由微凝胶棒制备的互连大孔三维支架

本方案描述了可相互连接形成微孔支架的微凝胶棒的制备方法。这些支架可与细胞联合使用，为细胞间的高效相互作用提供所需空间。两种不同类型的微凝胶棒在接触时会相互连接。

高长径比可形成更大的孔隙，同时使用比球形微凝胶更少的合成材料即可维持支架的稳定性。微孔支架将显著促进内源性细胞的浸润与相互作用，从而修复受损组织。大孔隙将促进血管形成，以实现对新生组织的营养交换。

支架材料的减少有利于为组织形成提供更多开放空间，这对于体外和体内应用都具有重要意义。一个关键方面是芯片上的微结构化技术。为了确保微凝胶棒的连续生产，必须将产物有效地从管中输送出来，同时避免堵塞。

首先，将针头插入聚乙烯管中，并排出注射器和管路中的气体。然后，将另一段聚乙烯管插入产物收集出口。接着，将所有玻璃注射器和注射泵放置到位，并将每根管路的末端插入相应的入口。

然后，将显微镜聚焦于油水相交界面。启动第一个油相注射泵，首先用油填充通道，以防止分散相润湿通道。随后，将第一个油相的流速降低至30微升/小时，并启动预聚物注射泵，直至在横截面处可观察到分散的水相。

接下来，将预聚物流速设置为30微升每小时，并将显微镜对准出口。然后启动第二个油相注射泵，等待流动状态稳定。将出口管置于收集容器中，并设置紫外照射系统，使辐照强度在900至1000毫瓦每平方厘米范围内。

照射位置为出口前的直通道部分。在紫外光照射前，调节预聚物和第一种油相的流速，以获得3.0至4.5范围内的目标长宽比，并根据照射区域的大小将分散相的照射时间设定为约2.3秒。随后开始紫外光照射，如有必要，可根据前一小节所述再次调节流速。

接下来，更换收集容器，并记录产物收集的开始时间和流速。结束收集时，取下收集容器并记录时间。随后，停止照射以及所有注射泵的运行。

随后分别用正己烷、异丙醇和去离子水各洗涤产物五次。杆状物沉淀后，去除上清液。将第一组分分散液转移至一个锥形的1.5或2毫升透明小瓶中。

然后使用100微升移液器以受控方式连续加入第二组分，并直接用移液器吸取液体并重新加入，以混合内容物。接着将GRGDS-PC溶液加入交联结构中，使所有剩余的环氧基团与带有游离胺和硫醇的细胞黏附肽发生修饰反应，并在室温下放置过夜。随后用去离子水洗涤以去除未反应的分子，并移除上清液。

降低水位后，打开小瓶，用波长为250至300纳米的紫外光进行脱照射。然后关闭小瓶，并将小瓶转移至洁净台。随后，用无菌水清洗。

将小瓶中的水更换为细胞培养基，并静置平衡五分钟。接着，通过倾倒或使用刮铲将大孔支架转移至细胞培养板的孔中以进行实验。共聚焦显微镜结果显示，该三维大孔结构由相互连接的胺基和环氧功能化微凝胶棒组成。

该结构在两到三秒内形成约10,000根微凝胶棒，呈现出紧凑的几何形态。通过纳米压痕法测定胺基和环氧基微凝胶棒以及胺基和环氧基微凝胶球的有效杨氏模量。为了检测活性官能团，可使用异硫氰酸荧光素标记伯氨基团，而荧光素胺异构体1可用于标记环氧基团。

胺基微凝胶棒在去离子水中的尺寸平均长度为553微米，平均宽度为193微米，长径比约为3.0。由微凝胶棒构成的宏观孔隙及支架结构的平均孔径为100微米，其中90%的孔径范围从30微米至150微米以上。球形微凝胶形成的聚集体孔径约为10至55微米，平均孔径约为22微米。

所述的微凝胶棒可通过随机混合形成相互连接的微孔支架。未来，通过控制混合工艺可实现更定制化的支架结构的制备。微凝胶的刚度和生化信号可根据实际应用需求进行调节。

通过组合不同的结构单元，可以在一个支架内实现多种多样的几何结构和性能。这样我们就能高效地靶向特定细胞，形成多细胞组织。