由人多能干细胞生成气道上皮细胞气液界面培养模型

本方案具有实用价值，因其提供了易于遵循的操作步骤，可用于生成功能性气道上皮细胞，进而研究气道生物学的各个方面。该方案的主要优势在于能够同时建立大量功能性气道上皮细胞培养体系，同时避免获取和培养原代气道细胞所面临的困难。本实验操作将由本实验室的研究生 Taylor Matte 进行示范。

首先将足量的3D基质在冰上解冻，解冻后保持在冰上直至使用。将一管先前冷冻保存的iBC单细胞悬液置于37摄氏度的水浴或珠浴中孵育，直至无可见的冷冻培养基为止。

使用5毫升血清移液管，将细胞悬液转移至15毫升锥形管中。向细胞悬液中逐滴加入6至10毫升DMEM/F12培养基。轻轻混匀后，在300 ×g条件下离心5分钟，使细胞沉淀。

用 P1000 移液器吸弃上清液，并将细胞沉淀重悬于 1 毫升基础细胞培养基中。取 10 微升 aliquot 进行细胞计数。以 300 ×g 离心 5 分钟。

用 P1000 移液器吸除上清液，并将细胞重悬于预先解冻的 3D 基质中，细胞密度为每微升 4,000 个细胞。使用 P200 移液器，将约 25 至 50 微升的基质溶液滴加至 12 孔组织培养处理板每个孔的底部。将培养板在 37 摄氏度下孵育约 15 分钟。

然后使用5 mL血清移液管向每个孔中加入足够的基础细胞培养基，以完全浸没液滴。将培养板放回湿润的培养箱中。每隔两天使用新鲜的基础细胞培养基更换培养液。

使用5毫升血清移液管向孔板的一侧加入新鲜培养基，注意不要扰动细胞液滴。在冰上解冻足量的3D基质，解冻后置于冰上，待用时取出。

在培养板中孵育大约 5 到 7 天后，吸出每孔中的培养基，然后使用 P1000 移液器将 1 毫升 dispase II 直接加入至类球体上，以使类球体从基质液滴中解离。将培养板置于 37°C 培养箱中孵育 10 到 15 分钟。使用 P1000 移液器上下吹打两次，混匀 dispase 溶液，以打散较大的 3D 基质团块。

将培养板放回 37 摄氏度环境中继续孵育 30 至 40 分钟，使基质完全溶解。当在光学显微镜下无法观察到 3D 基质液滴时，使用 5 毫升移液器吸头将自由漂浮的类球体转移至 15 毫升锥形管中。每管加入 DMEM/F12 培养基至终体积为 10 毫升，并在 200 ×g 条件下离心 3 分钟，使类球体沉淀。

吸去上清液，为每个初始解离的液滴加入一毫升 0.05% 胰蛋白酶。在 37°C 下孵育，每两到三分钟吹打一次。每隔几分钟用光学显微镜评估溶液状态。

当超过90%的类球体已解离为单细胞时，向胰蛋白酶中加入10%胎牛血清。使用40微米细胞滤网过滤细胞，并在300 RCF下离心5分钟。进行细胞计数，并将细胞均匀重悬于解冻的3D基质中，密度为每微升400个细胞。

避免引入气泡。根据后续应用需要，重悬足够数量的液滴。对每个孔重复此过程。

在最近一次传代后的10至14天，将类球体解离为单细胞悬液（方法如前所述），并进行细胞计数。用分选缓冲液重悬细胞。此为待分选的主要细胞群体。

取25至50微升小份样品转移至另一离心管中，此为次要细胞群体。向主要细胞群体中加入偶联的抗NGFR抗体。

向次要细胞群中加入同型对照抗体。避光并冰浴孵育30分钟，期间间歇性吹打细胞以防止细胞沉淀。30分钟后，向每管细胞中加入分选缓冲液。

将细胞在300 RCF下离心5分钟。吸除上清液，用分选缓冲液重悬沉淀的细胞，并加入活细胞或死细胞染料。采用适当的NGFR阳性门控策略，分选出足够数量的NGFR阳性细胞用于后续必要的实验应用。

按照制造商的说明，通过向顶端室加入200微升基质来制备6.5毫米多孔膜插入物。在使用前将其置于37摄氏度环境中至少两小时。从插入物的顶端室中吸除包被基质。

向基底外侧室中加入 500 微升基础细胞培养基。将至少 30,000 个分选得到的 NGFR 阳性细胞重悬于 100 至 200 微升基础细胞培养基中，使用 P200 微量移液器转移至顶侧室。对剩余的孔重复此操作。

将培养板置于37摄氏度、加湿的培养箱中。两到三天后，吸去顶端和基底外侧腔室中的培养基，并加入新鲜的基础细胞培养基。每天使用光学显微镜监测顶端腔室。

当细胞融合度超过80%时，在顶端和基底外侧腔室中均用气液界面（ALI）分化培养基替换基础细胞培养基。通过用铝箔包裹培养基容器并在可能的情况下关闭顶灯，避免ALI分化培养基暴露于光照。次日，吸除顶端腔室中的培养基，从而使顶端表面暴露于空气中。

每隔两到三天更换一次基底外侧腔中的气液界面分化培养基。每隔一到两天观察一次培养物的形态。小心吸除顶腔中积聚的液体，避免扰动细胞层。

向顶端腔室中轻柔加入 100 微升不含钙和镁的 PBS，以去除碎片或黏液。在 37 摄氏度孵育 10 分钟，然后小心吸除 PBS。检测 TEER 以评估上皮完整性。

空气暴露7至10天后，使用光学显微镜观察多纤毛的出现情况。根据计划进行的实验和检测指标，可在空气暴露14至28天后对细胞进行分析。在最近一次三维培养传代后的10至14天，将类球体解离为单细胞悬液，操作方法如前所述。

进行细胞计数，将细胞悬液重悬于冻存管中的冻存液中。将冻存管放入容器中，以确保温度稳定下降。随后转移至-80摄氏度保存24至48小时，再转移至-150摄氏度进行长期保存。

通过这种门控技术，28%的活单细胞为NGFR阳性。两天后，单个细胞最初易于识别，呈细长的纺锤形。再经过两天，细胞形成融合且疏松排列的单层。

在随后的数天至数周内，细胞形成了紧密排列、细胞密度高的上皮层。在7到10天后，明显出现了纤毛摆动和黏液分泌。检测了样本的跨上皮电阻（TEER），结果与原代气道上皮细胞对照样本的测量值相似。

随后使用多聚甲醛固定，并对MUC5AC和乙酰化α-微管蛋白等经典的气道上皮细胞标志物进行免疫标记。通过该方案，研究人员可建立大量来源于患者的气道上皮细胞培养模型，用于评估多种检测指标，包括在疾病和健康状态下基底细胞、分泌细胞及多纤毛细胞功能的相关检测。