通过捕获式 Hi-C 解析高分辨率 3D 染色质结构 via Capture Hi-C

捕获型Hi-C技术能够以高分辨率解析数兆碱基大小的目标基因组区域的三维染色质结构。通过捕获型Hi-C，可在提高技术时间效率和成本效益的同时，实现更高的分辨率和等位基因特异性。将捕获型Hi-C应用于不同的模式系统、细胞类型以及健康和疾病状态下发育调控的染色质图谱，有望促进我们对基因组拓扑结构与基因调控之间相互作用的理解。

首先，使用自动细胞计数仪对专门用于细胞计数的对照培养板中的细胞进行胰蛋白酶消化并计数。加入活率染色剂以确定活细胞所占百分比。根据此细胞计数结果，估算用于交联处理的培养板中细胞的总数。

移除用于交联的培养板中的培养基，并替换为固定液。在摇床中室温下轻轻混匀，固定10分钟。通过加入2.5摩尔的甘氨酸PBS，使终浓度达到0.125摩尔，以淬灭固定反应。

在10厘米培养皿中加入530微升2.5摩尔的甘氨酸PBS溶液，总体积为10毫升。室温下孵育5分钟，同时在摇床上轻轻混匀。将培养皿转移至冰上，继续在冰上孵育15分钟，期间在摇床上轻轻混匀。

将固定液倒入烧杯中以快速处理，从细胞中移除固定液。用5毫升冰冷的0.125摩尔甘氨酸PBS迅速冲洗10厘米培养皿两次，以去除碎片和死细胞。将培养皿中的液体倒入烧杯中以快速处理。

向10厘米培养皿中加入5毫升冰冷的0.125摩尔甘氨酸PBS缓冲液，迅速使用塑料细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下。用移液管将细胞悬液转移至预冷的50毫升锥形离心管中。

用5毫升冰冷的0.125摩尔甘氨酸PBS缓冲液洗涤平板两次，将细胞悬液加入锥形离心管中。在4摄氏度下以480 ×g离心10分钟。使用台式抽吸系统吸除上清液。

重悬细胞，并将500微升细胞悬液分装至计算所需数量的1.5毫升微量离心管中。在4°C条件下，以480 × g离心10分钟，收集细胞沉淀，并将干燥的细胞沉淀于-80°C保存。进行细胞裂解时，将冷冻的沉淀置于冰上解冻。

在水中配制1.5毫升裂解缓冲液。加入600微升预冷的裂解缓冲液，冰上充分重悬。在4°C、2,655 G条件下离心5分钟，使用台式吸液系统弃去上清液。

在100微升含0.5% SDS的溶液中重悬。在62摄氏度、1400转/分钟振荡孵育10分钟后，加入290微升水和50微升10% Triton X-100，充分混匀，避免产生气泡。在37摄氏度、1400转/分钟振荡孵育10分钟后，加入50微升10× DPN缓冲液，倒置离心管以混匀。

取 50 µL 未消化的 DNA，放入单独的离心管中用于质量控制。切勿遗漏未消化的对照样品。对于 DPN2 消化，加入 10 µL 高浓度 DPN2，并通过倒置混匀。

将样品和未消化的对照组在37摄氏度的温控混匀仪中孵育，以每分钟1400转的速度振荡，持续超过4小时。进行连接反应及交联逆转时，取50微升已连接的消化后DNA，置于单独的管中用于质量控制。将未消化和未连接的对照组样品储存在20摄氏度。

加入 800 微升连接反应混合液。在 16 摄氏度下孵育，以每分钟 1000 转的速度旋转过夜。进行 DNA 纯化时，将样品置于冰上，转移至预冷的 15 毫升圆锥形离心管中，加入 2 毫升水、10.5 毫升冰乙醇和 583 微升 3 摩尔乙酸钠。

向未消化和已连接的质控样本中加入 200 微升冰乙醇、10.8 微升乙酸钠以及 1 微升共沉淀剂。在 -80 摄氏度下孵育至少 4 小时，可长达过夜。在 4 摄氏度下以 2200 ×g 离心 15 毫升离心管 45 分钟。

小心去除乙醇，并将样本和对照在室温下空气干燥 10 至 15 分钟。切勿过度干燥。分别用 100 µL 和 20 µL 水重悬样本和对照。

为控制 3C 模板制备的质量，将每个样本及每个对照的 100 至 200 纳克样品上样至 1% 琼脂糖 1×TBE 胶中。随后进行目标片段富集以用于成对末端多重测序，取四微克 3C 模板，每轮捕获反应中将其重悬于 130 微升水中。对样品进行超声处理，并使用三微克剪切后的 DNA 继续后续制备步骤。

为了将制备好的DNA样品与靶标特异性RNA探针进行杂交，使用3.4微升终体积中含有750纳克的DNA样品，使初始浓度达到每微升221纳克。如需调整至终体积3.4微升，可使用真空离心浓缩仪进行浓缩。对于重悬于10微升溶液中的样品，浓缩15至20分钟即可。

根据制造商的说明，在65摄氏度下孵育杂交混合物16至18小时，同时热盖温度设为105摄氏度。为捕获目标连接片段，将偶联有链霉亲和素的磁珠加入探针杂交后的样本中。最后，为进行多重测序，按照本研究中所用的目标富集系统说明书继续完成文库制备，用于成对末端及多重测序。

Capture Hi-C 相互作用图谱的分辨率能够识别出 Tsix-tad 内包含 Tsix 位点启动子的两个较小结构域，而这一点此前使用 5C 技术未能实现。此外，其他亚 TAD 结构（如染色质接触环）在 Capture Hi-C 数据中也清晰可见，例如 Xist 与 FTX 之间的染色质环，此前已通过 Capture C 技术鉴定；以及 Xist 与 Xert 之间的染色质环，最近利用类似的 Capture Hi-C 实验方案被鉴定出来。

由于Capture Hi-C图谱分辨率的提高，其他接触位点也可以更精确地被定位，例如在Tsix-tad区域内Linx、Chic1和Xite位点之间形成的已知接触热点。与所示的Hi-C数据相比，Capture Hi-C实现了四倍的分辨率提升，却仅需四分之一的测序深度。非常重要的一点是，切勿忘记取50 µL未消化且未连接的DNA样本，作为3C模板制备的质量控制。