使用 Leginon 进行样品台倾斜的单颗粒冷冻电镜数据采集

倾斜样品台为在单颗粒冷冻电镜数据收集中增加颗粒取向分布提供了一种简单且可推广的方法。由于样品台倾斜而获得的颗粒均匀分布有助于提高整体三维重构图的质量和可解释性。首先对显微镜进行校准，以确保对样品的平行照明，并尽量减少彗差像差。

为了确定适合数据采集的方格，需记录一张网格图谱，可不使用载物台倾斜或使用载物台倾斜拍摄，以获得整体网格质量的概览，并初步判断适合数据采集的区域。在方格采集节点所用的放大倍数下手动检查各个方格，寻找其中支撑膜完整、无脱水迹象且冰层厚度理想的方格，并将样品台移动至感兴趣的方格位置。

使用 alpha 摇摆功能，在约 15 度的样品台倾斜角度下确定样品台位置的等心高度，并通过显微镜的键盘面板调节 Z 轴高度，使样品台达到等心高度。确保在执行 alpha 摇摆程序期间图像漂移最小。为了获得更精确的 Z 轴高度，可在方格采集节点所用放大倍数下的调焦节点中估算该高度。

调整调焦节点的设置，并在初始方格排队期间启用或禁用精细Z轴调焦选项。然后按“模拟”。将样品台倾斜至所需倾转角度，以在真实的等中心高度进行数据采集，并在必要时重新居中样品台。

按下方形采集节点中的“模拟”按钮，开始为整个采集节点的曝光排队目标。接下来，选择一个Z轴对焦目标以及具有适合高倍曝光孔洞的区域，并将这些目标提交至成像队列。将样品台恢复至无倾转状态，然后移至下一个方格。

重复这些步骤，直至已排队足够数量的完整曝光。当所有方格均已排队后，转至整体定位节点并点击“提交已排队目标”。在节点设置中选择“允许”以进行用户对选定目标的验证，并手动检查高倍曝光采集节点所选定的目标，以测试在样品台倾斜时，自动电子显微镜孔定位程序是否能准确识别出适合图像采集的区域。

当用户对靶向准确性满意后，取消选中“允许用户验证所选目标”选项，以进行自动数据采集。此处展示了在接近和远离正焦面 Z 高度位置、以不同倾斜角度采集的网格代表性图像，图像为方形放大倍率。红色同心圆环的中心指示电子束的中心，绿色箭头指示感兴趣的方形区域。

在目标方格附近有一个用于参考的破损网格特征。图中显示了在 0 度、30 度和 60 度倾转角度下采集的代表性孔洞曝光图像及二维分类平均图。尽管不同倾转角度下的蛋白质浓度保持不变，但较高的倾转角度会使成像区域在颗粒浓度上显得更加密集。

受过度拥挤影响的2D分类平均图像显示在该红色框内。该方案的简便性使得显微镜的普通用户能够轻松采用倾斜数据采集策略。