麻醉与插管未成年幼鼠以进行心胸外科手术

本方案是首个有文献记载的针对未成年小鼠幼崽进行心血管外科手术时实施麻醉和气管插管的方法。我们开发了麻醉方案、专用设备以及特定的操作技术，可在最大限度降低动物死亡率的前提下，实现对出生10天的C57 Black Six J小鼠幼崽进行气管插管以开展心血管外科手术。我们预计，具备成年小鼠插管经验的操作人员，在对7至8只一窝的10窝幼崽进行练习后，即可掌握未成年小鼠的插管技术。本操作将由本实验室高级职员科学家Dr. Jianxin Wu进行示范。

实验当天，按照论文所述设置针对10日龄幼鼠插管的专用设备。手术时使用由一段19毫米长的塑料管连接一个21毫米塑料雌性接头锁紧适配器构成的导管。通过接头锁紧适配器插入一段铜丝，以增加导管塑料管的硬度。

将麻醉后的小鼠仰卧位固定在插管平台上。在对麻醉后的小鼠进行插管前，需通过足垫夹捏反射检查麻醉深度。足垫夹捏反射必须存在，但应明显弱于清醒动物的反应。

用小镊子夹住幼鼠的舌头，使用由一段铜丝和柔性光纤光源制成的喉镜暴露声门和声带。倾斜硬化的导管，使套管锁端略低于尖端，一旦声带分开，立即插入导管并推进，直到套管锁接头刚好位于口腔外。随后立即取出铜丝。

插管后通过动物自主呼吸的能力来评估麻醉深度。将已插管的幼崽转移至设定为37摄氏度的保温垫上。通过短暂阻塞插管导管以确认自主呼吸幼崽的气管插管成功，观察是否因此阻止胸廓运动。

将气管插管连接至呼吸机，以每分钟1升的流速输送100%氧气。操作应少于15秒，以尽量减少重复呼吸。手术麻醉深度达到外科手术平面后，通过检查胸壁运动频率是否与呼吸机频率一致，确认气管插管位置正确。

将幼鼠置于配备10倍和16倍物镜的手术显微镜下进行心肌梗死手术。用手术刀在左侧胸壁第三与第四肋骨之间的水平位置切开皮肤并消毒。借助精细镊子，钝性分离肋间组织以打开胸腔，并使用牵开器保持术野开放。

通过使用9-0聚丙烯单丝缝线结扎左心耳远端的左冠状动脉，诱导心肌梗死。心肌梗死手术持续10分钟后，用7-0缝线缝合皮肤。用70%乙醇或生理盐水清除血液，并用碘伏消毒切口。

让动物恢复，并确保在几分钟内自主呼吸恢复。然后将幼崽放回预充氧的保温箱中，并在恢复期间持续监测。当翻正反射恢复后，拔除幼崽的气管插管。

用母鼠笼内的垫料轻轻擦拭幼鼠。保持幼鼠温暖，并检查其呼吸是否规律，以及是否能够自主活动。将母鼠放回笼中。

然后在幼崽完全从麻醉中恢复后将其全部放回。将母鼠和幼崽一起在笼中饲养过夜，笼子一半置于设定为37摄氏度的加热垫上。术后第三天，用胶带固定麻醉后的幼崽尾巴，使其仰卧于加热垫上。

将一根线置于门齿上方，用胶带将幼鼠固定在适当位置，并使其头部伸展进入鼻罩。用70%乙醇消毒皮肤。使用精细剪刀沿气管方向，在右侧颈总动脉上方的皮肤做一厘米长的切口，暴露血管后，使用连接26号针头的单腔聚乙烯管进行插管，按照文中所述诱发心脏停搏后，注入0.2毫升肝素化生理盐水，持续一分钟。通过同一切口分离右侧颈静脉，并将其横断。

用 0.2 毫升 PBS 灌注心脏，随后用 0.1 毫升 0.2% 阿利新蓝灌注，以染色非梗死的远端心肌。通过观察颈静脉是否将血液、PBS 及阿利新蓝完全冲洗出来，判断灌注是否成功。操作完成后，打开胸腔，通过解剖周围结缔组织和血管，游离并切除心脏。

用 PBS 冲洗心脏，然后去除心房，并使用安装在手术显微镜上的相机以 10 倍物镜拍摄心脏照片。在初步实验中，针对出生 10 天的幼鼠优化了麻醉方案。每千克体重给予 50 毫克氯胺酮、6 毫克甲苯噻嗪和 0.18 毫克阿托品的剂量，可达到足够的麻醉深度，使体重为 5.5 至 7.30 克、自主呼吸的幼鼠顺利完成气管插管。

由于较轻的幼鼠无法耐受较高剂量的麻醉，将麻醉剂剂量减少至每千克30毫克氯胺酮、每千克4毫克赛拉嗪和每千克0.12毫克阿托品后，可对体重为4.50至5.49克的幼鼠进行插管。相比之下，进一步将氯胺酮剂量降低至每千克20毫克后，可对体重为3.15至4.49克的幼鼠进行插管。该表格还显示了继续接受手术的已插管幼鼠的数量及其所占百分比。

体重较低的幼崽比体重较重的幼崽更难进行插管，需要更多次尝试，导致其存活率低于体重最高的组别。此外，体重最高组别中接受插管的幼崽数量更多地进入了心肌梗死手术阶段，而低体重和中等体重组别则较少。心肌梗死手术后两天的存活率在不同体重组之间保持一致，为86%至92%。麻醉深度对于插管和存活至关重要。

如果麻醉过浅，插管将变得困难；如果过深，幼鼠在插管期间或之后会停止自主呼吸。我们的麻醉插管方案可实现对未成年小鼠进行心脏胸外科手术模型的建立，从而允许在此阶段开展例如肺、食管和心脏的相关研究。