques.+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassay techniques. An overview.</a> Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).</li>
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<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+library+prep+approaches+for+sequencing+low+input+translatome+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples.</a> BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
<li>Ku, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+chromatin+immunocleavage+sequencing+%28scChIC-seq%29+to+profile+histone+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification.</a> Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).</li>
<li>Carter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+histone+modifications+in+low+cell+number+and+single+cells+using+antibody-guided+chromatin+tagmentation+%28ACT-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq).</a> Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

Ohnuki 博士和 Tosato 博士是专利“用于制备可重复使用的单细胞以及用于分析单细胞表观基因组、转录组和基因组的方法”（EP3619307 和 US20200102604）的共同发明人。该专利申请部分基于与本文所述技术相关的初步研究结果。本专利申请中描述并主张的发明是在发明人作为美国政府全职雇员期间完成的。因此，根据《美国联邦法规》第45篇第7部分，该专利申请的全部权利、所有权和权益已依法归属或应依法归属于美国政府。美国政府根据《美国法典》第15篇的规定，将其所获部分专利使用费授予其雇员发明人。 &#167; 3710c

本文介绍了近期报道的利用可重复使用单细胞进行单细胞多表观基因组分析的逐步实验方案7。在接下来的段落中，我们将讨论该方案的关键要点，并强调其中可能存在的局限性。
在整个实验方案中（从步骤 7.2 到 13），一个关键点是避免 DNase 污染。单个细胞仅含有两份基因组 DNA，因此基因组 DNA 的损伤会显著降低信号数量。避免 DNase 污染对于保护基因组 DNA 的完整性至关重要。
试剂穿过细胞膜/细胞壁的通透性在整个实验过程中也至关重要。REpi-seq 被设计用于在单细胞水平上分析小鼠和人类细胞的表观基因组。该实验方法的最佳条件可能因不同细胞类型以及核膜对各种试剂的通透性差异而有所不同。因此，当该方法应用于小鼠和人类细胞以外的细胞（如植物细胞、酵母和细菌）时，需对每一步的实验条件进行优化。
我们认为，第9.5步（退火第一个随机引物）的一个关键点在于基因组DNA变性后的快速冷却速度。变性后若缓慢渐进地冷却，可能会降低随机...

单细胞技术正在进入单细胞多组学时代，该时代整合了多种独立的单细胞组学技术1。近年来，单细胞转录组学已与检测染色质可及性（scNMT-seq2 和 SHARE-seq3）或组蛋白修饰（Paired-seq4 和 Paired-Tag5）的方法相结合。最近，单细胞转录组学和蛋白质组学进一步与染色质可及性检测实现了整合（DOGMA-seq6）。这些方法均采用基于转座酶的标记技术来检测染色质可及性或组蛋白修饰。
基于转座酶的方法可切割基因组DNA，并在基因组DNA片段末端添加DNA条形码。每个被切割的基因组片段最多只能连接两个DNA条形码（即每个切割位点对应一个表观遗传标记），且切割位点处的基因组DNA会丢失。因此，基于切割的方法在检测的表观遗传标记数量与信号密度之间存在权衡。这限制了在同一单细胞中对多个表观遗传标记的分析。为克服这一问题，已开发出一种不切割基因组DNA的单细胞表观基因组学方法7,8。
除了上述由切割引起的问 题之外，基于转座酶的方法还存在其他局限性。在单细胞表观基因组分析中，明确组蛋白及DNA相关蛋白在基因组上的位置至关重要。目前的方法依赖于未固定的单细胞，并保留蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质相互作用来实现这一目标。然而，这种方法即使在分析组蛋白修饰时，也会对染色质的可及区域产生强烈偏好性9。利用聚丙烯酰胺支架，可以在无需交联蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质相互作用的情况下，保留组蛋白及基因组相关蛋白在基因组上的位置7,8。该方法可减少当前依赖蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质相互作用的方法中存在的结构偏好性。
基于转座酶的方法只能从单个细胞中获取一次信号，因此由于信号的丢失，很难描绘出单个细胞完整的表观基因组。为克服当前的局限性，已开发出可重复使用的单细胞，能够在同一个单细胞中进行迭代的表观基因组分析。

<table><tbody><tr><td>10x CutSmart 缓冲液</td><td>New England BioLabs</td><td>B6004</td><td>10x 消化缓冲液</td></tr><tr><td>200 proof 乙醇</td><td>华纳-格雷厄姆公司</td><td>200 proof</td><td>乙醇</td></tr><tr><td>5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）单克隆抗体 [HMC/4D9]</td><td>Epigentek</td><td>A-1018-100</td><td>抗-5hmC</td></tr><tr><td>吖啶橙/碘化丙啶染色</td><td>Logos Biosystems</td><td>F23001</td><td>细胞计数仪</td></tr><tr><td>丙烯酰胺溶液，40% 溶于 H2O，分子生物学用</td><td>MilliporeSigma</td><td>01697-500ML</td><td>40% 丙烯酰胺溶液</td></tr><tr><td>一体化荧光显微镜BZ-X710</td><td>Keyence</td><td>BZ-X710</td><td>扫描显微镜</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 离心滤过装置</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC510024</td><td>超滤离心管</td></tr><tr><td>分子生物学用过硫酸铵</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3678-100G</td><td>过硫酸铵粉末</td></tr><tr><td>无水 DMF</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-4001-005</td><td>无水 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）</td></tr><tr><td>抗RNA聚合酶II CTD重复序列YSPTSPS（磷酸化S5）抗体 [4H8]</td><td>Abcam</td><td>ab5408</td><td>抗Pol II</td></tr><tr><td>抗TRAP220/MED1（磷酸化T1457）抗体</td><td>Abcam</td><td>ab60950</td><td>抗Med1</td></tr><tr><td>BciVI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0596L</td><td>BciVI</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白溶液，20 mg/mL，溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，低生物负载，无蛋白酶，用于分子生物学</td><td>MilliporeSigma</td><td>B8667-5ML</td><td>20% BSA（表7）</td></tr><tr><td>Bst DNA聚合酶，大片段</td><td>New England BioLabs</td><td>M0275L</td><td>Bst DNA聚合酶</td></tr><tr><td>BT10 系列 10 &amp;micro;l 屏障尖端</td><td>NEPTUNE</td><td>BT10</td><td>P10 低吸附吸头</td></tr><tr><td>CellCelector</td><td>自动化实验室解决方案</td><td>N/A</td><td>自动化单细胞挑选机器人</td></tr><tr><td>CellCelector 4 nl 微孔板，用于单细胞克隆，型号 S200-100 100K，24 孔，超低吸附</td><td>自动化实验室解决方案</td><td>CC0079</td><td>4 nL 纳米孔板</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>氯仿</td></tr><tr><td>康宁科斯特96孔细胞培养处理平底微孔板</td><td>康宁</td><td>3596</td><td>平底96孔板</td></tr><tr><td>Deep Vent (exo-) DNA聚合酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0259L</td><td>外泌体&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt; DNA聚合酶</td></tr><tr><td>DNA LoBind 离心管，0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108035</td><td>0.5 mL DNA低吸附管</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，第一随机引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>第一随机引物</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#01</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>第二轮随机引物</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#02</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>第二轮随机引物</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞编号03</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>第二轮随机引物</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#04</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>第二轮随机引物</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#05</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>第二轮随机引物</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞编号06</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>第二轮随机引物</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#07</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>第二轮随机引物</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#08</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>第二轮随机引物</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#09</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>第二轮随机引物</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#10</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>第二轮随机引物</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#11</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>第二轮随机引物</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#12</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>第二轮随机引物</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，第二条合成引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>第二条合成引物</td></tr><tr><td>DNA 寡核苷酸，连接接头</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>连接接头</td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸，逆转录引物</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>反转录引物</td></tr><tr><td>DNase I（无RNase）</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>M0303L</td><td>DNase I（无RNase，4 U）</td></tr><tr><td>DNase I 反应缓冲液</td><td>New England BioLabs</td><td>B0303S</td><td>10x DNase I 缓冲液（NEB）</td></tr><tr><td>dNTP混合液（各10 mM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0192</td><td>10 mM dNTPs</td></tr><tr><td>胎牛血清，美国来源，已灭活处理</td><td>MilliporeSigma</td><td>F4135-500ML</td><td>胎牛血清</td></tr><tr><td>HiScribe T7 高产 RNA 合成试剂盒</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>E2040S</td><td>体外转录主混合液</td></tr><tr><td>组蛋白H3K27ac抗体</td><td>活性基序</td><td>39133</td><td>抗H3K27ac</td></tr><tr><td>组蛋白H3K27me3抗体</td><td>活性基序</td><td>39155</td><td>抗H3K27me3</td></tr><tr><td>兔血清中的IgG</td><td>Millipore Sigma</td><td>I5006-10MG</td><td>对照 IgG</td></tr><tr><td>四氧化三铁磁性纳米粉末，平均粒径30 nm（TEM），N-羟基琥珀酰亚胺酯功能化</td><td>MilliporeSigma</td><td>747467-1G</td><td>NHS酯功能化的30 nm氧化铁粉末</td></tr><tr><td>K-562</td><td>美国典型培养物保藏中心（ATCC）</td><td>CCL-243</td><td>细胞</td></tr><tr><td>线性聚丙烯酰胺（5 mg/mL）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9520</td><td>线性丙烯酰胺</td></tr><tr><td>LUNA-FL 双荧光细胞计数仪</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>细胞计数仪</td></tr><tr><td>LUNA 细胞计数板，50 片</td><td>Logos Biosystems</td><td>L12001</td><td>细胞计数仪</td></tr><tr><td>矿物油，生物试剂，分子生物学用，轻质油</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5904-500ML</td><td>矿物油</td></tr><tr><td>N,N,N&amp;prime;，N&amp;prime;-分子生物学用四甲基乙二胺</td><td>MilliporeSigma</td><td>T7024-100ML</td><td>N,N,N&amp;prime;，N&amp;prime;四甲基乙二胺</td></tr><tr><td>NaCl (5 M)，无RNase</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9760G</td><td>5M NaCl</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>2516</td><td>&amp;nbsp;微量分光光度计</td></tr><tr><td>NEST 2 mL 96孔深孔板，V型底</td><td>Opentrons</td><td>N/A</td><td>96孔深孔板，每孔2 mL</td></tr><tr><td>无裙边96孔PCR板</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-405</td><td>96孔PCR板</td></tr><tr><td>NuSive GTG 琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50081</td><td>琼脂糖</td></tr><tr><td>OmniPur 丙烯酰胺：双丙烯酰胺 19:1，40% 溶液</td><td>MilliporeSigma</td><td>1300-500毫升</td><td>40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺</td></tr><tr><td>OT-2 实验室机器人</td><td>Opentrons</td><td>OT2</td><td>自动化液体处理机器人</td></tr><tr><td>多聚甲醛，电镜级，纯化，20% 水溶液</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15713</td><td>20% 甲醛</td></tr><tr><td>PBS（10倍浓度），pH 7.4</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>70011044</td><td>10x PBS</td></tr><tr><td>PIPETMAN Classic P1000</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>一个P1000移液器</td></tr><tr><td>蛋白低吸附管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>925000090</td><td>1.5 mL 蛋白低吸附管</td></tr><tr><td>QIAgen 胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>一个P1000移液器</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P11495</td><td>&amp;nbsp;dsDNA特异性嵌入染料</td></tr><tr><td>快速连接试剂盒</td><td>New England BioLabs</td><td>M2200L</td><td>T4 DNA连接酶（NEB）</td></tr><tr><td>RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10777019</td><td>RNase抑制剂</td></tr><tr><td>S-4FB 交联剂（DMF 可溶）</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1004-105</td><td>琥珀酰亚胺基-4-甲醛苯甲酸酯（S-4FB）</td></tr><tr><td>S-HyNic</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1002-105</td><td>乙酰丙酮腙琥珀酰亚胺-6-酰肼基烟酸酯（S-HyNic）</td></tr><tr><td>醋酸钠，3 M，pH 5.2，分子生物学级</td><td>MilliporeSigma</td><td>567422-100ML</td><td>3M 醋酸钠（pH 5.2）</td></tr><tr><td>碳酸氢钠，1 M 缓冲液，pH 8.5</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60408</td><td>1 M 碳酸氢钠缓冲液，pH 8.5</td></tr><tr><td>分子生物学用磷酸氢二钠</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3264-250G</td><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO4</td></tr><tr><td>分子生物学用磷酸二氢钠</td><td>MilliporeSigma</td><td>S3139-250G</td><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO4</td></tr><tr><td>SuperScript IV 逆转录酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>18090050</td><td>逆转录酶</td></tr><tr><td>SYBR Gold 核酸凝胶染料（DMSO 中 10,000 倍浓缩液）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S11494</td><td>一种用于DNA的嵌入染料</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶反应缓冲液</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td>10x T4 DNA连接酶反应缓冲液</td></tr><tr><td>ThermoPol反应缓冲液套装</td><td>New England BioLabs</td><td>B9004S</td><td>10倍TPM-T缓冲液（Tris-HCl/氯化钾/硫酸镁/Triton X-100）</td></tr><tr><td>TRIzol LS 试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10296-028</td><td>异硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提法</td></tr><tr><td>TruSeq Nano DNA文库制备试剂盒</td><td>Illumina</td><td>20015965</td><td>DNA文库制备试剂盒（另请参阅生产商说明书）</td></tr><tr><td>Ultramer DNA 寡核苷酸，Anti-5hmC_Ab#005</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>用于抗体的氨基修饰DNA探针</td></tr><tr><td>Ultramer DNA 寡核苷酸，Anti-H3K27ac_Ab#002</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>用于抗体的胺基修饰DNA探针</td></tr><tr><td>Ultramer DNA 寡核苷酸，Anti-H3K27me3_Ab#003</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>用于抗体的氨基修饰DNA探针</td></tr><tr><td>Ultramer DNA 寡核苷酸，Anti-Med1_Ab#004</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>用于抗体的氨基修饰DNA探针</td></tr><tr><td>Ultramer DNA 寡核苷酸，抗 Pol II_Ab#006</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>用于抗体的氨基修饰DNA探针</td></tr><tr><td>Ultramer DNA 寡核苷酸，对照 IgG_Ab#001</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A，参见表3</td><td>用于对照 IgG 的胺基修饰 DNA 探针</td></tr><tr><td>UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15575020</td><td>0.5 M EDTA，pH 8.0</td></tr><tr><td>UltraPure 无DNase/RNase纯水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10977023</td><td>超纯水</td></tr><tr><td>Zeba™ 脱盐柱，7K 分子量截留值，0.5 mL</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>89882</td><td>脱盐柱</td></tr></tbody></table>

可重复使用的单细胞用于迭代表观基因组分析

Reusable Single Cell for Iterative Epigenomic Analyses

目前的单细胞表观基因组分析设计为一次性使用。细胞在单次使用后即被丢弃，无法在同一个细胞中分析多个表观遗传标记，且需要依赖其他细胞的数据来区分单个细胞中的信号与实验背景噪声。本文描述了一种可对同一个个细胞进行多次表观基因组分析的重复使用方法。
在该实验方法中，首先将细胞蛋白锚定在聚丙烯酰胺聚合物上，而非将其交联至蛋白和DNA上，从而减轻了结构偏差。这一关键步骤使得对同一个单细胞可进行多次重复实验。接着，将带有邻近连接接头序列的随机引物退火至基因组DNA，并利用DNA聚合酶通过延伸反应将基因组序列添加至引物上。随后，在同一个单细胞中，分别用携带不同DNA探针标记的针对表观遗传标记物的抗体和对照IgG抗体结合各自的靶标。
通过添加一段连接DNA，使其与随机引物的支架序列以及抗体-DNA探针互补，从而诱导随机引物与抗体之间的邻近连接。该方法将抗体信息与邻近的基因组序列整合到单一的邻近连接DNA产物中。通过允许对同一个单细胞进行重复实验，此方法可提高稀有细胞的数据密度，并仅利用同一细胞内的IgG和抗体数据进行统计分析。采用该方法制备的可重复使用单细胞可保存至少数月，并可在后续重新使用，以拓展表观遗传学特征分析并提高数据密度。该方法为研究人员及其研究项目提供了灵活性。

使用第8步所述方案制备K562单细胞（见图5）。将单细胞包埋于聚丙烯酰胺微球的外层。采用DNA嵌入染料对细胞DNA进行染色并可视化观察。
<img alt="用于光学研究中标记分析的液体内微滴显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63456/63456fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：生成的可重复使用单细胞。 细胞使用DNA嵌入染料染色（绿色荧光）。白色箭头指示嵌入聚丙烯酰胺微珠外层的单细胞。可重复使用的单细胞被置于96孔平底板中。图像由BZ-X710扫描显微镜拍摄。比例尺 = 1 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63456/63456fig...

本方案描述了一种利用可重复使用的单个细胞进行多轮表观基因组分析的单细胞方法。这种可重复使用的单个细胞允许在同一个单细胞中分析多种表观遗传标记，并对结果进行统计学验证。

当前的单细胞表观基因组分析设计为一次性使用。细胞在单次使用后即被丢弃，无法进行多次表观遗传学分析……

该实验方法允许对可重复使用的单细胞进行长期保存，以用于表观基因组检测。同时，它还能够在同一个单细胞中分析多种表观遗传标记和转录因子。在现有的单细胞表观基因组分析方法中，无法对同一单细胞进行重复分析。然而，使用可重复利用的单细胞，可以对相同的单个细胞进行多次重新分析。该技术在诊断和设计表观遗传治疗方案中具有重要价值，尤其是在患者细胞数量有限的情况下。只要存在针对表观遗传标记的特异性抗体，该方法便适用于表观基因组、基因表达调控及其他相关系统的研究。初次尝试该技术时，我们建议您使用不太珍贵的样品进行练习，并通过浅层测序（如 MiSeq 或 iSeq 100）验证实验结果。开始操作时，在洁净的超净工作台中，将 1 毫升细胞悬液与 199 毫升含有 DNA 插入染料的 1 毫摩尔 EDTA PBS 混合。混匀后，将 200 微升细胞悬液转移至平底 96 孔板的每个孔中。将盖子盖在96孔板上，使用扫描显微镜对板进行扫描。接着倾斜孔板，静置数分钟，直至单个细胞沉降至孔的底部边缘。然后将移液器吸头置于孔的底部角落，将单个细胞及其缓冲液转移至PCR管中。使用荧光显微镜检查孔内情况以确认转移效果。如果孔中仍有单个细胞，则每孔加入 200 µL 含有 DNA 插入染料的 1 mM EDTA PBS，并重复转移步骤。转移完成后，盖上 96 孔 PCR 板的盖子，并使用水平转子离心机离心该板，离心时不要刹车。离心后，将培养板放置在自动液体处理机器人的工作台上。接下来，将补充代码一拖放到液体处理机器人的软件窗口中，并运行程序，以极慢的移液速度去除195 µL上清液。加入50 µL 4% TEMED或矿物油，并在室温下孵育过夜。第二天，用移液器吸除矿物油，再用200微升TP镁阴性缓冲液洗涤细胞5次。最后一次洗涤后，吸去上清液，加入15微升退火缓冲液，冰上孵育1小时。孵育结束后，将PCR管置于热循环仪中，94摄氏度加热3分钟。然后将试管转移至冰上预冷的金属块中，孵育两分钟。接着加入4 µL硫酸镁-氯化钠溶液和dNTP混合液，最大速度涡旋混匀。然后加入1 µL BST DNA聚合酶大片段，涡旋混匀后，在摇床中孵育4小时。孵育后，将PCR管置于热循环仪中，按照文中所述运行4小时或过夜程序。进行抗体结合时，向管中加入1.625 µL氯化钠EDTA BSA溶液。低速涡旋混匀，并将管置于冰上孵育1小时。然后加入终浓度为0.1微克/毫升的抗体以及与抗体探针偶联的对照IgG。加入抗体后，将试管置于冰上，轻轻振荡孵育。次日，在冰上用200微升TPM-T缓冲液洗涤细胞两次。然后去除上清液，并用T4 DNA连接酶缓冲液洗涤一次。接着，加入19微升连接接头溶液，在25摄氏度下孵育1小时。随后，加入1微升T4 DNA连接酶，用中等速度涡旋振荡混匀管内溶液。将离心管放入热循环仪中，运行邻近连接程序。程序结束后，用200微升BST镁离子阴性、EDTA阳性缓冲液洗涤细胞两次，并将细胞在4摄氏度下过夜保存。次日，用200微升BST镁离子阴性、EDTA阴性缓冲液洗涤细胞两次，然后加入20微升含有BST、dNTPs和硫酸镁的混合液。然后使用涡旋混合器混匀，并将离心管置于摇床中孵育4小时。孵育结束后，将离心管放入热循环仪中，按照文本稿件中的描述运行完整的延伸程序。接下来，进行多重置换扩增时，加入0.4 µL浓度为100 µM的第二轮随机引物，通过涡旋混合均匀。然后，将离心管置于摇床中孵育两小时，随后将离心管放入热循环仪中，在94摄氏度下加热。三分钟后，将离心管置于冰上冷却的金属块中，并加入1 µL BST DNA聚合酶。以低速涡旋振荡离心管。然后将试管放入热循环仪中，运行多重置换扩增程序。程序结束后，转移约 20 µL 上清液至一个 PCR 管中，并在 -80 °C 下保存。接下来，向含有可重复使用单细胞的 PCR 管中加入 20 µL 0.05% TWEEN 20 和 0.1X TE 缓冲液，在 4 °C 条件下过夜孵育。次日，收集上清液，并将其与之前收集的上清液合并。然后，将可重复使用的单细胞浸泡于含有50%甘油、5 mmol/L EDTA、0.5% BSA和0.05% TWEEN 20的TBS缓冲液中，在摇床中孵育30分钟。孵育结束后，将可重复使用的单细胞置于-20°C保存，以备后续使用。最后，加入40 µL Exo阴性主混合液，将试管置于热循环仪中，按照文本稿件中描述的程序运行。使用本方案生成了可重复利用的K562单细胞。单细胞被包埋在聚丙烯酰胺微球的外层，并利用DNA嵌入染料进行染色后观察。BciVI 酶切前后 DNA 产物如图所示。限制性酶切产生了预期的 19 至 20、31 至 32、49 以及大于 49 个碱基对的片段。此外，通过毛细管电泳对构建的 DNA 文库进行了分析，以检测目标产物。测序结果表明，抗组蛋白H3乙酰化赖氨酸27和抗组蛋白H3三甲基化赖氨酸27的唯一比对读段数量显著多于对照IgG。通过将REpi测序数据与整体ChIP测序数据进行比较，评估了REpi测序信号。平均而言，约91%的REpi测序获得的组蛋白H3乙酰化赖氨酸27信号与整体ChIP测序中的组蛋白H3乙酰化赖氨酸27峰重叠。REpi测序对失活组蛋白标记——组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（histone H3 trimethylated lysine 27）的精确度为52%。通过分析REpi测序能够检测到多少个bulk ChIP测序的峰，并以重现性读段进行衡量，评估REpi测序的灵敏度。REpi测序在组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（histone H3 acetylated lysine 27）中的灵敏度为55.30%，在组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化中的灵敏度为50.94%。请确保使用无DNase的试剂。此外，所有涉及打开管盖或试剂管盖的操作均应在洁净罩内进行。该实验所获得的DNA产物经过测序后，可比对至基因组，以揭示单个细胞中基因组哪些区域存在何种组蛋白修饰。该技术使得在同一个单细胞中分析多种表观遗传标记成为可能，并为任意单细胞的多组学分析奠定了基础。

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