通过无创经鼻途径在免疫功能健全小鼠脑内移植人诱导多能干细胞来源的小胶质细胞
2022年5月31日
本文介绍的实验方案允许通过鼻腔途径将诱导多能干细胞来源的人小胶质细胞（iPSMG）移植到免疫功能健全的小鼠脑内。文中展示了细胞的制备与鼻腔移植方法，以及为维持iPSMG存活而给予细胞因子混合物的操作步骤。
本方案通过将CSF1受体拮抗剂PLX5622的药理学开关与经鼻移植相结合，实现了在免疫功能健全的小鼠脑内进行非侵入性iPSMG移植。该技术的主要优势在于，即使在免疫功能健全的小鼠中，也能在不引起脑组织损伤的情况下完成iPSMG的移植。未来，小胶质细胞移植可能成为一种潜在的治疗方法，用于在多种神经退行性疾病中以功能正常的小胶质细胞替换功能失调的细胞。
本实验操作将由我实验室的研究人员 Bijay Parajuli 示范。首先，在37摄氏度水浴中快速解冻冻存的诱导多能干细胞来源的人小胶质细胞。轻轻摇动样品，直至所有可见冰晶完全融化。
将解冻的iPSMG加入预热至37摄氏度的培养基中。将1毫升细胞加入10毫升培养基中。以300 × g离心5分钟，获得细胞沉淀。
去除上清液时不要扰动细胞沉淀。加入移植培养基，使细胞浓度达到每微升10的5次方个细胞。将iPSMG置于冰上，并立即进行移植操作。
为进行经鼻移植，需先用含有PLX的饲料喂养雄性小鼠7天。在第7天结束时，停止给予含PLX的饲料，改为正常饲料喂养。在经鼻移植iPSMG前1小时，使用10微升移液器枪头，向每侧鼻孔分两次各给予2.5 µL的PBS缓冲液配制的透明质酸酶，以增加鼻黏膜通透性。
在应用透明质酸酶后，将小鼠置于仰卧位。在iPSMG经鼻移植前10分钟，给予2.5 µL透明质酸酶。使用10 µL移液器吸头，将2.5 µL细胞悬液注入小鼠一侧鼻孔。
在给予细胞悬液之前，将小鼠置于仰卧位5分钟，然后向另一侧鼻孔给予细胞悬液。共给予四次，每只动物总容积为20 µL。在停止PLX喂养48小时后，对同一批小鼠重复给予透明质酸酶和细胞悬液。
对于细胞因子的给药，使用10微升移液枪头将2.5微升移植培养基加入小鼠的一个鼻孔中。经两个月的经鼻移植后，可通过计数同时表达人源特异性标记和全小胶质细胞标记的细胞数量来确定移植细胞的数量。内源性小鼠小胶质细胞仅表达全小胶质细胞标记。
在对照小鼠中，皮层和海马中仅检测到小鼠小胶质细胞。在移植iPSMG小鼠的皮层中，仅检测到小鼠小胶质细胞，而在海马中则检测到iPSMG。尝试本方案时，必须完全去除上清液，以防止细胞因子被稀释。
每隔12小时应用一次细胞因子对移植细胞的存活至关重要。iPSMG的移植需要耗竭内源性小鼠小胶质细胞。该操作允许将iPSMG移植到正常或患病的小鼠脑中。
因此，可以确定iPSMG的特征及其对疾病反应的情况。该技术适用于确定iPSMG在小鼠脑内的体内特征。将iPSMG移植到疾病模型小鼠体内，将有助于我们理解其反应，并可能为新的治疗靶点开辟道路。
概述
本研究介绍了一种通过鼻腔途径将诱导多能干细胞来源的人源小胶质细胞（iPSMG）非侵入性移植到免疫功能健全小鼠脑内的方法。该方案利用细胞因子给药及内源性小胶质细胞的清除，促进iPSMG的有效整合，有望为神经退行性疾病的治疗策略开辟新路径。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞研究
- 小胶质细胞生物学
背景
- 诱导性多能干细胞可分化为功能性小胶质细胞。
- 小胶质细胞功能障碍与多种神经退行性疾病相关。
- 经鼻递送为细胞移植提供了一种新方法。
- 移植后给予细胞因子对维持细胞活力至关重要。
研究目的
- 建立一种非侵入性的小胶质细胞移植方法。
- 评估经鼻递送在维持正常脑功能方面的可行性。
- 评价iPSMG替代功能障碍小胶质细胞的潜力。
使用的方法
- 主要平台涉及在免疫功能健全的小鼠中进行经鼻移植iPSMG。
- 雄性小鼠预先用CSF1受体拮抗剂PLX5622和透明质酸酶溶液处理，以增强鼻腔通透性。
- 细胞悬液在特定时间范围内分多次给药，以确保细胞正确整合。
- 移植后监测包括评估移植细胞的存在情况和存活能力。
主要结果
- 移植的iPSMG成功整合到小鼠海马体中，且未损伤内源性小胶质细胞。
- 每12小时给予细胞因子对维持移植后细胞活力至关重要。
- 该方法可用于检测iPSMG在正常和疾病模型中的反应。
结论
- 该方案有助于在体内研究诱导性小胶质样细胞（iPSMG），可为神经退行性疾病的未来基因治疗提供参考。
- 了解移植后小胶质细胞的行为有助于阐明其在脑健康中的作用。
- 该方法可能为治疗小胶质细胞相关疾病开辟新的治疗靶点。
常见问题
行业高管相关性
将人源诱导多能干细胞（iPSC）分化的小胶质细胞以非侵入性方式移植到免疫功能健全的小鼠大脑中，可实现对人类小胶质细胞功能及其疾病反应的直接体内研究。该方法弥补了啮齿类与人类小胶质细胞之间的转化研究鸿沟，为神经退行性疾病研究提供了更具预测性的临床前模型。该实验方案有助于在早期发现阶段和临床前关键节点加强靶点验证与机制风险排除。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在哺乳动物脑环境中对人源小胶质细胞生物学进行活体研究。
- 通过区分人源特异性小胶质细胞反应与小鼠模型的差异，支持作用机制的去风险化研究。
- 促进针对神经炎症和神经退行性病变通路的功能性靶点验证。
筛选与检测方法开发
- 提供了一种经过验证的系统，用于评估人源小胶质细胞在体内的整合能力与存活状态。
- 利用特异性标记物，实现对移植小胶质细胞与内源性小胶质细胞的可重复定量分析。
- 支持在生理环境下对靶向人源小胶质细胞功能的化合物进行后续筛选。
转化与临床前研究
- 通过将人源小胶质细胞整合到小鼠大脑中，使临床前模型与人类疾病的关联性更加紧密。
- 可在正常小鼠及疾病模型小鼠中评估人源小胶质细胞的反应。
- 提高转化生物标志物发现和治疗假设验证的预测可信度。
流程与工作流整合
本方案通过实现体内人类小胶质细胞的功能研究，连接了早期发现与临床前研究，支持先导化合物的鉴定及转化连续性。
- Discovery Biology：支持对人源小胶质细胞在脑生理与病理过程中作用的假设验证。
- Screening：提供细胞移植后整合能力与存活率的定量检测结果。
- Analytics：通过标志物实现人源与鼠源小胶质细胞的区分，支持可靠的数据分析。
- Translational Research：通过将iPSMG移植至疾病模型小鼠，促进与疾病相关的建模研究。
- Enterprise Reuse：建立可重复使用的平台，用于在多种疾病背景下评估人源小胶质细胞功能。
运营与企业影响
- 科学价值：提高神经炎症研究的预测可信度，减少物种特异性带来的歧义。
- 操作价值：通过标准化无创性细胞递送与定量工作流程，实现跨研究的可重复性。
- 战略价值：提供与人类相关性更高的数据，助力小胶质细胞靶向治疗药物的决策（推进或终止）。
- 项目组合影响：通过提升模型的保真度，支持对神经退行性疾病项目的基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备iPSC培养、小胶质细胞分化以及体内移植技术方面的专业知识。
- 需要获取用于内源性小胶质细胞清除和细胞因子支持的药理学试剂。
- 要求建立标准化的细胞制备、移植及移植后分析流程。
- 若应用于其他模型系统，可能需要优化递送方式和清除参数。
- 持续给予细胞因子对于移植细胞的存活至关重要，本方案为此提供了支持。
