Name: 从人多能干细胞中产生气道上皮细胞气液界面培养物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学习从人诱导多能干细胞分化功能性气道上皮细胞的完整方案，包括三维基质培养、气液界面分化及纤毛上皮形成技术。该方法为呼吸道疾病研究提供可靠的细胞模型。

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我们感谢Hawkins、Kotton和Davis实验室的成员多年来在本项目及其他项目中提供的有益建议。我们还感谢波士顿大学细胞分选中心主任Brian Tilton的辛勤付出和技术专长。我们感谢波士顿大学再生医学中心（CReM）的Greg Miller和Marianne James在患者特异性诱导多能干细胞的维护与表征方面提供的支持和技术专长，该工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目NO1 75N92020C00005和U01TR001810支持。本研究由NIH资助项目U01HL148692、U01HL134745、U01HL134766和R01HL095993（资助D.N.K.）、R01HL139876（资助B.R.D.）、R01 HL139799（资助F.H.）以及囊性纤维化基金会（CFF）资助项目CFF 00987G220和CFF WANG20GO（资助D.N.K.）、CFF DAVIS15XX1、DAVIS17XX0、DAVIS19XX0（资助B.R.D.）、CFF SUZUKI19XX0（资助S.S.）、CFF BERICA2010（资助A.B.）和CFF HAWKIN20XX2（资助F.H.）提供支持。

以下每个步骤都应在生物安全二级的层流罩中采用无菌技术进行操作。除特别说明外，所有培养基在加入细胞前均应预热至室温（22 °C）。每次离心步骤均应在室温（约 22 °C）下进行。图1 概述了本实验方案的示意图。
1. 所需培养基的制备
注意：详见补充文件1。
<ol>
	<li>基础细胞培养基
	<ol>
		<li>根据制造商说明书配制基础培养基。</li>
		<li>每 50 mL 基础培养基中加入 5 µL A83-01（10 mM）、5 µL DMH1（10 mM）、50 µL Y-27632（10 mM）和 100 µL Primocin（50 mg/mL）。此后，该培养基称为基础细胞培养基。</li>
		<li>4 °C 保存，最长可保存 1 个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>气液界面分化培养基
	<ol>
		<li>根据制造商说明书配制培养基。</li>
		<li>每 50 mL 气液界面分化培养基中加入 100 µL Primocin（50 mg/mL）。</li>
		<li>避光保存于 4 °C，最长可保存 1 个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分选缓冲液
	<ol>
		<li>每 50 mL 分选缓冲液中加入 47.5 mL Hank's 平衡盐溶液、1 mL FBS、200 µL EDTA（500 mM）、1.25 mL HEPES 缓冲液（1 M）、50 µL Y-27632（10 mM）和 100 µL Primocin（50 mg/mL）。</li>
		<li>使用 0.4 µm 孔径滤器过滤除菌。</li>
		<li>4 °C 保存，最长可保存 1 个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冻存培养基
	<ol>
		<li>每 50 mL 冻存培养基中加入 45 mL 基础细胞培养基和 5 mL 二甲基亚砜（DMSO）。</li>
		<li>使用 0.4 µm 孔径滤器过滤除菌。</li>
		<li>4 °C 保存，最长可保存 1 个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 冻存iBCs的解冻
<ol>
	<li>将足量的3-D生长因子减少型细胞外基质（以下简称3-D基质）置于冰上解冻。使用前始终保持在冰上。 
	&#8203;注意：解冻一管（含250,000个细胞）时，需解冻100–200 µL的3-D基质。</li>
	<li>将一管先前冻存的iBC单细胞悬液置于37 °C水浴或金属浴中孵育，直至无可见冰冻培养基（1–2分钟），完成解冻。</li>
	<li>使用5 mL移液管将细胞悬液转移至15 mL锥形离心管中。</li>
	<li>向细胞悬液中逐滴加入6–10 mL DMEM/F12培养基，轻轻混匀，然后以300 × g离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
	<li>吸除上清液，用P1000移液器将细胞沉淀重悬于1 mL基础细胞培养基中。取10 µL样品进行细胞计数。</li>
	<li>以300 × g离心5分钟。吸除上清液，用P1000移液器将细胞重悬于已解冻的3-D基质中，细胞密度为4,000个细胞/µL。 
	注意：必须避免在3-D基质中引入气泡。移液时应缓慢且小心操作。</li>
	<li>使用P200移液器，将一滴（25或50 µL）细胞-基质混合物加至12孔组织培养板每个孔的底部。若起始细胞数量为250,000个冻存细胞，根据细胞活力不同，此步骤预计可获得3–4滴（25 µL/滴）。</li>
	<li>将培养板置于37 °C孵育约15分钟，然后使用5 mL移液管向每孔加入足量的基础细胞培养基，完全浸没液滴（50 µL液滴加1.5 mL；25 µL液滴加1 mL）。将培养板放回湿润化培养箱中。</li>
	<li>每隔2天更换一次培养基，使用新鲜的基础细胞培养基。用5 mL移液管沿孔壁加入新鲜培养基，注意不要扰动细胞液滴。 
	&#8203;注意：此阶段接种的细胞密度比第3节中iBC常规传代时高出10倍。</li>
</ol>
3. 类球体的解离及iBCs在三维培养中的扩增
<ol>
	<li>在冰上解冻足量的3-D基质，使用前保持在冰上。 
	&#8203;注意：所需3-D基质的体积取决于用户所需的细胞数量。</li>
	<li>约5-7天后，吸除每个孔中的培养基，用P1000移液器将1 mL Dispase II（1 U/mL）直接加入类球体上，以使类球体从基质液滴中解离。
	<ol>
		<li>将培养板置于37 °C培养箱中孵育10-15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用P1000移液器将Dispase上下吹打1-2次，以打散较大的3-D基质团块。将培养板再次放回37 °C继续孵育30-40分钟，使基质完全溶解。
	<ol>
		<li>当在光学显微镜下不再可见3-D基质液滴时，用5 mL血清移液管将自由漂浮的类球体转移至15 mL锥形管中。加入DMEM/F12培养基，使每管终体积为10 mL，然后在200 × g 条件下离心3分钟，以沉淀类球体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除上清液，每解离一个初始液滴加入1 mL 0.05%胰蛋白酶（37 °C）（例如，若起始为四个液滴，则向锥形管中加入4 mL胰蛋白酶）。
	<ol>
		<li>在37 °C孵育，频繁吹打（每2-3分钟一次）。</li>
		<li>每隔几分钟在光学显微镜下观察。当大多数（&#62;90%）类球体已解离为单细胞时，按1:1体积比加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基以中和胰蛋白酶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过40 µm细胞滤网过滤细胞，并在300 × g 条件下离心5分钟。</li>
	<li>进行细胞计数，并将细胞均匀重悬于解冻的3-D基质中，密度为400个细胞/µL。避免引入气泡。根据下游应用需要重悬相应数量的液滴。对每个孔重复步骤2.6-2.9。</li>
</ol>
4. NGFR+ iBCs 的鉴定与纯化
<ol>
	<li>在最近一次传代后10-14天，按照步骤3.2-3.5将类球体解离为单细胞悬液，并进行细胞计数。 
	注意：不同iPSC系的行为存在差异，因此不同iBCs所需时间范围可能在10至14天之间有所变化。请参考 图2 在第1、4、8和14天时，3-D iBCs的典型形态已适合进行NGFR+细胞分选。若早于推荐时间进行分选（例如第8天）则 图2C），导致总体细胞数量减少，NGFR 表达频率降低。晚于建议时间进行分选（例如，距离最近一次传代超过 14 天），会导致分选后细胞存活率下降。</li>
	<li>以 1 x 10 的密度重悬细胞6 细胞/100 µL 分选缓冲液（主群体）。取少量等分试样（25–50 µL）转移至另一管中（次要群体）。
	<ol>
		<li>向主要细胞群中加入偶联的抗-NGFR抗体（1:100稀释）。</li>
		<li>向次要细胞群中加入同型对照抗体（1:200 稀释度）。</li>
		<li>避光并置于冰上孵育30分钟，期间每隔5-10分钟轻轻吹打细胞一次，以防止细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>30 分钟后，将分选缓冲液以 1:1 的比例加入每管细胞中。在 300 x g 5 分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，将沉淀的细胞重悬于分选缓冲液中，细胞密度为 10 x 106 细胞/毫升，并加入活细胞或死细胞染料。</li>
	<li>采用适当的NGFR+设门策略（依据同型对照，参见 图3），分选足够数量的活NGFR+细胞用于必要的下游应用。 
	注意：如果使用带有荧光报告基因的iBCs（例如，NKX2-1）GFP TP63tdTomato），建议进行分选以 &#34;三重阳性&#34; 细胞（即 NKX2-1）GFP+TP63tdTomato+，NGFR+），通过适当的门控选择和补偿（图3在此iBCs扩增过程中，部分细胞会分化为分泌细胞，也可检测到极小比例的多纤毛细胞。这两种细胞群体均为NGFR阴性。</li>
</ol>
5. 黏液纤毛气液界面培养物的生成
<ol>
	<li>按照制造商说明，通过向顶端室加入 200 µL 基质（人胚胎干细胞级基质或重组人层粘连蛋白-521）来准备 6.5 mm 多孔膜插入物。
	<ol>
		<li>使用前置于 37 °C 至少 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>吸除插入物顶端室中的包被基质。向基底外侧室加入 500 µL 基础细胞培养基。</li>
	<li>将至少 30,000 个分选得到的 NGFR+ 细胞（来自步骤 4.5）重悬于 100–200 µL 基础细胞培养基中，并使用 P200 微量移液器转移至顶端室。根据所需孔数（及可用细胞数量）重复此操作。将培养板置于 37 °C 恒温湿润培养箱中。</li>
	<li>2–3 天后，吸除顶端室和基底外侧室中的培养基，并更换新鲜的基础细胞培养基（顶端室 500 µL，基底外侧室 100 µL）。</li>
	<li>每日使用光学显微镜观察顶端室。当细胞融合度超过 &#62;80%（通常为 3–7 天）时，将顶端室和基底外侧室中的基础细胞培养基更换为气液界面分化培养基（无需预热）。操作气液界面分化培养基时，应避光处理，将培养基容器用铝箔包裹，并在可能情况下关闭顶灯。</li>
	<li>次日，吸除顶端室中的培养基，从而使顶端表面暴露于空气中。</li>
	<li>每 2–3 天更换一次基底外侧室中的气液界面分化培养基。
	<ol>
		<li>每 1–2 天观察一次培养物形态。小心吸除顶端室中积聚的液体，避免扰动细胞层。</li>
		<li>检测跨上皮电阻（TEER）以评估上皮完整性。 
		注：可在空气暴露后的数天内检测 TEER，以反映上皮层的完整性。目前尚未确定最佳 TEER 检测时间，但通常高质量黏液纤毛分化的 TEER 值高于 &#62;500 x cm2。</li>
		<li>如需清除碎片或黏液，可轻柔地向顶端室加入 100 µL PBS（不含 Ca2+ 或 Mg2+）。在 37 °C 孵育 10 分钟后，小心吸除 PBS。</li>
		<li>空气暴露 7–10 天后，通常可见运动纤毛，并可通过光学显微镜观察。根据实验设计和检测指标的不同，可在空气暴露 14–28 天后对细胞进行分析。 
		&#8203;注：若使用了荧光报告细胞，且具备活细胞荧光显微镜，可同时通过光学显微镜和报告荧光对细胞进行追踪观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. iBCs 的可选（但推荐）冷冻保存
<ol>
	<li>在最近一次三维培养传代后的10-14天，按照步骤3.2-3.5将类球体解离为单细胞悬液。进行细胞计数。</li>
	<li>以每支冻存管250,000个细胞/500 µL的密度，重悬于冻存培养基中。</li>
	<li>将冻存管放入冻存盒中，以确保温度稳定下降（1 °C/min），随后置于-80 °C冰箱中24-48小时，再转移至-150 °C进行长期保存。 
	注意：重复冻存以及对先前分选的NGFR+细胞进行冻存均已被实施，但尚未充分评估其细胞活力及形成功能性气液界面（ALI）培养的能力。尤其在细胞长期传代后，建议检测核型，因为iPSC及其衍生细胞的核型已被发现可能存在变异。</li>
</ol>

<ol><li>GBD Chronic Respiratory Disease Collaborators. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+attributable+health+burden+of+chronic+respiratory+diseases%2C+1990-2017%3A+A+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017.</a> The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).</li>
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<li>Hawkins, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+airway+basal+stem+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+airway+basal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells into functional airway basal stem cells.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100683(2021).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li>
</ol>

作者无披露信息。

人支气管上皮细胞（HBECs）是研究气道上皮疾病的金标准细胞类型。由于其存在诸多局限性（包括获取困难以及遗传操作难度大），我们建立了一种诱导生成iBCs及气液界面（ALI）培养物的实验方案。这些细胞可来源于任意供体，并保留其独特的遗传背景，因而可用于基础发育研究、疾病建模以及新型治疗策略的开发。
尽管所述方案中的每个步骤都是必要的，但有几个步骤需要特别强调。首先，在将类球体解离为单个细胞的每一步中，必须避免过度吹打；酶消化（使用dispase或胰蛋白酶）有助于提高细胞存活率，而过度吹打则会导致明显的细胞死亡。其次，在纯化NGFR+ iBCs时，同型对照的使用至关重要，我们建议通过FACS选择NGFR表达水平最高的细胞（图3）。该策略可获得最佳的气液界面（ALI）培养效果，并实现适当的黏液纤毛分化。最后，多孔膜的制备和接种必须严格按照方案中所述进行，这是ALI培养成功的关键。虽然我们通常每孔接种30,000–60,000个细胞，但在低至20,000个细胞的情况下也已获得成功。尽管使用符合人类胚胎干细胞标准的基质包被可建立成功的培养体系，但我们近期改用重组人源层粘连蛋白-521（laminin-521），其支持的ALI培养体系具有显著更高的稳定性。
极少数情况下，iPSC 分化可能无法上调足够比例的 NGFR+ iBCs。此时，对 iBCs 进行连续传代（在三维培养条件下）可随时间推移提高 NGFR 阳性细胞的比例。本方案的局限性包括生成这些细胞所需的时间、成本以及专业技术。此外，我们认识到许多研究人员对气道上皮中较为罕见的细胞类型（例如离子细胞、神经内分泌细胞）感兴趣。尽管我们已在培养中检测到部分此类稀有细胞类型，但与原代 HBEC 培养类似，这些细胞尚无法被稳定重复鉴定，这可能是因为目前对诱导这些细胞发育所需信号通路的理解尚不充分。
如文中所述，上述方案从已冷冻保存的诱导性乳腺细胞（iBCs）的解冻开始。在此冷冻保存之前的详细步骤已在先前文献中描述，不在本论文的讨论范围之内11,12。
我们的气道上皮细胞气液界面培养方法能够从几乎任何供体生成具有功能的气道上皮细胞。这极大地提高了获取珍贵的遗传背景明确的气道上皮细胞的便利性，这些细胞可用于疾病建模、药物筛选、未来的细胞治疗，以及增进对气道上皮内发育模式的理解。

慢性肺部疾病在全球范围内造成了巨大的发病率和死亡率负担1。影响传导气道的疾病，如哮喘、囊性纤维化（CF）、原发性纤毛运动障碍（PCD）以及病毒感染，既有常见病也有罕见病，既有获得性也有遗传性疾病，均构成了这一全球负担的重要部分。传导气道的主要功能包括：1）作为空气层流通过的通道；2）通过黏液纤毛清除病原体和碎片。分泌细胞、多纤毛细胞和基底细胞是传导气道主要的上皮细胞类型。其他较为罕见的上皮细胞类型包括离子细胞、簇细胞和神经内分泌细胞，这些已在其他文献中进行了综述2。
总体而言，理解疾病机制并推进治疗方法的一大障碍，是临床前模型中持续缺乏可用的人体原代组织。原代人支气管上皮细胞（HBECs）通常被视为金标准 体外 人类气道上皮生物学模型，尤其在囊性纤维化研究中发挥了关键作用3然而，这些细胞通常只能通过支气管镜活检、术后肺组织或因不适合移植而被弃用的肺脏中分离获得。获取来自遗传病患者（包括囊性纤维化（CF）和原发性纤毛运动障碍（PCD）等重点研究疾病）的原代人气道上皮细胞（HBECs）的机会十分有限且不可预测。因此，亟需克服这一源于患者气道上皮细胞获取困难的瓶颈。诱导多能干细胞（iPSCs）可从任何个体便捷地获得，能够保留供体独特的遗传背景，并具有在体外培养条件下长期增殖和存活的显著能力。4,5,6通过重现关键的胚胎发育步骤，iPSCs 经历 &#34;定向分化&#34; 分化为特定器官的细胞类型。我们及其他研究者已开发出诱导多能干细胞来源的肺祖细胞和肺泡Ⅱ型细胞的生成方案7,8 以及传导气道的细胞，包括气道基底细胞9,10,11,12.
气道基底细胞是传导性气道的干细胞13。在先前发表的研究中，我们的研究团队已生成了由诱导多能干细胞（iPSC）分化而来的气道上皮细胞，其中包括表达典型基底细胞标志物TP63、KRT5和NGFR的一个亚群（iBCs）。根据成体基底细胞生物学的提示，抑制双重SMAD通路（TGF-β和BMP）可促进NGFR+ iBCs的上调11,14。NGFR+ iBCs以单细胞形式重悬于细胞外基质液滴中，并在基底细胞培养基中进行培养。这些细胞可自我更新以维持iBC群体，并形成上皮类球体；然而，在该培养体系（称为三维培养，3-D培养）中，部分细胞也会分化为分泌细胞。在以下实验方案中，我们将详细描述在三维培养条件下维持和扩增这些iBCs的步骤，以及构建功能性二维黏液纤毛气液界面（ALI）培养体系所需的操作流程。
该分化方案的初始步骤此前已有发表，此处不再赘述11,12。本文将重点介绍诱导性支气管上皮细胞（iBCs）的扩增与纯化，以及其在气液界面（ALI）培养中进一步分化为功能性分泌细胞和多纤毛细胞的过程。

<table><tbody><tr><td>12孔组织培养处理板</td><td>Corning</td><td>3515</td><td>平底</td></tr><tr><td>3-D生长因子减少型Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>293910</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养小室（Transwell）</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>直径6.5 mm；孔径0.4&amp;mu;m</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II，粉末</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>DMH1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>412610</td><td></td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物（DMEM）:F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）（1×）</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐溶液（EDTA）</td><td>Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Fisher</td><td>SH3007003E</td><td></td></tr><tr><td>汉克平衡盐溶液（HBSS）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>适用于人胚胎干细胞的Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>小鼠IgG1κ同型对照，APC标记</td><td>Biolegend</td><td>400122</td><td></td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗人CD271/NGFR，APC标记</td><td>Biolegend</td><td>345108</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI培养基（ALI分化培养基）</td><td>StemCell Technologies</td><td>05001</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult-Ex Plus培养基（基底细胞基础培养基）</td><td>StemCell Technologies</td><td>05040</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>rhLaminin-521</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A29248</td><td>终浓度：10 µg/mL</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA溶液，0.05%</td><td>Invitrogen</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

由人多能干细胞生成气道上皮细胞气液界面培养模型

Generation of Airway Epithelial Cell Air-Liquid Interface Cultures from Human Pluripotent Stem Cells

气道传导系统疾病，如哮喘、囊性纤维化（CF）、原发性纤毛运动障碍（PCD）以及病毒性呼吸道感染，是全球范围内导致发病和死亡的主要原因。体外培养的人支气管上皮细胞（HBECs）模型系统在理解健康与疾病状态下气道上皮功能方面发挥了关键作用。然而，在肺部研究中，获取患有罕见遗传病或携带罕见突变个体的HBECs仍是一大瓶颈。
诱导性多能干细胞（iPSCs）可通过“重编程”体细胞高效获得，并保留个体供体独特的遗传背景。近年来的技术进展已实现将iPSCs定向分化为肺上皮祖细胞、肺泡Ⅱ型细胞以及传导性气道上皮细胞。 通过 基底细胞，主要的呼吸道干细胞。
本文概述了一种诱导多能干细胞来源的气道基底细胞（以下简称iBCs）的培养与扩增方案，以及其在气液界面（ALI）培养系统中向三谱系分化的实验方法。iBCs在添加了TGF-ß和BMP信号通路抑制剂的基础培养基中，以悬浮于细胞外基质液滴内的上皮球体形式进行维持和扩增。这些上皮球体中的iBCs表达关键的基底细胞标志物TP63和NGFR，可通过荧光激活细胞分选（FACS）进行纯化；当接种于多孔膜上并在标准ALI培养条件下培养时，可分化为具有功能性的气道上皮。来自健康供体的ALI培养物包含基底细胞、分泌细胞和多纤毛细胞，具备完整的上皮屏障功能、可运动的纤毛以及黏液分泌能力。而来自囊性纤维化（CF）或原发性纤毛运动障碍（PCD）患者的培养物则可重现由疾病导致的上皮缺陷，即CFTR介导的氯离子转运功能障碍或纤毛运动能力丧失。
本文介绍了一种人类细胞的制备方案，可用于气道疾病的研究与机制解析。

按照本方案，将200,000个冷冻保存的iBCs（此前已确认具有正常的46XY核型）11解冻并在三维培养体系中进行扩增。5天后，将形成的球状体解离、计数，并再次传代以进一步扩增。最终获得约480,000个细胞，重悬于三维基质中（12个50 µL液滴，密度为400个细胞/µL）。每2-3天更换新鲜的基础细胞培养基。10天后，再次将细胞解离并计数。共收获19.7 × 106个细胞，并准备进行流式细胞分选（FACS）。其中106个细胞用APC标记的IgG1κ同型对照染色，其余18.7 × 106个细胞则在避光条件下用APC标记的抗NGFR抗体染色30分钟（图3）。
在与同型对照细胞比较后进行 NGFR+ 门控，并有意设置门控以收集表达水平最高的 NGFR+ 细胞（图 3）。采用此门控技术，活单细胞中 28% 为 NGFR+。尽管可获得的细胞数量更多，但仍收集 750,000 个细胞用于后续培养。分选后的细胞重悬于基础细胞培养基中，浓度为 50,000 个细胞/100 µL。将 50,000 个细胞接种至每个已包被人重组层粘连蛋白-521（2 µg/200 µL）的 6.5 mm 多孔膜插入式培养小室中，包被操作按制造商说明进行。向每个小室的基底外侧腔室中加入 500 µL 基础细胞培养基，并将培养板置于 37 °C 恒湿培养箱中。三天后，吸除顶腔室中的培养基，光学显微镜下观察细胞融合度约为 90%（图 4B）。随后吸除基底外侧腔室中的培养基，向顶腔室（100 µL）和基底外侧腔室（500 µL）中加入气液界面分化培养基。次日，吸除顶腔室中的培养基。
在接下来的21天内，定期通过光学显微镜观察细胞，并每隔2-3天向基底外侧腔室更换新鲜的ALI分化培养基。最初，单个细胞易于识别（图4A），呈细长的纺锤形，形成疏松排列的单层细胞（图4B）。在随后数天至数周内，细胞逐渐形成致密排列、细胞密度高的上皮层；在7-10天后，可明显观察到纤毛摆动和黏液分泌。样品的经上皮电阻（TEER）测定结果与原代细胞对照组相似（范围为700-1600 Ω × cm2）11。随后在第21-28天使用多聚甲醛固定，并对MUC5AC和乙酰化-α-微管蛋白等多种经典的气道上皮细胞标志物进行免疫标记（图4C）。总体而言，我们观察到细胞具有运动性纤毛、可分泌黏液，并通过免疫染色确认了多纤毛细胞和分泌细胞的存在，其特征与原代人支气管上皮细胞（HBECs）相似，因此我们认为已成功从诱导性多能干细胞分化获得了气道上皮细胞。
<img alt="细胞分化过程示意图；单细胞传代、细胞分选、黏液纤毛分化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63882/63882fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：实验方案总体示意图。 冷冻保存的诱导性支气管上皮细胞（iBCs）经复苏、扩增和荧光激活细胞分选（FACS）纯化后，接种于多孔膜插入式培养板上，进而分化为具有功能性的黏液纤毛上皮。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63882/63882fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示纳米颗粒尺寸分布和形貌的透射电镜图像，可用于材料分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63882/63882fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：代表性相差显微图像。 代表性相差显微图像，显示iBCs在三维培养中培养后（A）1天、（B）4天、（C）8天以及（D）14天（NGFR分选前）的典型形态。比例尺为500 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63882/63882fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术散点图显示NGFR抗体在非报告基因和报告基因细胞系中的结合情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63882/63882fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：代表性FACS图谱。 非报告基因和荧光报告基因诱导性前体细胞（iBCs）的代表性FACS图谱。图中展示了同型对照示例，并用于筛选表达水平最高的NGFR+细胞。含有荧光报告基因的iPSC细胞系经过“三次分选”，以获得NKX2-1GFP+ TP63tdTomato+ NGFR+细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63882/63882fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="扫描电镜与荧光显微镜图像；细胞结构、微管蛋白分析、微管观察。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63882/63882fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：多孔膜上诱导性支气管上皮细胞（iBC）培养的代表性图像。相位对比图像显示为接种后（A）1 天和（B）3 天的结果。代表性黏液纤毛培养物的免疫荧光染色如图（C）所示；乙酰化-α-微管蛋白（绿色）和 MUC5AC（红色）。比例尺表示 25 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63882/63882fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
补充文件1：培养基成分表。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63882/Media%20components.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

近年来，人类诱导性多能干细胞分化技术的进步使得能够逐步获得特定器官的细胞类型。本文详细介绍了由诱导性多能干细胞衍生的气道基底细胞的维持与扩增步骤，以及在气液界面培养条件下将其分化为黏液纤毛上皮细胞的具体方法。

气道疾病，如哮喘、囊性纤维化（CF）、原发性纤毛运动障碍（PCD）和病毒性呼吸道感染，是导致……的主要原因。

本方案具有实用价值，因其提供了易于遵循的操作步骤，可用于生成功能性气道上皮细胞，进而研究气道生物学的各个方面。该方案的主要优势在于能够同时建立大量功能性气道上皮细胞培养体系，同时避免获取和培养原代气道细胞所面临的困难。本实验操作将由本实验室的研究生 Taylor Matte 进行示范。首先将足量的3D基质在冰上解冻，解冻后保持在冰上直至使用。将一管先前冷冻保存的iBC单细胞悬液置于37摄氏度的水浴或珠浴中孵育，直至无可见的冷冻培养基为止。使用5毫升血清移液管，将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。向细胞悬液中逐滴加入6至10毫升DMEM/F12培养基。轻轻混匀后，在300 ×g条件下离心5分钟，使细胞沉淀。用 P1000 移液器吸弃上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 毫升基础细胞培养基中。取 10 微升 aliquot 进行细胞计数。以 300 ×g 离心 5 分钟。用 P1000 移液器吸除上清液，并将细胞重悬于预先解冻的 3D 基质中，细胞密度为每微升 4,000 个细胞。使用 P200 移液器，将约 25 至 50 微升的基质溶液滴加至 12 孔组织培养处理板每个孔的底部。将培养板在 37 摄氏度下孵育约 15 分钟。然后使用5 mL血清移液管向每个孔中加入足够的基础细胞培养基，以完全浸没液滴。将培养板放回湿润的培养箱中。每隔两天使用新鲜的基础细胞培养基更换培养液。使用5毫升血清移液管向孔板的一侧加入新鲜培养基，注意不要扰动细胞液滴。在冰上解冻足量的3D基质，解冻后置于冰上，待用时取出。在培养板中孵育大约 5 到 7 天后，吸出每孔中的培养基，然后使用 P1000 移液器将 1 毫升 dispase II 直接加入至类球体上，以使类球体从基质液滴中解离。将培养板置于 37°C 培养箱中孵育 10 到 15 分钟。使用 P1000 移液器上下吹打两次，混匀 dispase 溶液，以打散较大的 3D 基质团块。将培养板放回 37 摄氏度环境中继续孵育 30 至 40 分钟，使基质完全溶解。当在光学显微镜下无法观察到 3D 基质液滴时，使用 5 毫升移液器吸头将自由漂浮的类球体转移至 15 毫升锥形管中。每管加入 DMEM/F12 培养基至终体积为 10 毫升，并在 200 ×g 条件下离心 3 分钟，使类球体沉淀。吸去上清液，为每个初始解离的液滴加入一毫升 0.05% 胰蛋白酶。在 37°C 下孵育，每两到三分钟吹打一次。每隔几分钟用光学显微镜评估溶液状态。当超过90%的类球体已解离为单细胞时，向胰蛋白酶中加入10%胎牛血清。使用40微米细胞滤网过滤细胞，并在300 RCF下离心5分钟。进行细胞计数，并将细胞均匀重悬于解冻的3D基质中，密度为每微升400个细胞。避免引入气泡。根据后续应用需要，重悬足够数量的液滴。对每个孔重复此过程。在最近一次传代后的10至14天，将类球体解离为单细胞悬液（方法如前所述），并进行细胞计数。用分选缓冲液重悬细胞。此为待分选的主要细胞群体。取25至50微升小份样品转移至另一离心管中，此为次要细胞群体。向主要细胞群体中加入偶联的抗NGFR抗体。向次要细胞群中加入同型对照抗体。避光并冰浴孵育30分钟，期间间歇性吹打细胞以防止细胞沉淀。30分钟后，向每管细胞中加入分选缓冲液。将细胞在300 RCF下离心5分钟。吸除上清液，用分选缓冲液重悬沉淀的细胞，并加入活细胞或死细胞染料。采用适当的NGFR阳性门控策略，分选出足够数量的NGFR阳性细胞用于后续必要的实验应用。按照制造商的说明，通过向顶端室加入200微升基质来制备6.5毫米多孔膜插入物。在使用前将其置于37摄氏度环境中至少两小时。从插入物的顶端室中吸除包被基质。向基底外侧室中加入 500 微升基础细胞培养基。将至少 30,000 个分选得到的 NGFR 阳性细胞重悬于 100 至 200 微升基础细胞培养基中，使用 P200 微量移液器转移至顶侧室。对剩余的孔重复此操作。将培养板置于37摄氏度、加湿的培养箱中。两到三天后，吸去顶端和基底外侧腔室中的培养基，并加入新鲜的基础细胞培养基。每天使用光学显微镜监测顶端腔室。当细胞融合度超过80%时，在顶端和基底外侧腔室中均用气液界面（ALI）分化培养基替换基础细胞培养基。通过用铝箔包裹培养基容器并在可能的情况下关闭顶灯，避免ALI分化培养基暴露于光照。次日，吸除顶端腔室中的培养基，从而使顶端表面暴露于空气中。每隔两到三天更换一次基底外侧腔中的气液界面分化培养基。每隔一到两天观察一次培养物的形态。小心吸除顶腔中积聚的液体，避免扰动细胞层。向顶端腔室中轻柔加入 100 微升不含钙和镁的 PBS，以去除碎片或黏液。在 37 摄氏度孵育 10 分钟，然后小心吸除 PBS。检测 TEER 以评估上皮完整性。空气暴露7至10天后，使用光学显微镜观察多纤毛的出现情况。根据计划进行的实验和检测指标，可在空气暴露14至28天后对细胞进行分析。在最近一次三维培养传代后的10至14天，将类球体解离为单细胞悬液，操作方法如前所述。进行细胞计数，将细胞悬液重悬于冻存管中的冻存液中。将冻存管放入容器中，以确保温度稳定下降。随后转移至-80摄氏度保存24至48小时，再转移至-150摄氏度进行长期保存。通过这种门控技术，28%的活单细胞为NGFR阳性。两天后，单个细胞最初易于识别，呈细长的纺锤形。再经过两天，细胞形成融合且疏松排列的单层。在随后的数天至数周内，细胞形成了紧密排列、细胞密度高的上皮层。在7到10天后，明显出现了纤毛摆动和黏液分泌。检测了样本的跨上皮电阻（TEER），结果与原代气道上皮细胞对照样本的测量值相似。随后使用多聚甲醛固定，并对MUC5AC和乙酰化α-微管蛋白等经典的气道上皮细胞标志物进行免疫标记。通过该方案，研究人员可建立大量来源于患者的气道上皮细胞培养模型，用于评估多种检测指标，包括在疾病和健康状态下基底细胞、分泌细胞及多纤毛细胞功能的相关检测。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从人多能干细胞中产生气道上皮细胞气液界面培养物

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人鼻上皮细胞在气液界面的培养

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