Name: 创建膝关节芯片，用于关节疾病建模和药物测试 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: 了解利用人骨髓间充质干细胞构建膝关节芯片模型的方法，该微生理系统整合软骨、骨、脂肪垫和滑膜组织，用于骨关节炎药物测试并提高临床试验预测准确性。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究主要由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）资助（项目编号：UG3/UH3TR002136，UG3/UH3TR003090）。此外，我们感谢华盛顿大学的Paul Manner博士提供人体组织样本，以及Jian Tan博士在分离间充质干细胞和建立细胞库过程中提供的帮助。

以下方案遵循匹兹堡大学及匹兹堡大学人类研究伦理委员会的伦理准则。本研究中所用材料的信息列于材料表中。
1. 制造3D打印生物反应器
<ol>
	<li>使用计算机软件设计骨软骨（图 2A）和 miniJoint 生物反应器（图 2B），包括腔室、插件和盖子。各部件的尺寸信息见图 S1。</li>
	<li>将设计传输至 3D 打印机，使用光聚合物墨水进行打印。</li>
	<li>用 15 mL 95% 乙醇对 3D 打印的部件（图 2C–F）清洗三次，然后在手提式光固化装置中完全交联 200 秒。</li>
	<li>在插件和盖子上安装 O 型圈（图 2C、D），并测试各部件是否匹配（图 2G、H）。</li>
</ol>
<img alt="图 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64186/64186fig02.jpg" /> 
图 2：构建 miniJoint 生物反应器各部件的制备过程。 （A、B），用于构建（A）骨软骨和（B）miniJoint 芯片的生物反应器的 3D 模型。（C、D）3D 打印的（C）盖子和（D）&#160;已安装 O 型圈的插入件。（E、F）用于（E）骨软骨和（F）miniJoint 组织培养的 3D 打印腔室。（G、H）（G）骨软骨和（H）miniJoint 芯片的组装示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64186/64186fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
2. 构建组织组分
注意：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂（LAP）和甲基丙烯酰化明胶（GelMA）的制备过程在先前的研究中有描述8,9。
<ol>
	<li>制备 GelMA，请按以下步骤操作。
	<ol>
		<li>将 17 g B 型明胶加入 500 mL 蒸馏水中，然后在 37 °C 下振荡混合 30 分钟。</li>
		<li>随后加入 13 mL 甲基丙烯酸酐，重新置于 37 °C 振荡器中，持续振荡过夜。</li>
		<li>次日，将 GelMA 分装至多个透析袋中，每袋约 60 mL。</li>
		<li>将所有透析袋放入含磁力搅拌子的蒸馏水中，进行为期 7 天的透析。每日多次更换蒸馏水，并在过夜时将透析袋置于 4 °C 环境中。</li>
		<li>第 7 天，将 GelMA 在 −80 °C 下冷冻。完全冻结后，进行冻干处理。</li>
		<li>将 GelMA 置于冻干机真空室内的培养皿中，进行冷冻干燥。确保 GelMA 在从冻干机中取出前已完全干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将 GelMA 溶解于 Hank's 平衡盐溶液（含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 HBSS）中，配制成 15% (w/v) 溶液。为确保 pH 值为 7.4，逐滴加入 NaOH 并调节至 pH 7.4。根据所得体积，向溶液中添加 1× 抗生素-抗真菌剂和 0.15% (w/v) LAP。将 15% GelMA 溶液于 −20 °C 保存至使用，避光。</li>
	<li>将 3D 打印的双流生物反应器腔室、盖子和插件放入高压灭菌袋中，使用蒸汽在 121 °C 下高压灭菌 20 分钟，随后再用干热灭菌 20 分钟。</li>
	<li>在生物安全柜内，将生物反应器腔室、盖子和插件浸泡于 15 mL 无菌磷酸盐缓冲液中过夜，之后使其自然干燥。</li>
	<li>在获得机构审查委员会（IRB）批准后（匹兹堡大学和华盛顿大学），从全关节置换术的手术废弃物中分离人骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）。
	<ol>
		<li>具体操作为：冲洗股骨颈和股骨头松质骨中的骨髓，并将其重悬于 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中。</li>
		<li>将悬液通过 40 µm 滤网过滤，并将滤过液在 300 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用生长培养基 [DMEM、10% 胎牛血清（FBS）和 1× 抗生素-抗真菌剂] 重悬细胞沉淀，接种至组织培养瓶中。</li>
		<li>每 3 至 4 天更换一次培养基。确保细胞融合度达到 70% 至 80% 后再进行后续操作。</li>
		<li>用胰蛋白酶-EDTA 孵育 2–3 分钟使细胞脱落，按每 T150 培养瓶接种 100 万细胞的比例进行传代。</li>
		<li>将细胞扩增至第 5 代（P5）。胰酶消化后，重悬细胞，计数，并在 300 × g 条件下离心 5 分钟收集细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 1,000 µL 移液器，将细胞以 20 × 106 个细胞/mL 的密度重悬于 15% GelMA 溶液中。 
	注意：关闭生物安全柜的照明。</li>
	<li>佩戴无菌手套，将无菌干燥的硅胶模具压紧于培养皿上。然后用镊子将每个插件放入硅胶模具的孔中，确保插件的孔面朝下。</li>
	<li>使用 200 µL 移液器，向每个插件中加入细胞悬液（每个插件约 50 µL），直至填满。</li>
	<li>使用波长为 395 nm 的 UV 手电筒（LED 光源）照射凝胶/插件顶部 1.5 分钟，然后翻转照射另一面 30 秒。当 LAP 光引发剂暴露于紫外光时，发生交联反应。 
	注意：此期间可将细胞悬液置于培养箱中或避光保存。</li>
	<li>用无菌镊子立即将插件转移至非组织培养 6 孔板中，每孔加入 8 mL 生长培养基（DMEM 补充 10% [v/v] FBS 和 1× 抗生素-抗真菌剂），使细胞过夜恢复。</li>
	<li>将细胞向四个谱系方向诱导分化。
	<ol>
		<li>为构建脂肪组织（AT），将插件转移至含 8 mL 脂肪诱导培养基（AM；Alpha-MEM、10% FBS、0.2 mM 吲哚美辛、1× 胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS）、0.45 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，&#160;0.1 μM&#160;地塞米松和 1× 抗生素-抗真菌剂）的孔中以启动分化。理想情况下，将四个插件置于一个非组织培养孔板的单个孔中，加入 8 mL 脂肪诱导培养基。在孔板中培养 28 天，每隔一天更换一次培养基。</li>
		<li>为构建骨软骨单元（OC），将插件放入双流生物反应器腔室中，盖上盖子，并分别以 5 µL/min 的流速向两个通道灌注 35 mL 成骨培养基（OM；DMEM、10% FBS、1× 抗生素-抗真菌剂、0.1&#160;μM 地塞米松、0.01 M β-甘油磷酸钠、100 ng/mL 骨形态发生蛋白 7（BMP7）、50 µg/mL 抗坏血酸和 10 nM 维生素 D3）和 35 mL 软骨诱导培养基（CM；DMEM、1× 抗生素-抗真菌剂、1×&#160;ITS、0.1&#160;μM&#160;地塞米松、40 µg/mL 脯氨酸、50 µg/mL 抗坏血酸和 10 ng/mL 转化生长因子 β3）10。通过每两周更换一次培养基，维持细胞分化 28 天。</li>
		<li>为获得成纤维细胞，将 MSCs 在 T150 cm2 组织培养瓶中使用 20 mL 成纤维诱导培养基（FM；高级 DMEM、5% FBS、1× GlutaMAX、1× 抗生素-抗真菌剂和 50 µg/mL 抗坏血酸）进行 2D 培养，诱导 21 天。每周更换一次培养基。使用 4 mL 胰蛋白酶消化细胞，并按照上述方案将细胞包埋于插件中的 3D 凝胶内，以获得类似滑膜的纤维组织（SFT）。 
		注意：所有诱导培养基的组成详见 表 1。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 建立 miniJoint 芯片
<ol>
	<li>对3D miniJoint生物反应器腔室、内径为0.062英寸、外径为0.125英寸的硅胶管以及F 1/16鲁尔锁接头进行高压灭菌。将硅胶管一端连接至miniJoint生物反应器的插口，另一端连接鲁尔锁接头。</li>
	<li>准备步骤2.11中提到的AM、OM（去除BMP7）和FMCM。此外，准备用于miniJoint培养的共用培养基（SM；无酚红DMEM，1×抗生素-抗真菌剂，&#160;1×丙酮酸钠，1×ITS，40 µg/mL脯氨酸，50 µg/mL抗坏血酸，以及0.5 ng/mL转化生长因子β3）。将每种培养基各35 mL加入培养基储液罐中。</li>
	<li>使用直镊将骨软骨单元从双流生物反应器转移至miniJoint生物反应器的右侧孔中。将脂肪组织插入物和纤维组织插入物分别转移至左侧和中间孔中。用灭菌盖封闭所有孔。</li>
	<li>将miniJoint芯片的入口连接至培养基储液罐，出口连接至注射器（图3A-C）。</li>
	<li>将注射器安装到注射泵上（图3C），并将泵和芯片转移至培养箱中。培养基储液罐置于培养箱外的冰上保存。</li>
	<li>以退吸模式运行泵，将培养基从储液罐抽入miniJoint生物反应器腔室。该miniJoint培养过程持续28天。</li>
	<li>为模拟关节炎症和软骨退变，在成纤维培养基流中加入白细胞介素1β（IL-1β），终浓度为10 ng/mL。在IL-1β处理的第三天更换注射器，并向成纤维培养基中补充新鲜的IL-1β。处理持续7天。</li>
	<li>在药物测试阶段，IL-1β处理3天后，将药物加入共用培养基中，模拟药物在膝关节局部使用的“关节内给药”（图3D）；或将药物加入所有类型的培养基中，模拟通过循环系统作用于膝关节的“全身给药”（图3E）。</li>
	<li>无论样本是否接受了此前4天的药物处理，在IL-1β处理7天后收集各组织用于分析。</li>
</ol>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64186/64186fig03.jpg" /> 
图3：miniJoint的组装。 （A、B）组织特异性培养基从入口1-3（I1-3）引入，并从出口1-3（O1-3）流出。共享培养基从I4灌注至O4。（C）miniJoint培养的完整装置。药物（绿色类似太阳的形状）可选择性地加入（D）仅共享培养基中，或（E）所有培养基中，以分别模拟“关节内给药”或“系统性给药”。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64186/64186fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
4. 个体组织采集
<ol>
	<li>使用无菌弯镊取出插入物。</li>
	<li>用活检打孔器穿过插入物中心以取出凝胶，并将凝胶置于 PBS 中。</li>
	<li>在评估基因表达时，将骨软骨凝胶切成两半。 
	注意：由于骨软骨凝胶包含两种组织类型，因此必须分离成骨和成软骨细胞。</li>
	<li>收集条件培养基和组织用于各种实验。
	<ol>
		<li>从每个培养基来源收集约 1.5 mL。</li>
		<li>将条件培养基在 14,000 x g 条件下离心 10 分钟后弃去沉淀，再用液氮速冻。</li>
		<li>对于组织学染色和免疫染色，首先将 OC 和 SFT 样本置于 10% 缓冲福尔马林中固定，随后用梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，最后切成 6 µm 厚的切片。</li>
		<li>对于 AT 微组织，将样本用 10% 缓冲福尔马林固定后，直接用油红 O 溶液或 BODIPY 染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional+and+national+burden+of+osteoarthritis+1990-2017%3A+A+systematic+analysis+of+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).</li>
<li>Lawrence, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates+of+the+prevalence+of+arthritis+and+other+rheumatic+conditions+in+the+United+States%3A+Part+II%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II.</a> Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).</li>
<li>Makarczyk, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+models+for+development+of+disease-modifying+osteoarthritis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+osteoarthritis%3A+risk+factors%2C+regulatory+pathways+in+chondrocytes%2C+and+experimental+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models.</a> Biology. 9 (8), 194(2020).</li>
<li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-a-chip%3A+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li>
<li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells%3A+aging+and+tissue+engineering+applications+to+enhance+bone+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing.</a> Biomaterials. 203, 96-110 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cell-derived+miniature+joint+system+for+disease+modeling+and+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing.</a> Advanced Science. 9 (21), 2105909(2022).</li>
<li>Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+engineering+application+of+injectable+gelatin+hydrogel+with+in+situ+visible-light-activated+gelation+capability+in+both+air+and+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution.</a> Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2%2C4%2C6-trimethylbenzoylphosphinate%3A+polymerization+rate+and+cytocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li>
<li>Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+microphysiological+osteochondral+system+to+model+tissue+response+to+interleukin-1%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1β.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).</li>
<li>Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+macro-porous+titanium+ornamented+by+degradable+3D+gel%2FnHA+micro-scaffolds+for+bone+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575(2016).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteochondral+tissue+chip+derived+from+iPSCs%3A+Modeling+OA+pathologies+and+testing+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411(2019).</li>
<li>Atukorala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovitis+in+knee+osteoarthritis%3A+A+precursor+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).</li>
<li>Occhetta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphysiological+compression+of+articular+cartilage+induces+an+osteoarthritic+phenotype+in+a+cartilage-on-a-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).</li>
<li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+early+changes+associated+with+cartilage+trauma+using+human-cell-laden+hydrogel+cartilage+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models.</a> Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400(2022).</li>
<li>Elsissy, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+septic+arthritis+of+the+adult+native+knee+joint%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22JBJS+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review.</a> JBJS Reviews. 8 (1), 0059(2020).</li>
<li>Romero-Lopez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+effects+on+mesenchymal+stem+cell+osteogenesis+in+a+three-dimensional+in+vitro+bone+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

本文介绍了一种构建膝关节芯片系统的方案，该系统利用间充质干细胞（MSCs）在定制的生物反应器内形成骨、软骨、脂肪组织和类似滑膜的组织，并进行共培养。这种由多种人体细胞组成、具有即插即用特性的系统，为研究关节疾病的发病机制和药物开发提供了新工具。
鉴于不同组织倾向于特定的培养基，必须为每种组织提供相应的培养基，并防止各流路之间培养基的自由交换。特别是在构建双相骨软骨组织时，未分化间充质干细胞（MSCs）的分化命运取决于其所接触的培养基。在当前的设计中，我们采用明胶基水凝胶作为支架，该支架不仅为细胞生长提供模板，还可封闭组织与插入物壁之间可能存在的间隙。因此，至关重要的是 原位 在插入物内对凝胶进行光交联。此外，在成骨培养基和软骨诱导培养基中分别添加生长因子BMP7和TGFβ3。为了维持这些生长因子数天内的生物活性，新鲜培养基在加入芯片培养系统前必须置于培养箱外。因此，我们需要使用注射器从储液池中抽出培养基，而不是将培养基直接注入培养箱内的系统中。 
操作生物反应器时另一个关键点是避免产生不必要的压力。组织依靠与...

骨关节炎（OA）等关节疾病具有很高的发病率和致残性，是全球范围内导致残疾的主要原因之一1。据估计，仅在美国，OA 就影响了 2700 万名患者，在 60 岁及以上成年人中的发病率达到 12.1%2。遗憾的是，目前用于治疗关节疾病的大多数药物仅为对症治疗，尚无有效的疾病修饰性骨关节炎药物（DMOADs）可用3。这一未满足的医疗需求主要源于缺乏可用于研究疾病机制并开发潜在 DMOADs 的有效模型。传统的二维（2D）细胞培养无法反映关节组织的三维结构，而组织外植体培养常因细胞大量死亡而受阻，且通常难以重现组织间的动态相互作用4。此外，遗传和解剖学上的差异显著降低了动物模型的生理相关性4。
器官芯片（OoCs），或称微生理系统，是工程学、生物学与医学交叉领域中一个极具前景的研究方向。这些 体外 平台是最小的功能单元，可复制其明确的健康或病理特征 体内 对应物5此外，这些微型化系统能够容纳多种细胞和基质，并模拟不同组织之间的生物物理和生化相互作用。因此，一种能够真实再现天然滑膜关节的微生理系统有望为关节疾病建模及潜在的疾病修饰性骨关节炎药物（DMOADs）的开发提供有效的平台。
间充质干细胞（MSCs）可从人体多种组织中分离获得，并可分化为成骨、软骨和脂肪谱系6。MSCs 已成功用于工程化构建多种组织，包括骨、软骨和脂肪组织6，因此表明其是构建膝关节组织成分的一种极具前景的细胞来源。我们近期开发了一种模拟关节功能的微型微生理系统，称为 miniJoint，该系统包含由 MSCs 分化而来的骨、软骨、纤维和脂肪组织7。特别是，这一新型设计可通过微流控流动或渗透实现组织间的相互作用（图 1）。本文中，我们展示了芯片组件的制备、组织成分的构建、工程化组织在芯片中的培养，以及组织样本的收集以用于后续分析的完整实验方案。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64186/64186fig01.jpg" /> 
图1：miniJoint芯片示意图，显示不同组织组分及培养基流动的排列方式。 OC = 骨软骨组织。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64186/64186fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>I17018-1G</td><td></td></tr><tr><td>6 孔非组织培养板</td><td>Corning Falcon&amp;reg; Plates</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>24 孔非组织培养板</td><td>Corning Falcon&amp;reg; Plates</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>30 mL 注射器</td><td>BD Syringe Luer Lock Cascade Health</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>阿辛蓝染色液</td><td>EK Industries</td><td>1198</td><td>1% w/v，pH 1.0</td></tr><tr><td>高级 DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Gibco</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器</td><td>Integra Miltex</td><td>12-460-407</td><td></td></tr><tr><td>BODIPY&amp;reg; 荧光染料</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>骨形态发生蛋白 7 (BMP7)</td><td>Peprotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Fisher Brand</td><td>16100110</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium）</td></tr><tr><td>地塞米松</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>02-05-2002</td><td></td></tr><tr><td>E-Shell 450 光敏聚合物</td><td>EnvisionTec</td><td>RES-01-4022</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini-Bio Products</td><td>900-208</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>3505-061</td><td></td></tr><tr><td>牛皮来源明胶</td><td>Hyclone</td><td>1003372809</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>吲哚美辛</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>I7378-56</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS）</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>白细胞介素 1&amp;beta;</td><td>Peprotech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔锁接头</td><td>Cole-Parmer Instruments</td><td>45508-50</td><td></td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>115388-93-7</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-甘油磷酸钠</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>1003129352</td><td></td></tr><tr><td>培养基袋</td><td>KiYATEC</td><td>FC045</td><td></td></tr><tr><td>甲基丙烯酸酐</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>102378580</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>尖头镊子</td><td>Fisher Brand</td><td>12000122</td><td></td></tr><tr><td>硅胶模具</td><td>McMaster-Carr</td><td>RC00114P</td><td></td></tr><tr><td>硅胶 O 型圈</td><td>McMaster-Carr</td><td>ZMCCs1X5</td><td>1 mm × 5 mm</td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault Syst&amp;egrave;mes SE, V&amp;eacute;lizy-Villacoublay, France</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Integra Miltex</td><td>4-122</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Lagato210P, KD Scientific</td><td>Z569631</td><td>10 个注射器架</td></tr><tr><td>T-182 组织培养瓶</td><td>Fisher Brand</td><td>FB012939</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿 150 mm</td><td>Fisher Brand</td><td>FB012925</td><td></td></tr><tr><td>转化生长因子 β (TGF-&amp;beta;3)</td><td>Peprotech</td><td>100-36E</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>紫外手电筒</td><td>KBS</td><td>KB70109</td><td>395 nm</td></tr><tr><td>Vida 桌面 3D 打印机</td><td>EnvisionTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>维生素 D3</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>32222-06-3</td><td>1,25-二羟基维生素 D3</td></tr></tbody></table>

创建用于模拟关节疾病与药物测试的膝关节芯片模型

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

骨关节炎（OA）等致残性关节疾病高发，带来了沉重的社会经济负担。目前针对关节疾病的可用药物大多仅为对症治疗。由于缺乏用于研究疾病机制和筛选潜在疾病修饰性骨关节炎药物（DMOADs）的合适模型，导致临床上对有效的DMOADs存在未被满足的需求。本文描述了一种微型滑膜关节模拟微生理系统（miniJoint）的建立，该系统包含由人源间充质干细胞（MSCs）衍生的脂肪、纤维和骨软骨组织组分。为获得三维（3D）微组织，MSCs在分化前或分化后被包埋于可光交联的甲基丙烯酰化明胶中。随后将含细胞的组织构建物集成至3D打印的生物反应器中，形成miniJoint。通过分别灌注成骨、成纤维和成脂培养基以维持各组织表型。同时，采用共用培养基流经软骨、滑膜和脂肪组织，实现组织间的相互作用。该灌注模式可对一个或多个组织组分施加干预，用于机制研究。此外，还可用于潜在DMOADs的测试。 通过 或者 &#34;全身给药&#34; 通过所有培养基流 &#34;关节内给药&#34; 通过仅将药物添加到共用部分 &#34;滑膜液&#34;-模拟流动。因此，miniJoint 可作为一种多功能装置 体外 用于高效研究疾病机制和在个性化医疗中进行药物测试的平台。

收集微型关节（miniJoint）中所有组织，以分析其在微型关节中培养28天后的表型（图4A）。相关内容已在我们之前的出版物中详细描述7。
通过RT-qPCR、免疫染色和组织学染色，证实了各微组织中组织特异性表型均得到了良好维持图4例如，骨软骨微组织中的骨性组分（OC-O），而非其他组织组分，高表达骨钙素（osteocalcin）OCN）。相比之下，在骨软骨组织的软骨部分（OC-C）中，II型胶原蛋白（COL2) 和聚集蛋白聚糖（aggrecan）ACAN) 的表达水平显著高于其他组织图4B）。脂联素表达水平（ADIPOQ）和瘦素（leptin）LEP），两个典型的脂肪生成基因，在脂肪组织（AT）中的表达远高于其他组织。钙盐的沉积（<strong class="xfig...

我们提供了从人源间充质干细胞生成四种组织的详细方法，这些组织用于模拟人类膝关节中的软骨、骨、脂肪垫和滑膜。这四种组织被整合到一个定制的生物反应器中，并通过微流控系统相互连接，从而构建出膝关节芯片。

骨关节炎（OA）等致残性关节疾病的高度流行带来了沉重的社会经济负担。目前，针对……的可用药物

由于缺乏与生理情况相关的临床前模型，目前在临床试验中准确预测人类对药物反应的能力十分有限。该微生理系统可解决这一差距。这种源自人体细胞的系统能够准确模拟人类膝关节骨关节炎的整体疾病特征，从而可在临床试验前对治疗骨关节炎的疾病修饰类药物进行测试，有望节省数百万美元。通过将17克B型明胶加入500毫升蒸馏水中开始制备甲基丙烯酰化明胶（GelMA）。在37摄氏度摇床中混合30分钟，然后加入13毫升甲基丙烯酸酐，并在摇床上过夜混合。次日，将GelMA分装至透析袋中，每份约60毫升。将所有透析袋放入含有搅拌子的蒸馏水中，4 摄氏度下透析七天。每天多次更换蒸馏水，并在过夜时保持透析袋处于 4 摄氏度环境中。第七天，将 GelMA 倒入培养皿中，于 -80 摄氏度冷冻，随后进行冻干。然后，将 GelMA 置于冻干机的真空室中进行冻干。在从冻干机中取出前，确保其完全干燥。接着，将冻干后的 GelMA 溶解于 Hanks' 平衡盐溶液中，浓度为 15%，并使用少量氢氧化钠调节 pH 至 7.4。根据所获得的体积，向溶液中添加抗生素-抗真菌剂和0.15%苯基磷酸锂，或LAP。避光保存GelMA溶液，并于-20摄氏度储存至后续使用。将3D打印的双流生物反应器腔室、盖子和插入件装入灭菌袋中，于121摄氏度蒸汽条件下高压灭菌20分钟。然后，用干热处理20分钟。灭菌后，在生物安全柜内将生物反应器腔室、盖子和插入物浸泡在15毫升无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中过夜，随后完全干燥。使用1000微升移液器，将每毫升含20 × 10⁶个人类骨髓来源的间充质干细胞（MSCs）的细胞重悬于15% GelMA溶液中，吹打混匀20次。然后，使用无菌手套将一个无菌、干燥的硅胶模具压在培养皿上。用镊子将一个插入物放入硅胶模具的每个孔中，插入物的孔面朝下。完成后，使用200微升移液器向每个插入物中加入约50微升细胞悬液。将凝胶插入物的顶部暴露于395纳米波长的紫外手电筒照射1.5分钟，然后另一侧照射30秒，以实现凝胶在插入物内的交联。使用无菌镊子立即将插入物转移至非组织培养六孔板中含8毫升生长培养基的孔内，让细胞过夜恢复。为启动脂肪组织分化，将插入物转移至含8毫升成脂诱导培养基的孔中，每日更换培养基，培养28天。为了构建骨软骨单元，将插入物放入双流生物反应器腔室中，盖上孔盖，并分别以每分钟5 µL的流速向其中灌注35 mL成骨培养基和35 mL软骨诱导培养基。通过每两周更换一次相应类型的培养基，维持细胞分化培养28天。为了获得成纤维细胞，将MSCs在含有20 mL成纤维诱导培养基的T150 cm²组织培养瓶中进行二维培养，持续21天。每周定期更换培养基。21天后，使用4毫升胰蛋白酶消化以分离细胞。将3D凝胶包埋于插入物内。为了获得类似滑膜的纤维组织（SFT），请遵循类似的方案。将内径为0.062英寸、外径为0.125英寸的硅胶管一端连接至微型关节生物反应器杆，另一端连接F 1/16英寸鲁尔锁接头。然后，将3D微型关节生物反应器连同硅胶管和盖子一起进行高压灭菌。将35毫升用于迷你关节培养的培养基制备并加入培养基储液槽中。使用直镊子将骨软骨单元从双流生物反应器转移至迷你关节生物反应器的右侧孔中。在用无菌盖板盖住所有孔之前，将脂肪组织插入物和纤维组织插入物分别转移至左侧和中间孔中。将迷你连接夹的入口端连接至培养基储液池，出口端连接至注射器。然后将注射器安装到注射泵上。将注射泵和芯片转移至培养箱中。将培养基储液器置于培养箱外的冰上。将泵设置为抽取模式，将培养基从储液器抽入微型关节生物反应器腔室中。继续此微型关节培养过程28天。为了模拟关节炎症和软骨退化，将白细胞介素-1β以每毫升10纳克的浓度加入成纤维性培养基中，持续处理7天。在第3天更换新鲜的白细胞介素-1β时，务必更换移液器吸头。在药物测试中，经过3天的白细胞介素-1β处理后，可将药物加入共用培养基中，以模拟关节内给药；或者将药物加入所有类型的培养基中，以模拟全身性给药。经过七天的白细胞介素-1β处理后，收集各个组织用于分析。使用无菌镊子移除插入物后，将活检打孔器穿过插入物中心以取出凝胶，并将凝胶置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。接下来，在检测基因表达的同时，将骨软骨凝胶切成两半。从每种培养基来源收集约1.5毫升培养液，在14,000 G条件下离心10分钟。弃去沉淀后，将条件培养基在液氮中迅速冷冻。对于组织学染色和免疫染色，首先将骨软骨及类滑膜纤维组织（SFT）样本用10%缓冲福尔马林固定，然后用浓度递增的乙醇进行脱水。用二甲苯清除样品，将其包埋于石蜡中，最后将样品切成六微米厚度的切片。对于脂肪组织，可直接用油红O溶液或BODIPY对10%缓冲福尔马林固定的样品进行染色。各个微组织的组织特异性表型均得到了良好维持。培养28天后，收集了迷你关节的所有组织以分析其表型。骨软骨单元微组织的骨性部分高表达骨钙素。在骨软骨的软骨部分，组织显著高表达II型胶原和聚集蛋白聚糖。代表性脂肪生成基因、脂联素和瘦素在脂肪组织中的表达水平较高。钙盐沉积、碱性磷酸酶以及骨钙素蛋白主要见于骨软骨微组织的骨部。骨软骨组织的软骨侧显示出良好保留的糖胺聚糖和II型胶原。培养28天后，与软骨细胞肥大相关的标志物——II型胶原和印度刺猬蛋白的表达显著下调。在脂肪组织中发现大量脂滴沉积。免疫荧光染色显示，培养四周后SFT表现出强烈的润滑素和钙黏蛋白11表达。在疾病模型中，IL-1β 处理导致 SFT 中细胞凋亡以及 MMP-13 水平升高。IL-1β 处理引起软骨降解，提示骨软骨组织与 SFT 之间存在串话。通过全身给药的萘普生治疗在 IL-1β 微关节中显示出减轻软骨降解的治疗效果。实时PCR结果表明，四种潜在的骨关节炎疾病修饰药物部分逆转了软骨丢失。该实验最关键的步骤包括在插入物中对凝胶进行交联，以及将插入物放置到生物反应器中。该芯片可用于研究骨关节炎中其他风险因素的作用，例如肥胖和机械性损伤。它也可用于研究其他关节疾病。

creation-knee-joint-on-chip-for-modeling-joint-diseases-testing

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

创建膝关节芯片，用于关节疾病建模和药物测试

介绍了一种在高水平滑液环境中培养人关节软骨细胞的三维体系。滑液最能反映关节软骨的天然微环境，且易于获取和保存。因此，该体系可用于研究软骨再生以及筛选治疗关节炎的药物。...

一种用于在滑液中培养人关节软骨细胞的三维培养系统

着地过程中，下肢骨骼会承受较大的机械载荷并发生变形。测量骨骼变形对于深入理解与冲击相关的骨应力性损伤机制至关重要。本研究采用一种新颖的方法，结合个体特异性肌肉骨骼建模与有限元分析，用于测量动态运动过程中胫骨的应变。...

用于研究动态运动中骨应变的特定受试者肌肉骨骼模型

一种非侵入性建立大鼠膝关节内关节软骨损伤模型的方法

通过全膝关节置换术从患者体内获取的原代组织为骨关节炎研究提供了具有最高临床可转化性的实验模型。本方案描述了如何识别、处理并从七种独特的膝关节组织中分离RNA，以支持人类骨关节炎的机制性研究。...

人骨关节炎膝关节组织采集与RNA提取

本实验方案描述了一种摩擦测试装置，该装置可对两个接触的生物对偶表面同时施加往复滑动和法向载荷。...

用于研究滑膜关节生物力学、力学生物学及物理调控的摩擦测试-生物反应装置

本方案通过在大鼠股骨滑车沟处钻孔，建立全层软骨缺损（FTCD）模型，并检测随后的疼痛行为及组织病理学变化。...

全层软骨缺损大鼠模型的建立与评价

本文介绍了一种在绵羊膝关节中制备可控性骨软骨缺损的整合性实验方案，旨在建立适用于骨与软骨组织再生研究的实验模型。该方案详细阐述了在股骨髁上诱导全层骨软骨缺损的方法，采用的技术可最大限度减少对动物福利的影响，并降低实验结果的变异性。...

建立与评估一种全层骨软骨缺损的绵羊模型

一种使用关节滑膜炎的临床前模型 离体 具有保留功能与结构的人类滑膜组织

已开发出一种通用的等离子体光刻技术，可用于生成稳定的表面图案，以引导细胞附着。该技术可用于构建细胞网络，包括模拟天然组织的细胞网络，并已应用于研究多种不同类型的细胞。...

等离子体光刻表面图案化用于构建细胞网络

一种在具有微血管尺寸通道的微流控装置整个内部三维表面培养内皮细胞单层的方法&lt;30 μm）被描述。 这一 体外...

用于研究血液系统疾病中微血管相互作用的内皮化微流控技术

了解利用人骨髓间充质干细胞构建膝关节芯片模型的方法，该微生理系统整合软骨、骨、脂肪垫和滑膜组织，用于骨关节炎药物测试并提高临床试验预测准确性。

创建用于模拟关节疾病与药物测试的膝关节芯片模型

探索更多视频