Name: 通过捕获Hi-C 破 译高分辨率3D染色质组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 了解Capture Hi-C技术如何以高分辨率解析三维染色质组织结构，识别拓扑关联结构域和远程相互作用。该方法提高了分辨率与等位基因特异性，为研究基因调控机制提供了高效且经济的工具。

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Heard 实验室的工作得到了欧洲研究理事会高级研究员奖（XPRESS - AdG671027）的支持。A.L. 受欧盟玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动计划个体奖学金（IF-838408）资助。A.H. 受玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里资助协议 813327 项下的创新与跨学科网络 ChromDesign（ITN）支持。作者感谢 Daniel Ibrahim（柏林马克斯·普朗克分子遗传学研究所）提供的有益技术建议，感谢巴黎居里研究所 NGS 平台，以及感谢 Vladimir Benes 和欧洲分子生物学实验室（海德堡）基因组核心设施提供的支持与协助。

本研究中使用的小鼠胚胎干细胞（mESCs）是根据法国居里研究所（巴黎）的动物护理指南51，通过将一只 TX/TX R26rtTA/rtTA 雌鼠50 与一只 Mus musculus castaneus 雄鼠杂交获得的。
1. 探针设计
<ol>
	<li>设计一组覆盖目标区域的生物素标记探针（120个核苷酸长度的RNA寡核苷酸）。
	<ol>
		<li>以重叠的寡核苷酸对目标区域进行铺排，使目标区域内每个序列平均被两个独特的探针覆盖（2倍覆盖）（图1).</li>
		<li>排除探针覆盖范围中的重复序列，以避免非特异性相互作用的富集。 
		&#8203;注意：为了最大程度富集具有信息量的连接片段，针对目标区域（ChrX: 102,475,000-105,475,000）内每个 DpnII 限制性位点上下游各 300 bp 的范围进行了界定，并基于 SureDesign 平台的 SureSelect DNA 目标富集技术，设计了 28,913 个生物素标记的探针。52根据该策略，每条寡核苷酸中最多允许含有40个碱基的重复序列，以最大限度减少非特异性相互作用的富集。探针阵列由Agilent公司合成。此处使用DpnII作为限制性内切酶基于两个原因：（1）它是一种四碱基切割酶， routinely用于多种基于3C的方法53；（2）与其他测试过的限制性内切酶相比，它能够最大限度地提高在切割位点附近捕获具有信息量的单核苷酸多态性（SNPs）的几率 计算机模拟 本研究中使用的F1杂交系（C57BL/6J × CAST/EiJ）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验步骤
<ol>
	<li>细胞制备
	<ol>
		<li>将适量的细胞接种至一个或多个细胞培养板中，以获得总数≥5 x 10⁶的细胞7 固定当天的细胞 
		注意：本研究使用了小鼠胚胎干细胞（mESCs）。mESCs 接种于经明胶包被（0.1% 明胶溶于 1× PBS，37 °C、5% CO2 培养箱中过夜）的细胞培养板中，培养基为含 2i + LIF 及批次验证的胎牛血清的 mESCs 培养基（DMEM，15% FBS，0.1 mM β-巯基乙醇，1,000 U/mL−1 白血病抑制因子（LIF），CHIR99021（3 µM）和 PD0325901（1 µM））。对于该细胞类型，一个 80% 汇合度的 10 cm 培养皿约含有 2 × 107 细胞</li>
		<li>额外准备一个细胞培养板用于细胞计数。 
		注意：可使用较小的细胞培养板以减少培养基用量。在此情况下，需相应调整接种到较小培养板中的细胞数量（例如，10 cm 培养板的接种细胞数应为 15 cm 培养板的三分之一）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>甲醛固定
	<ol>
		<li>估算需要交联的细胞总数。
		<ol>
			<li>在开始交联反应之前，使用胰蛋白酶消化专用于细胞计数的对照培养板中的细胞，并根据自动细胞计数仪的制造商说明，通过该仪器对细胞进行计数。</li>
			<li>加入活力染色（例如台盼蓝）以确定活细胞的百分比54根据此细胞计数，估算用于交联处理的培养皿（板）中细胞的总数。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>从用于交联的培养板中移除培养基，替换为适量的固定液（含2%甲醛的细胞培养基）。10 cm培养板使用10 mL固定液（例如，15 cm培养板使用约20 mL）。 
		注意：加入固定液的精确体积。若无法对贴壁细胞进行固定，可将此步骤调整用于经胰蛋白酶消化的细胞，并在50 mL锥形离心管中加入30 mL固定液进行操作。甲醛使用期限不得超过1年，建议使用一次性小瓶装试剂。固定液使用前须恢复至室温（RT）。 
		警告：甲醛具有危害性，须根据相应的健康与安全法规进行操作。</li>
		<li>在摇床中于室温下轻柔混匀固定10分钟。</li>
		<li>通过加入2.5 M甘氨酸-1x PBS将固定反应淬灭至终浓度0.125 M。在10 cm培养皿中加入530 µL 2.5 M甘氨酸-1x PBS至总体积10 mL（例如，在15 cm培养皿中加入1060 µL至总体积20 mL）。 
		注意：如果细胞是在溶液中固定的，需用1590 µL的2.5 M甘氨酸-1x PBS淬灭固定反应。</li>
		<li>室温孵育5分钟，轻轻振荡混匀。</li>
		<li>将培养皿转移至冰上，同时在摇床上轻轻混匀，于冰上再孵育15分钟。 
		注意：从此步骤开始，细胞必须始终置于冰上，缓冲液必须预先冰浴，以避免进一步交联。若需处理多块培养板，应转移至冷室操作。</li>
		<li>将固定液倒入烧杯中，以快速处理细胞。 
		注意：请根据相应的健康与安全法规处理含甲醛的液体废弃物。</li>
		<li>用5 mL冷的0.125 M甘氨酸-1x PBS（15 cm培养皿使用8 mL）快速冲洗10 cm培养皿两次，以去除碎片和死细胞。将液体倒入烧杯中以快速处理并移除培养皿中的液体。</li>
		<li>向10 cm培养皿中加入5 mL冰冷的0.125 M甘氨酸-1×PBS（15 cm培养皿加10 mL），用塑料细胞刮迅速刮下细胞。</li>
		<li>使用血清移液管将细胞悬液转移至预冷的50 mL锥形离心管中。</li>
		<li>用5 mL冰冷的0.125 M甘氨酸-1x PBS洗涤平板两次，并将细胞悬液加入锥形离心管中。</li>
		<li>480 × g 离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。 
		注意：如果细胞是在溶液中固定的，需将细胞转移至预冷的锥形离心管中，在480 x g条件下离心沉淀 g 4 °C下孵育10分钟。将固定液倒入烧杯中弃去，用10 mL冷的0.125 M甘氨酸-1x PBS洗涤细胞3次。每次洗涤均需充分重悬细胞。</li>
		<li>使用台式抽吸系统吸除上清液。按照每 1 × 10⁶ 个细胞加入 500 µL 1× PBS 的比例重悬细胞。7 使用P1000移液器轻轻吹打细胞悬液，上下吹吸以重悬细胞。为准确体积重悬细胞，请参考步骤2.2.1中获得的总细胞数估算值。</li>
		<li>将500 µL细胞悬液分装至计算所需数量的1.5 mL微量离心管中（每管1 x 10⁶个细胞）7 细胞/管</li>
		<li>480 × g 离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
		<li>使用台式抽吸系统去除上清液，并将细胞沉淀在液氮中速冻。将干燥的细胞沉淀于 -80 °C 保存。 
		注意：样品可保存至少1年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解
	<ol>
		<li>将冻存的沉淀物置于冰上解冻。</li>
		<li>在 H 中配制 1.5 mL 裂解缓冲液2每样品0：加入10 mM Tris-HCl（pH 8.0）、10 mM NaCl和0.2% NP40。</li>
		<li>加入600 µL预冷的裂解缓冲液，冰上充分重悬。</li>
		<li>冰上孵育15分钟，使细胞膨胀。</li>
		<li>2655 × g 离心 g 在4 °C下离心5分钟，使用台式抽吸系统弃去上清液。</li>
		<li>为去除碎片，将沉淀重悬于1 mL冷裂解缓冲液中，2655 x g离心 g 4 °C下离心5分钟，弃上清液。</li>
		<li>再次短暂离心，2655 x g 在4 °C条件下，使用配有P200吸头的台式抽吸系统尽可能去除残留的上清液。</li>
		<li>用 100 µL 0.5% (vol/vol) SDS 重悬。</li>
		<li>在62 °C下于恒温混匀仪中孵育，以1400 rpm速度振荡10分钟。</li>
		<li>加入 290 µL 的 H2加入50 µL 10% TritonX-100，充分混匀，避免产生气泡。</li>
		<li>在37 °C下于恒温混匀仪中孵育，以1400 rpm速度振荡15分钟。</li>
		<li>加入50 µL的10x DpnII缓冲液，轻轻翻转试管以混匀。</li>
		<li>取50 µL未消化的DNA作为质控样本，放入单独的离心管中。切勿遗漏未消化的对照样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DpnII 消化
	<ol>
		<li>加入10 µL DpnII高浓度酶（共500 U），通过倒置混匀。</li>
		<li>将样品与未消化对照组置于37 °C的恒温混匀仪中孵育，以1400 rpm速度振荡混合 &#62;4 h。</li>
		<li>在当天结束时加入 10 µL 高浓度 DpnII（共 500 U）。</li>
		<li>将样品与未消化对照组在37 °C、1400 rpm转速下振荡孵育过夜。</li>
		<li>第二天开始时，向样品中加入10 µL DpnII高浓度酶（共500 U）。</li>
		<li>将样品与未消化对照组置于37 °C的恒温混匀仪中，以1400 rpm振荡孵育4小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连接与交联逆转
	<ol>
		<li>将试管在65 °C、1400 rpm条件下孵育20分钟。 
		注意：此时不要加入SDS。目的是保持细胞核的完整性，从而使连接反应在细胞核内进行，避免需要极低浓度条件。</li>
		<li>将样品置于冰上冷却，时间不超过5-10分钟。为避免SDS析出，切勿将样品在冰上放置超过此时间。</li>
		<li>取50 µL未连接的消化后DNA，置于另一管中用于质量控制。将未消化和未连接的对照样品于-20 °C保存。 
		注意：切勿忘记取未连接的对照样品。</li>
		<li>加入800 µL连接反应混合液：122 µL 10x连接酶缓冲液、8 µL T4连接酶（30 U/µL）和670 µL H₂O20.</li>
		<li>16 °C 下孵育，以 1000 rpm 转速振荡过夜。</li>
		<li>向样品中加入 7.5 µL 蛋白酶 K（20 mg/mL），向对照中加入 2 µL。</li>
		<li>65 °C、1000 rpm 条件下孵育 4 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA纯化
	<ol>
		<li>将样品置于冰上转移至预冷的15 mL圆锥形离心管中，加入2 mL水、10.5 mL预冷的乙醇和583 µL 3 M NaAC。 
		注意：额外添加的水旨在防止DTT被带入沉淀中。</li>
		<li>向未消化且未连接的质控样本中加入 200 µL 冰冷的 EtOH、10.8 µL NaAC 和 1 µL 共沉淀剂。</li>
		<li>在 -80 °C 下孵育至少 4 小时至过夜。</li>
		<li>将15 mL离心管在2200 x g 4 °C 下孵育 45 分钟。</li>
		<li>将1.5 mL对照管在20,500 x g 4 °C 下孵育 30 分钟</li>
		<li>用 3 mL（样品）和 1 mL（对照）冰浴预冷的 70% EtOH 洗涤一次。</li>
		<li>2200 x 离心 g （样品）或 20,500 × g （对照组）置于 4 °C 下 10 分钟。</li>
		<li>小心移除乙醇，室温下晾干10–15分钟；切勿过度干燥。</li>
		<li>将样品和对照分别重悬于 100 µL 和 20 µL 的 H2O 中。</li>
		<li>加入1 µL RNaseA，在37 °C、1400 rpm振荡条件下孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3C 模板制备的质量控制
	<ol>
		<li>使用高灵敏度DNA浓度测定用荧光计试剂盒对每个样本和对照进行定量。</li>
		<li>在1%琼脂糖/1×TBE凝胶上每条泳道加样100–200 ng的各待测样本及对照样本。</li>
		<li>通过比较对照组和3C模板的DNA片段大小差异，验证凝胶图像是否显示出预期结果，如图所示 图2A.</li>
		<li>将样品和对照品在 -20 °C 下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多重测序的杂交、捕获与样本处理
	<ol>
		<li>将生物素标记的RNA探针阵列与3C模板杂交，捕获目标连接片段，并根据本研究中用于双端多重测序的目标富集系统对样本进行测序前准备（参见 材料表）。按照制造商提供的说明书进行操作，同时引入以下细微修改：
		<ol>
			<li>制造商操作指南第2部分：样品制备
			<ol>
				<li>从3 µg基因组DNA起始，按照靶向富集的说明进行操作。</li>
				<li>使用超声波破碎仪对DNA进行剪切，具体参数如下：10%占空比，强度4，200个循环/脉冲，持续130秒。每个捕获反应中，以4 µg 3C模板溶于130 µL水中作为起始材料，以确保获得足量产物，可用于后续实验中3 µg剪切后DNA的样本制备。</li>
				<li>评估剪切后 DNA 的质量。按照高灵敏度方案，将 1 µL 剪切后的 DNA 在 DNA 生物分析仪上进行检测。预期片段大小分布在 150–700 bp 之间。图2).</li>
				<li>使用固相可逆固定化（SPRI）磁珠纯化样品。向124 µL DNA样品中加入124 µL SPRI磁珠，按照制造商说明书进行1:1左侧片段大小选择，并用25 µL无核酸酶水洗脱。此纯化步骤可去除较短的片段，富集约300 bp的DNA片段图2). 
				注意：此步骤中所用样本量和 SPRI 磁珠量已考虑在将样本转移至新管及在 Bioanalyzer 上进行质量控制过程中发生的体积损失。所有后续片段大小选择步骤均按照试剂盒生产商推荐的比例进行。SPRI 磁珠的 DNA 洗脱全程在室温下进行。</li>
				<li>评估经片段大小筛选的剪切DNA质量。按照高灵敏度（HS）方案，将1 µL剪切后的DNA在DNA生物分析仪上进行检测。预期片段大小分布中，300 bp处富集程度最高。图2）。如果DNA剪切成功，则继续进行剪切后DNA的定量分析。</li>
				<li>使用高灵敏度DNA浓度测定用荧光计试剂盒对剪切后的DNA进行定量。 
				注意：如果DNA打断后获得的DNA产量低于 &#60;3 µg，使用另外4 µg DNA进行第二轮DNA打断，并在第一次SPRI磁珠纯化步骤后合并打断的DNA样本，以获得总量为3 µg的打断DNA。</li>
				<li>向经片段大小筛选并纯化的DNA样本（总量3 µg）中加入无核酸酶水，调整终体积至48 µL，随后按照试剂盒生产商的说明书进行末端修复反应。</li>
				<li>连接成对末端接头后，根据试剂盒说明书进行5个循环的捕获前PCR扩增（PCR条件和引物信息由试剂盒提供）。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>制造商方案第4部分：杂交与捕获
			<ol>
				<li>为了使制备的DNA样本与靶标特异性RNA探针杂交，将750 ng DNA样本稀释至终体积3.4 µL，使初始浓度为221 ng/µL。对于稀释体积较大的DNA样本，使用真空离心浓缩仪浓缩至终体积。真空离心浓缩（250 × g；对于重悬于10 µL中的样品，通常在≤45 °C条件下处理15–20分钟即可。在使用真空离心浓缩仪前，务必确保各样品的上样体积一致。</li>
				<li>按照制造商说明，在65 °C下孵育杂交混合物16–18小时，加热盖温度设为105 °C。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>制造商方案第5部分：多重测序的加索引与样本处理
			<ol>
				<li>根据制造商提供的说明，使用带索引的引物对捕获的文库进行12个循环的捕获后PCR扩增（PCR条件和引物信息在试剂盒中提供）。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>下一代测序
	<ol>
		<li>为在同一张流动池上运行多个捕获型Hi-C文库，需制备等摩尔浓度的捕获文库混合物，并对每个文库测序100–120百万条读长。</li>
		<li>若需进行等位基因特异性分析，应进行150 bp双端测序，以确保足够的SNP覆盖度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>应用 HiC-Pro 流程进行 Capture Hi-C 数据分析55。HiC-Pro 在处理的每个步骤中均提供质量控制，包括（图 3）： 
	(i)参考基因组上的比对率，用于说明跨越连接位点的读段比例，以及成对读段和单端读段的数量。 
	(ii)有效连接产物的比例以及无信息读段对（悬垂末端、自连接等）的比例。 
	(iii)短程/长程以及染色体内/染色体间相互作用的比例。 
	(iv)Capture Hi-C 的靶上相互作用比例。 
	(v)若已指定，则包括等位基因特异性读段的比例。 
	注意：HiC-Pro 支持多种实验方案，包括 in situ Hi-C 和 Capture Hi-C。在后一种情况下，用户只需在配置文件中指定目标区域（BED 格式）。数据处理完成后，HiC-Pro 的输出可轻松转换为 cooler 对象以进行下游分析56。在此步骤中，使用 Imakaev 及其同事先前描述的 ICE 方法对不同分辨率的相互作用图谱进行标准化57。随后可运行多种分析以识别染色体区室、拓扑关联结构域（TADs）或染色质环（综述见58）。该实验方案的工作流程如 图 4 所示。此处应用“cooltools”工具包计算绝缘分数和 TAD 边界，如 图 5 和 图 6 所示59。</li>
</ol>

Kai Hauschulz 是安捷伦科技公司诊断与基因组学部门的现场应用科学家。其他所有作者均声明不存在竞争利益。

本文介绍了一种相对快速且简便的染色质捕获技术（Capture Hi-C），用于在5–10 kb分辨率下表征兆碱基大小的基因组区域的高级空间组织结构。Capture Hi-C属于Capture-C技术家族，旨在从全基因组范围的3C或Hi-C文库中富集特定目标染色质相互作用。迄今为止，大多数Capture-C应用主要用于绘制遍布整个基因组的较小调控元件的染色质互作图谱。在首个Capture-C实验方案中，研究人员使用多个重叠的生物素化RNA探针，从红系细胞构建的3C文库中捕获了&#62;400个预先选定的启动子31。该策略随后在下一代（NG）和核滴定（NuTi）Capture-C中得到改进，通过使用跨越单一限制性酶切位点的120 bp DNA捕获探针，并进行两轮连续捕获，以最大化富集具有信息量的连接片段，从而实现了对&#62;8,000个启动子的高分辨率互作分析32,40。这些方法已在多种生物学背景下推动了对顺式作用元件的功能解析，包括小鼠胚胎发育、细胞分化、X染色体失活以及病理条件下基因表达失调等过程46,63,65,66,67,68,69,70,71。
在启动子捕获 Hi-C（PCHi-C）技术中，通过在限制性酶切片段的一端或两端杂交单链 120-mer 生物素化 RNA 探针，从 Hi-C 文库中富集了超过 22,000 个已注释的含有限制性酶切片段的启动子&#62;22,00034,72。该方法使得在越来越多的细胞类型中解析数千个启动子的相互作用组成为可能，包括小鼠胚胎干细胞、胎肝细胞和脂肪细胞34,35,72,73，以及人类淋巴母细胞系、造血祖细胞、表皮角质形成细胞和多能细胞37,74,75,76,77。
与这些靶向富集技术相比，Capture Hi-C 可靶向连续的基因组区域，范围可达兆碱基（megabase）尺度，从而跨越一个或多个拓扑关联结构域（TAD），并涵盖基因的调控区域。目标区域内所有 DpnII 限制性酶切位点均需被一系列生物素标记的探针覆盖，以实现对整个目标区域的完整铺排。生物素化探针阵列与 3C 模板的杂交、随后基于链霉亲和素的捕获以及用于多重测序的处理，均通过适用于Illumina双端多重测序的目标富集系统完成。整个实验流程快速，从 3C 文库构建到下一代测序（NGS）可在 1 周内完成，且仅需少量调整或针对特定情况的故障排查。
与其它基于3C的方法相比，该方案还具有优势。为了获得5-10 kb分辨率的相互作用图谱，我们测序了1亿至1.2亿条成对末端读长。作为对比，本研究中使用了一个包含5.71亿条读长的Hi-C数据集以达到20 kb的分辨率64（GSM2053973），而若要通过全染色体范围的Hi-C达到5 kb分辨率，则至少需要10亿条读长22。
本研究中使用的Capture Hi-C技术相比先前基于6-bp切割限制性内切酶的5C方法具有更高的分辨率47（补充表1）。重要的是，5C技术中用于富集和扩增目标相互作用的策略无法实现染色质相互作用的等位基因特异性分析。相反，Capture Hi-C数据可进行等位基因特异性比对，从而能够解析同源染色体对的三维结构图谱，例如在人类细胞或通过遗传背景不同的小鼠品系杂交获得的F1杂合细胞系中78。为了在5 kb分辨率下生成等位基因特异性的Capture Hi-C相互作用图谱，我们对150 bp的双端测序读长进行测序，以提高单核苷酸多态性（SNP）的覆盖度。类似等位基因特异性的方法也可应用于已有SNP注释的人类细胞系22。
重要的是，尽管染色质相互作用捕获测序（Capture Hi-C）通常能在提高测序成本效益的同时保证高分辨率，但定制化的生物素化寡核苷酸的合成确实会影响该方法的整体成本。因此，针对不同应用场景，最合适的 3C 方法的选择会有所不同，具体取决于所研究的生物学问题、所需的分辨率以及目标区域的大小。其他已开发的 Capture Hi-C 方案与本文所述方案具有关键共性。例如，已有研究采用 Capture Hi-C 策略对与乳腺癌和结直肠癌风险相关的非编码变异区域（跨度约为 50 kb 至 1 Mb）进行表征；在该方案中，通过使用覆盖目标区域达 3 倍深度的 120-mer RNA 捕获探针，从 Hi-C 文库中富集目标区域33,38,79。类似地，杂交捕获 Hi-C（HYbrid Capture Hi-C，Hi-C2）被用于靶向富集最大达 2 Mb 的目标区域内的染色质相互作用80。在这两种方案中，利用富含生物素的 Hi-C 模板对连接片段进行富集，从而提高了总有效读段的比例，相较于本方案更具优势。例如，在本研究用于比较的 Hi-C 数据集64（GSM2053973）中，去除重复后有效配对读段的比例比本文所述 Capture Hi-C 实验获得的有效配对读段高出 4.8 倍（见图 3和补充表 1）。然而，连续进行生物素化连接片段和杂交探针的富集步骤显著增加了实验的复杂性和耗时，同时可能降低捕获区域的文库复杂度。
另一种可用于通过平铺探针富集3C模板的方法是Tiled-C，该方法已被应用于研究小鼠红系分化过程中具有高空间和时间分辨率的染色质结构43。在Tiled-C中，使用一组70 bp的生物素化探针，通过连续两轮捕获来富集大范围区域内的相互作用，从而生成靶向相互作用的极高分辨率图谱43,81。双重捕获富集也使得该实验流程相较于Capture Hi-C更长且更复杂。然而，与靶向单个限制性酶切位点的Capture-C策略不同，在Tiled-C中第二轮捕获似乎并未显著提高捕获效率，因此可能可以省略43。最后，一种类似的平铺探针策略基于本研究中所使用的相同靶向富集方法，已被应用于解析先天性畸形患者中描述并在转基因小鼠中重建的结构变异所涉及的调控区域41,42。在该研究中，探针的平铺阵列设计覆盖了整个靶区域，而非局限于DpnII限制性酶切位点附近41。尽管如此，这项工作具有开创性意义，突显了该策略在不同背景下实现大片段基因组区域高分辨率表征的灵敏度与强大能力41,42,48。
综上所述，本文所述方案代表了一种简便、稳健且功能强大的策略，可用于对任何感兴趣的基因组区域进行高分辨率的三维表征。将该方法应用于不同的模式系统、细胞类型、发育调控的染色质景观以及健康与疾病状态下的基因调控，有望促进我们对基因组拓扑结构与基因调控之间相互作用及其因果关系的理解，这是表观遗传学领域中一个根本性的未解问题。此外，应用Capture Hi-C技术来绘制全基因组关联研究（GWAS）所鉴定的风险变异位点的长程相互作用和高级染色质折叠结构，有望揭示与人类疾病相关的非编码基因组位点在不同背景下的功能意义，从而为潜在致病机制的解析提供新的见解。

线性基因组包含了一个生物体进行胚胎发育并在成年期存活所需的所有信息。然而，指导遗传上完全相同的细胞执行不同功能，是精确调控在特定背景下（包括不同组织和/或发育阶段）使用哪些信息的基础。人们认为，基因组的三维结构通过促进或阻止在线性基因组中相距可达数百千碱基的调控元件之间的物理相互作用，参与了基因活性的这种精确时空调控（综述见1,2,3）。在过去的20年中，我们对基因组折叠与功能之间相互关系的理解迅速加深，这主要得益于染色体构象捕获技术（3C）的发展（综述见4,5,6,7）。这些方法通过检测基因组任意区域之间相互作用的频率，依赖于细胞核内空间上邻近的DNA序列的连接。最常见的3C实验流程首先使用甲醛等交联剂对细胞群体进行固定。接着，使用限制性内切酶消化交联的染色质，尽管也有研究采用MNase进行消化8,9。消化完成后，空间上邻近的游离DNA末端被重新连接，随后解除交联。此步骤产生3C“文库”或“模板”，即一种混合的杂交片段库，其中在细胞核内三维空间上邻近的序列更有可能被连接到同一DNA片段中。对这些杂交片段进行后续定量分析，可推断在线性基因组中相距数千个碱基对的基因组区域在三维空间中的构象。
已开发出多种不同的方法来表征3C文库，这些方法在所分析的连接片段子集以及用于下游定量的技术方面均有所不同。原始的3C方案依赖于选择两个感兴趣的区域，并通过PCR定量它们之间的“一对一”相互作用频率10,11。4C方法（环状染色体构象捕获）用于测量一个特定基因座（即“视角位点”）与基因组其余部分之间的相互作用（“一对全”）12,13,14。在4C中，3C文库经历第二轮酶切和重新连接，以生成小的环状DNA分子，随后使用特异性针对视角位点的引物进行PCR扩增15。5C技术（染色体构象捕获碳拷贝）能够表征更大区域内染色质的三维相互作用，从而揭示该区域内高级染色质折叠的信息（“多对多”）16。在5C中，3C文库与一组覆盖限制性酶切位点的寡核苷酸探针杂交，随后通过通用引物进行多重PCR扩增15。在4C和5C中，最初使用微阵列对有信息价值的DNA片段进行定量，之后转为使用高通量测序（NGS）17,18,19。这些策略可用于研究特定目标区域，但无法用于全基因组范围的相互作用图谱绘制。这一目标可通过Hi-C实现，Hi-C是一种基于3C的高通量策略，通过对3C模板进行大规模并行测序，无偏倚地在全基因组水平上表征染色质折叠（“全对全”）20。Hi-C方案包括在酶切后的片段末端引入生物素标记残基，随后利用链霉亲和素磁珠富集连接产物，以提高连接片段的回收率20。
Hi-C 技术揭示了哺乳动物基因组在三维细胞核中具有多层次的结构组织。在兆碱基尺度上，基因组被划分为活性染色质和非活性染色质区域，分别称为 A 和 B 区室20,21。后续研究还表明，存在由不同染色质状态和活性状态代表的进一步亚区室22。在更高分辨率下，基因组被进一步划分为亚兆碱基大小的自相互作用结构域，称为拓扑关联结构域（topologically associating domains, TADs），该结构域最初通过人类和小鼠基因组的 Hi-C 和 5C 分析被发现23,24。与具有组织特异性变化的区室不同，TADs 通常较为保守（尽管存在许多例外情况）。重要的是，TAD 边界在不同物种间具有保守性25。在哺乳动物细胞中，TADs 常包含共享相同调控环境的基因，并已被证明代表一种结构框架，有助于基因共调控，同时限制与邻近调控区域的相互作用（综述见3,26,27,28）。此外，在 TADs 内部，由于黏连蛋白挤出环底部的 CTCF 位点所介导的相互作用，可能增加启动子-增强子或增强子-增强子之间相互作用的概率（综述见29）。
在Hi-C技术中，可以在1 Mb至40 kb的分辨率下检测到染色质区室（compartments）和拓扑关联结构域（TADs），但通过提高分辨率，还可进一步表征更小尺度的染色质相互作用，例如在5–10 kb尺度上远端元件之间的成环互作。然而，为了高效检测此类成环结构而提高Hi-C分辨率，需要显著增加测序深度，从而导致测序成本大幅上升。若分析还需实现等位基因特异性，则这一问题将更加突出。实际上，分辨率提高X倍，所需的测序深度需增加X2倍，这意味着高分辨率且等位基因特异性的全基因组研究方法可能因成本过高而难以实施30。
为了在保持高分辨率的同时提高成本效益和可负担性，可在下游测序之前，通过互补的生物素标记寡核苷酸探针与全基因组范围的 3C 或 Hi-C 文库杂交，将目标兴趣区域从文库中物理性地富集下来。这类靶向富集策略被称为 Capture-C 方法，可实现对遍布基因组的数百个靶位点相互作用的检测（例如启动子捕获（PC）Hi-C；下一代（NG）Capture-C；低起始量（LI）Capture-C；细胞核滴定（NuTi）Capture-C；Tri-C）31,32,33,34,35,36,37,38,39,40，或跨越长达数兆碱基区域的相互作用（例如 Capture Hi-C；杂交捕获 Hi-C（Hi-C2）；Tiled-C）41,42,43。基于捕获的方法中存在两个可变方面：（1）生物素化寡核苷酸的性质与设计（例如 RNA 或 DNA，单个寡核苷酸用于捕获分散的基因组靶点，或多个寡核苷酸拼接覆盖某一特定区域）；（2）用于富集靶标的模板，可以是 3C 或 Hi-C 文库本身，后者由从 3C 文库中富集得到的生物素化限制性酶切片段组成。
本文描述了一种基于从3C文库中富集目标互作的Capture Hi-C实验方案。该方案依赖于定制的生物素化RNA探针平铺阵列的设计，从3C文库制备到高通量测序可在1周内完成。该方法快速、简便，能够在5 kb分辨率下表征兆碱基大小的目标区域的高级别三维基因组结构，同时在时间效率和成本效益方面优于其他3C类方法。本Capture Hi-C方案已应用于X染色体失活（XCI）的主调控位点——X失活中心（Xic），该区域包含Xist非编码RNA。此前，Xic已接受过广泛地结构与功能研究（综述见44,45）。在哺乳动物中，XCI通过转录沉默雌性细胞（XX）中两条X染色体之一的绝大部分基因，以平衡雌雄（XY）之间X连锁基因的剂量差异。Xic已成为研究三维基因组拓扑结构及其与基因调控关系的强大且被广泛认可的标准位点44。在小鼠胚胎干细胞（mESCs）中对Xic进行的5C分析促成了拓扑相关结构域（TADs）的发现与命名，首次揭示了基因组拓扑分区与基因共调控的功能意义24。后续研究表明，Xic的拓扑结构在Xist基因的适时上调及XCI的正常发育时序中起关键作用46，并且最近在Xic区域内还发现了可影响TAD内及TAD间基因活性的未知顺式调控元件47,48,49。将Capture Hi-C应用于跨越Xic的小鼠X染色体上约3 Mb的区域，展示了该方法在高分辨率下解析大规模染色质折叠结构的强大能力。本文提供了从目标区域每个DpnII限制性酶切位点处设计生物素化探针阵列，到全基因组3C文库构建、目标互作的杂交与富集，以及后续数据分析的详细且易于操作的实验流程。同时概述了适当的质控指标和预期结果，并结合现有类似方法，讨论了该技术的优势与局限性。

<table><tbody><tr><td>10x PBS，pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>37%（体积比）多聚甲醛溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15686</td><td>一次性玻璃小瓶；禁止重复使用</td></tr><tr><td>50 mL 聚丙烯锥形管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9539-500g</td><td></td></tr><tr><td>生物分析仪（Bioanalyzer）</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀 - 25 cm 手柄，3.0 cm 刀片</td><td>Falcon</td><td>353089</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon Medchem BV</td><td>Axon 1386</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini 蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）</td><td>Merck</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数板载玻片</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL</td><td>Invitrogen</td><td>ZGEXSCCOUNTESS2FL</td><td>全自动细胞计数仪</td></tr><tr><td>Covaris S2</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>超声破碎仪</td></tr><tr><td>DNA LoBind 管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108051</td><td></td></tr><tr><td>DpnII（50000 单位/mL）</td><td>New England Biolabs</td><td>R0543M</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Merck</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（100%）</td><td>Merck</td><td>1.00983.2500</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Thermo Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>猪皮明胶</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Marker</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9516</td><td>共沉淀剂</td></tr><tr><td>高灵敏度 Bioanalyzer 芯片</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>大型冷冻离心机 5920 R</td><td>Eppendorf</td><td>5948000018</td><td></td></tr><tr><td>白血病抑制因子（LIF）</td><td>Merck</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Liquiport</td><td>KNF</td><td>NF300</td><td>台式抽吸系统</td></tr><tr><td>低吸附滤芯吸头</td><td>Biozym</td><td>VT0260U, VT0240, VT0220, VT0200U</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级水</td><td>Merck</td><td>W3500-6x500ML</td><td></td></tr><tr><td>Next Seq 500</td><td>Illumina</td><td>SY-415-1001</td><td></td></tr><tr><td>Next Seq 500 高输出 v2 试剂盒（300 个循环）</td><td>Illumina</td><td>FC-404-2004</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 替代物（NP40）</td><td>Merck</td><td>11332473001</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem BV</td><td>Axon 1408</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物（无EDTA）</td><td>Merck</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K - 重组，PCR级（20 mg/mL）</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q32871</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA 高灵敏度检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>RNase A（10 mg/mL）</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠 pH 5.2（3 M）</td><td>Merck</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>真空离心浓缩仪</td><td>Eppendorf</td><td>EP5305000100-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPureXP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>SPRI 磁珠</td></tr><tr><td>SureSelect 靶向富集试剂盒 1</td><td>Agilent</td><td>5190-8645</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect 靶向富集试剂盒 ILM 索引杂交模块 2</td><td>Agilent</td><td>5190-4455</td><td></td></tr><tr><td>SureSelect XT 文库制备试剂盒 ILM</td><td>Agilent</td><td>5500-0132</td><td></td></tr><tr><td>T4 连接酶（30 单位/&amp;micro;L）</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0013</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机 5427 R</td><td>Eppendorf</td><td>5409000012</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100（500 mL）</td><td>Merck</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 甘氨酸</td><td>Thermo Scientific</td><td>15527013</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Thermo Scientific</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

通过捕获式 hi-c 解析高分辨率 3d 染色质结构 via capture hi-c

Deciphering High-Resolution 3D Chromatin Organization via Capture Hi-C

基因组的空间组织在其功能和调控中发挥重要作用，涉及转录、复制、重组和修复等多种生物学过程。因此，明确基因组拓扑结构与功能之间的精确因果关系至关重要，也正日益成为深入研究的热点。染色体构象捕获技术（3C）通过测量基因组任意区域之间的相互作用频率，可推断染色质的三维结构。本文介绍了一种快速且简便的Capture Hi-C实验方案，该方法基于3C技术，通过靶向富集策略，能够在高分辨率下解析长达兆碱基规模的基因组靶区的等位基因特异性三维结构。在Capture Hi-C中，靶区域在后续高通量测序之前，由一组生物素标记的探针进行富集捕获，从而在提高技术时效性和经济性的同时，实现更高的分辨率和等位基因特异性。为展示该方法的优势，我们将Capture Hi-C应用于小鼠X染色体失活中心(Xic)，即X染色体失活（XCI）的核心调控位点。

所描述的Capture Hi-C方案基于使用四碱基切割酶（DpnII）制备全基因组范围的3C模板。随后通过一组连续覆盖目标基因组区域的RNA探针进行杂交，并利用本研究中所用目标富集系统中的链霉亲和素捕获方法，实现对连接片段的富集图1）。选择生物素标记的RNA探针，因为与DNA探针相比，其对靶标的结合亲和力更强52,60捕获的文库随后进行加索引和混合，用于多重高通量测序。捕获Hi-C数据可被可视化为高分辨率的Hi-C相互作用图谱，也可呈现为类似4C的单视角接触图谱，以特异性展示整个捕获区域内较小序列（如启动子或增强子）的相互作用。该实验方案的工作流程如图所示。 图4测序前质量控制如图所示 图2 并包括对3C模板的适当消化与重新连接，以及在方案不同步骤中对其有效剪切和纯化的评估。剪切后的3C模板DNA片段大小应在150至700 bp之间，且无片段富集现象 &gt;应检测到2 kb。在后续步骤中，将进行若干基于磁珠的DNA纯化和片段大小选择步骤，分别在片段打断后、捕获前PCR以及捕获后PCR之后进行。经纯化的文库在高灵敏度DNA生物分析仪上可观察到明显的片段富集谱型。图2。由于接头、测序引物和索引引物的连接，文库构建过程中片段的平均长度逐渐增加。测序后的质量控制已获得 通过 Hi-C Pro 并展示于 图3已有多种不同的生物信息学软件被提出用于3C类数据的处理与分析。其中，HiC-Pro流程是目前最流行的解决方案之一，可将原始测序数据处理为多种分辨率的最终染色质相互作用图谱55HiC-Pro 采用两步映射策略，将测序读段比对到参考基因组上。随后重建并过滤 3C 产物，以去除无信息量的接触对，并生成接触图谱。此外，该工具能够利用已知多态性位点列表进行等位基因特异性分析，将来自两个亲本等位基因的接触信号分别分配到不同的接触图谱中。最近，HiC-Pro 已被纳入并扩展至 nf-core 框架（nf-core-hic），形成了一个高度可扩展、可重复且由社区驱动的分析流程。61,62.
为了捕获小鼠 Xic 区域，设计了一组包含 28,913 个 RNA 探针的阵列，覆盖 X 染色体上约 3 Mb 的区域。该区域包括 X 染色体失活（XCI）的关键基因——长链非编码基因 Xist 及其已知的约 800 kb 的调控区域（图 5）。这约 800 kb 的区域被划分为两个拓扑关联结构域（TAD）：其中一个 TAD 包含 Xist 启动子及其已知的正向调控因子（即非编码转录本 Ftx、Jpx 和 Xert，以及蛋白编码基因 Rnf12）；相邻的 TAD 则包含 Xist 的负向顺式调控元件（即其反义转录本 Tsix、增强子元件 Xite 和非编码转录本 Linx）（综述见44,45）。
通过将所述的Capture Hi-C方案应用于Xic，获得了该基因座前所未有的高分辨率拓扑结构（图6 和 图7）。当将Capture Hi-C图谱与先前发表的5C47（图6 和 图7；补充表1）以及Hi-C61（图6 和 图7；补充表1）图谱进行比较时，这一优势尤为明显。例如，亚TAD结构更加清晰——包含Xist启动子的TAD（Xist-TAD）被明确划分为两个更小的结构域（图6A，蓝色箭头）。此前，仅能从5C图谱中视觉上“推测”该结构的存在（图6B），尽管使用绝缘评分算法可在该区域检测到边界。同样，Capture Hi-C图谱的分辨率使得在邻近的TAD中也能识别出两个更小的结构域（图6A、B），该TAD包含Tsix基因座的启动子（Tsix-TAD）；而此前使用5C技术未能实现这一分辨（图6B）。值得注意的是，基于Capture Hi-C和5C数据通过绝缘评分算法确定的拓扑边界，通常在位置上略有差异，且相对强度也有所不同。
此外，其他亚TAD结构（如接触环）在Capture Hi-C数据中也清晰可见，例如位于两者之间的环状结构 Xist 和 Ftx (图7A），先前通过Capture-C鉴定63，以及两者之间的环状结构 Xist 和 Xert (图7B），最近通过类似的捕获Hi-C（Capture Hi-C）方案鉴定发现48. 由于Capture Hi-C图谱分辨率的提高，其他接触位点也可以更精确地被定位，例如在Tsix-TAD内形成已知接触热点的那些位点 林克斯, Chic1 和 Xite 位点（图7A).
与所示的Hi-C数据相比 图7，染色质相互作用捕获测序（Capture Hi-C）使分辨率提高了四倍，而测序深度仅需原来的四分之一（即126 M reads对比571 M）（补充表1）。分辨率的提高使得能够检测到亚拓扑关联结构域（subTADs）以及染色质环状互作，而这些在所示测序深度下通过Hi-C技术无法检测到 图6 和 图7因此，与以往的方法相比，所描述的Capture Hi-C方案能够对感兴趣的大型基因组区域进行更为详细且高分辨率的表征。
<img alt="染色体定位图；DpnII限制性位点；基因探针；序列分析；ChrX细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：探针设计。探针设计策略的示意图。 在3 Mb目标区域中，每个DpnII限制性位点上下游各300 bp的区域被选定，并用重叠的生物素化RNA探针进行覆盖。其中一个选定区域如图所示，chrX: 102,474,805-102,475,500。每个探针中重复序列的长度不得超过40个碱基。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA片段分离的电泳凝胶；3C文库分析的荧光图谱" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：染色质相互作用捕获高通量测序前质量控制 (A3C 模板质量控制的代表性示例。将 200 ng DNA 加样至 1% 琼脂糖凝胶。泳道 1：1 kb DNA 标准分子量标记。泳道 2：未消化、交联且完整的染色质呈现为位于高分子量区域的清晰条带 &gt;10 kb。泳道3：经DpnII消化的交联染色质片段大小在1 kb至3 kb之间，呈弥散条带。泳道4：最终的3C文库或模板；消化后的交联DNA片段的游离末端重新连接。低分子量的DNA弥散条带几乎不可见，连接产物表现为一条条带 &gt;10 kb。B高灵敏度生物分析仪DNA图谱的代表性示例。左上：成功剪切的3C文库，显示片段大小分布在150 bp至700 bp之间。右上：剪切效果不理想的3C文库，未剪切的DNA表现为片段的广泛富集 &gt;2 kb。C左下：使用 SPRI 磁珠进行 1:1 左侧片段大小选择后的剪切 DNA 样本，富集约 300 bp 的片段。中下：根据制造商说明书连接双端接头后的捕获前 PCR 图谱。右下：最终的捕获 Hi-C 文库，包含用于多重测序的接头、测序引物和索引引物。缩写：bp = 碱基对，FU = 荧光相对单位 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="HiC-Pro 统计分析图表；比对、配对、过滤、接触、等位基因、捕获数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：使用 HiC-Pro 进行染色质捕获 Hi-C 测序后的质量控制。（A）测序双端读段中第一端在参考基因组上的比对率示例。浅蓝色部分表示由 HiC-Pro 比对到基因组并跨越连接位点的读段。因此，该指标可用于验证实验中的连接步骤。（B）当测序双端读段比对到基因组后，仅保留唯一比对的读段对用于后续分析。（C）无效的读段对（红色部分），例如悬垂末端、自环化或再连接产物，将被排除在分析之外。有效读段对的比例是评估连接效率和富集效率的良好指标。（D）有效读段对可进一步划分为染色体内/染色体间以及短距离/长距离相互作用。可能代表 PCR 扩增伪影的重复读段对将被剔除。（E）在等位基因特异性分析中，HiC-Pro 报告支持每个亲本基因组（即 C57BL/6J × CASTEi/J）中单个或两个读段的等位基因读段数量。预期分配给母源和父源等位基因的读段比例相近。（F）最后，仅选择覆盖捕获区域的有效读段对用于构建相互作用图谱。捕获-捕获读段对代表靶向区域内的相互作用，而捕获-报告读段对则反映靶向区域与非靶向区域之间的相互作用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="染色质构象捕获工作流程示意图：交联、DpnII 消化、测序、分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：Capture Hi-C 实验流程图。 不同实验步骤的示意图。为构建全基因组范围的 3C 模板，首先使用甲醛对染色质进行交联，随后用 DpnII 限制性内切酶进行消化。接着将游离的 DNA 末端重新连接，逆转交联，并纯化 DNA。为了富集包含目标区域的片段，将一组生物素标记的 RNA 探针与 3C 模板杂交，并通过链霉亲和素介导的下拉法进行捕获。捕获文库经多重测序处理后，通过定量有效的连接片段来推断目标区域内染色质相互作用的频率，并以高分辨率的相互作用图谱形式呈现。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠X染色体示意图；基因及位置；着丝粒至端粒；遗传作图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 5"> 
图5：小鼠X染色体上包含Xic区域的概览。小鼠X染色体的示意图及所捕获3 Mb区域（ChrX: 102,475,000-105,475,000）的放大图。目标区域包含约800 kb的DNA，对应于X染色体失活中心（Xic），即X染色体失活（XCI）的主调控位点。Xic包含长链非编码基因Xist（XCI的关键因子）及其调控区域。Xist的正向调控因子以绿色表示，负向调控因子以紫色表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="染色质捕获：Hi-C，5C，基因组相互作用图谱，边界强度，绝缘评分" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：在3 Mb的捕获区域内进行Capture Hi-C、5C和Hi-C相互作用图谱分析。 (A) 小鼠3 Mb目标区域的Capture Hi-C相互作用图谱 Xic 在10 kb分辨率下（本研究）。(B同一目标区域的5C相互作用图谱 A 在6 kb分辨率下（数据由原始数据重新处理）47）。未包含在分析中的重复区域以白色遮蔽。5C 数据需要进行独立的生物信息学处理（参见47）在完成清洗和比对后，使用滑动中位数法（窗口大小 = 30 kb，步长 = 5）对引物分辨率下的5C图谱进行分箱处理，以达到最终6 kb的分辨率。C同一基因组区域的 Hi-C 相互作用图谱 A 和 B 在40 kb分辨率下（数据由……重新处理）64）。所有相互作用图谱均来自小鼠胚胎干细胞（mESCs）。绝缘分数使用cooltools计算，并以直方图表示，其中TAD边界的绝缘最小值清晰可见。TAD边界以下方的垂直线表示，每条线的高度反映边界的强度。基因为带箭头的线条，箭头方向指示转录方向。仅在Capture Hi-C图谱中检测到或定位更精确的亚TAD边界，分别用洋红色和蓝色箭头标记，对应于Tsix和Xist TAD内的亚TAD。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="染色质相互作用热图；捕获Hi-C、5C、示意图；边界强度，绝缘分数。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64166/64166fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：在捕获区域内1 Mb范围内的捕获Hi-C、5C和Hi-C相互作用图谱。（A）包含小鼠Xic的1 Mb基因组区域的5 kb分辨率捕获Hi-C相互作用图谱（本研究）。（B）与（A）相同基因组区域的6 kb分辨率5C相互作用图谱（数据来自文献47的重新处理）。分析中未包含的重复区域以白色遮蔽。需要注意的是，5C数据需要独立的生物信息学处理（参见文献47）。在完成数据清洗和比对后，以引物分辨率为基础，采用滑动中位数法（窗口大小=30 kb，步长=5）进行分箱，最终达到6 kb的分辨率。（C）与（A）和（B）相同基因组区域的20 kb分辨率Hi-C相互作用图谱（数据来自文献64的重新处理）。所有相互作用图谱均来源于小鼠胚胎干细胞（mESCs）。绝缘分数使用cooltools计算，并以直方图形式展示，TAD边界的绝缘最小值对应于直方图的谷值。TAD边界以下方的垂直线表示，每条线的高度反映边界强度。基因以指示转录方向的箭头表示。仅在捕获Hi-C中特异性检测到或定位更精确的染色质接触环，分别用洋红色和蓝色星号标注，对应于Tsix和Xist所在的TAD内的接触环。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/64166fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充表 1：本研究中所用数据集的测序后统计信息：染色质捕获 Hi-C（本研究）、Hi-C64 和 5C47。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64166/Supplementary%20Table%201-corrected.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了染色质捕获结合高通量测序（Capture Hi-C）方法，用于在高分辨率下表征数兆碱基大小的靶向基因组区域的三维结构，包括拓扑关联结构域（TADs）的边界以及调控元件与其他DNA序列元件之间的长程染色质相互作用。

通过捕获式 Hi-C 解析高分辨率 3D 染色质结构 via Capture Hi-C

基因组的空间组织在其功能和调控中具有重要作用，涉及转录、复制、重组等多个方面。

捕获型Hi-C技术能够以高分辨率解析数兆碱基大小的目标基因组区域的三维染色质结构。通过捕获型Hi-C，可在提高技术时间效率和成本效益的同时，实现更高的分辨率和等位基因特异性。将捕获型Hi-C应用于不同的模式系统、细胞类型以及健康和疾病状态下发育调控的染色质图谱，有望促进我们对基因组拓扑结构与基因调控之间相互作用的理解。首先，使用自动细胞计数仪对专门用于细胞计数的对照培养板中的细胞进行胰蛋白酶消化并计数。加入活率染色剂以确定活细胞所占百分比。根据此细胞计数结果，估算用于交联处理的培养板中细胞的总数。移除用于交联的培养板中的培养基，并替换为固定液。在摇床中室温下轻轻混匀，固定10分钟。通过加入2.5摩尔的甘氨酸PBS，使终浓度达到0.125摩尔，以淬灭固定反应。在10厘米培养皿中加入530微升2.5摩尔的甘氨酸PBS溶液，总体积为10毫升。室温下孵育5分钟，同时在摇床上轻轻混匀。将培养皿转移至冰上，继续在冰上孵育15分钟，期间在摇床上轻轻混匀。将固定液倒入烧杯中以快速处理，从细胞中移除固定液。用5毫升冰冷的0.125摩尔甘氨酸PBS迅速冲洗10厘米培养皿两次，以去除碎片和死细胞。将培养皿中的液体倒入烧杯中以快速处理。向10厘米培养皿中加入5毫升冰冷的0.125摩尔甘氨酸PBS缓冲液，迅速使用塑料细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下。用移液管将细胞悬液转移至预冷的50毫升锥形离心管中。用5毫升冰冷的0.125摩尔甘氨酸PBS缓冲液洗涤平板两次，将细胞悬液加入锥形离心管中。在4摄氏度下以480 ×g离心10分钟。使用台式抽吸系统吸除上清液。重悬细胞，并将500微升细胞悬液分装至计算所需数量的1.5毫升微量离心管中。在4°C条件下，以480 × g离心10分钟，收集细胞沉淀，并将干燥的细胞沉淀于-80°C保存。进行细胞裂解时，将冷冻的沉淀置于冰上解冻。在水中配制1.5毫升裂解缓冲液。加入600微升预冷的裂解缓冲液，冰上充分重悬。在4°C、2,655 G条件下离心5分钟，使用台式吸液系统弃去上清液。在100微升含0.5% SDS的溶液中重悬。在62摄氏度、1400转/分钟振荡孵育10分钟后，加入290微升水和50微升10% Triton X-100，充分混匀，避免产生气泡。在37摄氏度、1400转/分钟振荡孵育10分钟后，加入50微升10× DPN缓冲液，倒置离心管以混匀。取 50 µL 未消化的 DNA，放入单独的离心管中用于质量控制。切勿遗漏未消化的对照样品。对于 DPN2 消化，加入 10 µL 高浓度 DPN2，并通过倒置混匀。将样品和未消化的对照组在37摄氏度的温控混匀仪中孵育，以每分钟1400转的速度振荡，持续超过4小时。进行连接反应及交联逆转时，取50微升已连接的消化后DNA，置于单独的管中用于质量控制。将未消化和未连接的对照组样品储存在20摄氏度。加入 800 微升连接反应混合液。在 16 摄氏度下孵育，以每分钟 1000 转的速度旋转过夜。进行 DNA 纯化时，将样品置于冰上，转移至预冷的 15 毫升圆锥形离心管中，加入 2 毫升水、10.5 毫升冰乙醇和 583 微升 3 摩尔乙酸钠。向未消化和已连接的质控样本中加入 200 微升冰乙醇、10.8 微升乙酸钠以及 1 微升共沉淀剂。在 -80 摄氏度下孵育至少 4 小时，可长达过夜。在 4 摄氏度下以 2200 ×g 离心 15 毫升离心管 45 分钟。小心去除乙醇，并将样本和对照在室温下空气干燥 10 至 15 分钟。切勿过度干燥。分别用 100 µL 和 20 µL 水重悬样本和对照。为控制 3C 模板制备的质量，将每个样本及每个对照的 100 至 200 纳克样品上样至 1% 琼脂糖 1×TBE 胶中。随后进行目标片段富集以用于成对末端多重测序，取四微克 3C 模板，每轮捕获反应中将其重悬于 130 微升水中。对样品进行超声处理，并使用三微克剪切后的 DNA 继续后续制备步骤。为了将制备好的DNA样品与靶标特异性RNA探针进行杂交，使用3.4微升终体积中含有750纳克的DNA样品，使初始浓度达到每微升221纳克。如需调整至终体积3.4微升，可使用真空离心浓缩仪进行浓缩。对于重悬于10微升溶液中的样品，浓缩15至20分钟即可。 根据制造商的说明，在65摄氏度下孵育杂交混合物16至18小时，同时热盖温度设为105摄氏度。为捕获目标连接片段，将偶联有链霉亲和素的磁珠加入探针杂交后的样本中。最后，为进行多重测序，按照本研究中所用的目标富集系统说明书继续完成文库制备，用于成对末端及多重测序。Capture Hi-C 相互作用图谱的分辨率能够识别出 Tsix-tad 内包含 Tsix 位点启动子的两个较小结构域，而这一点此前使用 5C 技术未能实现。此外，其他亚 TAD 结构（如染色质接触环）在 Capture Hi-C 数据中也清晰可见，例如 Xist 与 FTX 之间的染色质环，此前已通过 Capture C 技术鉴定；以及 Xist 与 Xert 之间的染色质环，最近利用类似的 Capture Hi-C 实验方案被鉴定出来。由于Capture Hi-C图谱分辨率的提高，其他接触位点也可以更精确地被定位，例如在Tsix-tad区域内Linx、Chic1和Xite位点之间形成的已知接触热点。与所示的Hi-C数据相比，Capture Hi-C实现了四倍的分辨率提升，却仅需四分之一的测序深度。非常重要的一点是，切勿忘记取50 µL未消化且未连接的DNA样本，作为3C模板制备的质量控制。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

通过捕获Hi-C 破 译高分辨率3D染色质组织

Hi-C 方法能够无偏倚地在全基因组范围内鉴定染色质相互作用（1）。Hi-C...

Hi-C：一种研究基因组三维结构的方法

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP...

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一种研究方法 从头合成 染色质结构域的形成

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通过定量染色体构象捕获技术（4C）鉴定类胚体中的增强子-启动子相互作用

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通过电子断层扫描技术在超微结构保存的染色质中成像复制结构域

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Hi-C 3.0 是一种改进的 Hi-C 实验方案，结合使用甲醛和二琥珀酰亚胺基戊二酸酯交联剂，并采用 DpnII 和 DdeI...

跨尺度染色体构象捕获

本文介绍了一种利用全基因组染色体构象捕获方法Micro-C-XL，以核小体分辨率绘制三维基因组结构的实验方案。...

利用 Micro-C-XL 绘制哺乳动物三维基因组相互作用

本文详细介绍了染色体构象捕获（3C）技术的一种改进方法，重点强调本科生的参与和学习过程。...

通过3C获得A：面向本科生的染色体构象捕获技术

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一种用于在致密核环境中研究染色质的多标记单分子定位显微镜实验方案

本文介绍了一种用于捕获与RNA相关的染色质DNA-DNA相互作用的实验方案，以绘制RNA相关的三维基因组结构图谱。...

RNA相关染色质DNA-DNA相互作用方法

了解Capture Hi-C技术如何以高分辨率解析三维染色质组织结构，识别拓扑关联结构域和远程相互作用。该方法提高了分辨率与等位基因特异性，为研究基因调控机制提供了高效且经济的工具。

通过捕获式 Hi-C 解析高分辨率 3D 染色质结构 via Capture Hi-C

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