体内 使用大颅窗的小鼠宽场和双光子钙成像

本协议描述了使用食品包装，透明硅胶和盖玻片制作大型（6 x 3 mm²）颅窗。该颅窗允许在同一只小鼠中进行 体内 宽场和双光子钙成像实验。

该协议显示了大颅窗的创建，以在同一只小鼠中测量宽场和单细胞保留活动。使用我们的方法，可以用食品包装以低成本制作大而稳定的颅窗。该方法可有效研究宏观和微观水平上行为过程中的神经和神经胶质活动。

建议从一个小颅窗开始。然后，如果成功，请增加窗口的大小。首先用牙钻去除颅骨上多余的水泥。

用笔标记要切割的区域。使用带有钝尖的手术刀切入骨头，以确保尖端不会穿透颅骨。用手术刀反复刮擦骨头以加深凹槽，直到要修剪的区域的骨头在轻轻触摸时移动。

用细镊子去除切开的骨头。小心不要将骨瓣推入大脑，这可能会损害大脑。要去除硬脑膜，请使用拉式玻璃移液管切割硬脑膜，锥形尖端约为 10 微米。

使用 U 形针将此切口扩展到整个窗口。在设置为60至100倍变焦的体视显微镜下，用超细镊子去除切断的硬脑膜。如果出血，用aCSF冲洗或使用明胶海绵止血。

然后，通过高压灭菌并用70%乙醇对一大块PVDC包装进行灭菌。在体视显微镜下，使用镊子和手术刀切出所需尺寸的包裹。将包裹放在大脑表面，同时将aCSF留在表面上。

从包裹的边缘吸出aCSF，让包裹牢固地粘在大脑表面。用手术刀和镊子修剪包裹物，使颅窗边缘和包裹物之间有大约一毫米的余量。包裹到位后，用生物粘合剂将包裹的边缘粘在头骨上。

让粘合剂干燥约 30 分钟。使用带有混合尖端的分配器，在包装顶部涂上透明的有机硅弹性体。将厚度为 0.12 至 0.17 毫米的盖玻片放在顶部。

用防水膜、强力胶或牙科水泥密封盖板玻璃的周边。首先，在一个小样品管中以一比四的比例混合丝心蛋白和AAV溶液。将溶液的等分试样滴在颅窗的保鲜膜上，干燥至少三个小时。

然后将包裹膜连接到大脑表面，如上一节所示。定期检查小鼠和窗户的状况，两到四周。此时，在创建AAV处理窗口后，基因编码的钙指示剂将充分表达。

使用该协议，10只小鼠中的8只可以维持颅窗长达10周。在表达星形胶质细胞中膜锚定的遗传编码钙指示剂的转基因小鼠中，用保鲜膜、透明硅胶和盖玻片创建一个宽窗口。通过该窗口进行宽场钙成像，当对侧晶须施加气吹刺激时观察到荧光变化。

躯体感觉皮层荧光变化的时间过程显示皮质活动。双光子成像允许观察神经胶质细胞特异性的单细胞荧光图像。在不同皮质区域的单个细胞中观察到由感觉刺激诱导的荧光变化。

用表达基因编码钙指示剂的AAV编码包裹，丝心蛋白用于制作颅窗。宽视野钙成像显示，皮质活动在手术后两到四周由感觉刺激诱导到皮层中传播。由于窗口很大，对同一只小鼠的不同皮质区域进行成像，并在单个细胞中观察到由感觉刺激引起的荧光变化。

制作颅窗时避免对大脑造成损害很重要。人们可以在具有大颅窗的小鼠身上执行行为任务。这将允许检查神经活动与小鼠行为之间的关系。

这种方法可以应用于各种神经科学研究。例如，它可用于观察决策任务、运动运行以及脑损伤和疾病的大规模模型期间的皮质活动。