Name: 体内 使用大颅窗的小鼠宽场和双光子钙成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: 学习使用保鲜膜、透明硅胶和盖玻片制作小鼠大颅窗技术，实现宽场和双光子钙成像。该方法可长期稳定观察神经元和胶质细胞活动，适用于行为神经科学研究。

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本工作获得了以下资助：变革性研究领域（A）“胶质细胞解码”基金（JP21H05621，授予 SM）、日本学术振兴会科学研究费补助金（JP19K06883，授予 SM；15KK0340，授予 ES；JP22H00432、JP22H05160、JP17H06312，授予 HB；JP17H06313，授予 KK）、脑部疾病研究用综合神经技术实现脑图谱绘制项目（Brain/MINDS）基金（JP19dm0207079h0002，授予 SM；JP19dm0207079，授予 HB；JP19dm0207080，授予 KK）、成茂神经科学研究基金会（授予 SM）、山梨县青年研究人员基金（授予 SM）、武田科学基金会（授予 SM），以及山梨大学前沿脑科学研究基金的部分支持。
我们感谢 N. Yaguchi 和 K. Okazaki 在动物饲养和技术支持方面的帮助，以及清水实验室成员提供的有益讨论。

实验程序已获山梨大学动物实验委员会批准。本研究使用了野生型（C57BL/6J，Japan SLC）小鼠以及星形胶质细胞中表达膜锚定型GECI（Lck-GCaMP6f）的转基因小鼠。转基因小鼠通过杂交AldH1l1-CreERT2小鼠[B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J，商业购得，参见材料表]与Flx-Lck-GCaMP6f小鼠[C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor&#60;tm1(CAG-GCaMP6f)Khak&#62;/J，商业购得]获得。转基因小鼠接受他莫昔芬（20 mg/mL）处理，连续5天（0.05 mL/10 g体重，腹腔注射），以诱导GCaMP6f表达。所有使用的小鼠均为至少4周龄的雄性与雌性小鼠。窗口结构示意图见图1A，手术流程总结于图1B。
1. 颅窗手术的准备工作
<ol>
	<li>使用异氟烷麻醉小鼠（诱导：3%，手术维持：1%-1.5%，流速：0.2-0.3 L/min）。通过尾部或脚趾夹捏反射消失确认麻醉深度。使用加热垫维持小鼠体温（36-38 °C）。用棉签涂抹眼膏，防止小鼠在麻醉期间眼睛干涩。</li>
	<li>腹腔注射15%甘露醇溶液（参见材料表）（3 mL/100 g体重）。将小鼠头部固定在立体定位仪上，使用耳杆固定。使用剃毛器和脱毛膏去除小鼠头部毛发。</li>
	<li>用聚维酮碘和酒精对皮肤表面消毒三次。&#160;局部涂抹利多卡因以实现预先镇痛。使用手术剪去除目标区域的皮肤，暴露颅骨（大小：15 x 15 mm）。如有出血，使用棉签止血。 
	注：本研究中，去除皮肤以观察从前额叶皮层至视觉皮层的区域。</li>
	<li>使用微型刮匙去除暴露颅骨上的骨膜，并将颅骨表面干燥，以便使用牙科水泥（参见材料表）将头固定板牢固地粘附于颅骨上（图2B）。 
	注：定制的头固定板使用3D打印机制造。设计文件已存入Github仓库（https://github.com/Satoshi-Manita/Head-plates）。</li>
	<li>使用牙科水泥固定头固定板（图2C）。等待至少20分钟，使水泥完全硬化。使用头固定板支架将头固定板固定35。</li>
</ol>
2. 制作颅窗
<ol>
	<li>使用牙科钻头去除颅骨上多余的水泥（参见 材料表）。钻孔时需小心，避免穿透骨骼而损伤脑组织。</li>
	<li>用记号笔标记需切割的区域，然后使用手术刀在骨头上进行切割。将手术刀尖端钝化，以确保刀尖不会穿透颅骨。补充图1参照脑图谱确定开窗位置。 
	注意：本研究在前后轴向上从bregma点起-2 mm至+4 mm、在内外侧轴向上从矢状缝至+3 mm范围内开窗，涵盖运动皮层、体感皮层和视觉皮层。</li>
	<li>用手术刀反复刮擦骨骼，加深沟槽，直至待修剪区域的骨骼在轻微触碰时能够灵活移动。</li>
	<li>用精细镊子移除切下的骨瓣。切勿将骨瓣推入脑组织，以免损伤脑部。图1Ba). 
	注意：如果在去除骨组织后观察到出血，应立即应用并吸除人工脑脊液（ACSF，参见 材料表）并重复此过程直至出血停止。或者，将浸有ACSF的止血明胶海绵（约3 mm见方的立方体）置于出血部位。</li>
	<li>如果未去除硬脑膜，则继续进行步骤 2.7。</li>
	<li>按照以下步骤去除硬脑膜。
	<ol>
		<li>在以下情况下，例如使用丝素蛋白-AAV薄膜法进行转染时，需去除硬脑膜36 并观察树突棘等微小结构。</li>
		<li>使用拉制的玻璃移液管（尖端锥度约10 µm）切开硬脑膜。为将切口扩展至整个窗口区域，使用U形针。</li>
		<li>将体视显微镜的变倍调至60-100倍，用超细镊子去除切断的硬脑膜。若去除硬脑膜引起出血，可用人工脑脊液（ACSF）冲洗，或使用明胶海绵止血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剪下PVDC包装膜。
	<ol>
		<li>对一块较大的PVDC包装膜（例如10 × 15 mm，厚度约11 μm，参见 材料表, 图2Aa通过高压灭菌和70%乙醇进行消毒。</li>
		<li>在体视显微镜下，使用镊子和手术刀切割出所需大小的包裹材料。 
		注意：包裹物的尺寸应比颅窗尺寸大约10 mm，但小于头板开口的尺寸。对于6 x 3 mm的颅窗2 颅窗，制备一个15 x 10 mm的2 包裹</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤准确放置包扎材料。
	<ol>
		<li>将包裹物置于脑表面，保留表面的ACSF。从包裹物边缘吸除ACSF，使包裹物牢固贴附于脑表面。图1Bb，c). 
		注意：所使用的包埋膜具有抗皱特性，因此只需将其放置在脑表面，几乎不会产生皱褶。</li>
		<li>使用手术刀和镊子修剪包裹物，使颅窗边缘与包裹物之间留出约1 mm的边缘图1Bd).</li>
		<li>一旦包埋膜就位，使用生物粘合剂将包埋膜边缘粘附到颅骨上（参见 材料表, 图 2D）。让粘合剂干燥约30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>涂抹透明硅胶弹性体。
	<ol>
		<li>使用市售透明硅胶弹性体（参见 材料表）置于包裹层上方，使用带混合尖端的分配器（图1Be，2Ab-d）并将盖玻片（厚度 0.12–0.17 mm）置于其上（图 2E).</li>
		<li>用防水膜、超级胶水或牙科水泥密封盖玻片的边缘图1Bf).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>手术后，需监测小鼠直至其恢复意识并保持胸卧位。之后，将小鼠单独饲养，置于原饲养笼中至少恢复7天。
	<ol>
		<li>为减轻应激和疼痛，给予抗炎和镇痛药物（例如地塞米松和酮洛芬，每种5 mg/kg，腹腔注射）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定期监测小鼠的感染情况。若确认感染，需在饮水中添加抗菌药物（例如10%恩诺沙星，1.7 µL/mL），持续给药直至感染消除（通常少于4周）。</li>
</ol>
3. 使用丝素蛋白溶液在塑料薄膜上制备AAV薄膜
注意：步骤 3 为可选步骤。
<ol>
	<li>按照先前发表的方法37，从家蚕茧中制备丝素蛋白溶液。
	<ol>
		<li>简言之，将市售的普通家蚕茧（5 g，参见材料表）在碳酸钠溶液（0.02 M，2 L）中煮沸。用超纯水清洗蚕茧，并在室温下干燥过夜。</li>
		<li>将干燥后的蚕茧溶于溴化锂溶液（9.3 M，20% w/v 丝素蛋白）中，在60 °C烘箱中加热4小时。对溶解后的蚕茧溶液进行透析，离心（在4 °C下以12,700 × g 离心两次，每次20分钟）37，并收集上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤制备丝素蛋白-AAV薄膜。
	<ol>
		<li>使用微量移液器，在小样品管中按1:4的比例混合丝素蛋白溶液和AAV溶液20。取一定体积的混合丝素蛋白-AAV溶液滴加到用于颅窗的塑料膜上，并干燥至少3小时。 
		注意：若需在直径为3 mm的区域内表达，应使用5 µL的丝素蛋白-AAV溶液滴。该比例决定了给定面积所需的溶液量。</li>
		<li>干燥后，将塑料膜裁剪至所需尺寸（例如10 × 15 mm），并将其放置于脑表面。随后，从步骤2.8.1开始继续执行上述方法。 
		注意：在将薄膜放置于脑表面之前，应尽可能去除脑表面的ACSF。因为ACSF可能会溶解丝素蛋白-AAV薄膜，从而降低AAV颗粒的浓度。</li>
		<li>在完成AAV处理的颅窗制备后，等待约2至4周，直至GECI蛋白充分表达。在此期间，应定期检查小鼠及颅窗的状态。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 钙成像与分析
注意：有关成像和分析的详细信息，请参见先前发表的报告1,2,38。
<ol>
	<li>按照以下步骤进行宽场成像。
	<ol>
		<li>使用头部固定装置在串联透镜荧光宏观显微镜下固定小鼠（参见材料表）。</li>
		<li>通过激发滤光片、二向色镜和物镜，使用465 nm LED光源发出的激发光照射小鼠的大脑皮层。</li>
		<li>通过物镜（1.0倍）、二向色镜、发射滤光片和成像镜头（2.0倍）由CCD相机采集大脑皮层的荧光图像。这些镜头的组合可实现约0.5倍的总放大倍数。</li>
		<li>以50 Hz的采样频率采集图像。数据采集完成后，使用ImageJ软件分析图像。手动选择感兴趣区域（ROI）。计算每个ROI的荧光变化ΔF/F = (Ft - F0) / F0，其中Ft为每帧的原始荧光值，F0为所有帧平均图像得到的平均荧光值。 
		注：用于从钙成像数据计算ΔF/F图像的ImageJ宏程序已存放在GitHub（https://github.com/Satoshi-Manita/ImageJ-macro）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤进行双光子成像。
	<ol>
		<li>使用头部固定装置将小鼠固定在双光子显微镜下。使用低倍率（5倍）物镜在明场模式下通过显微镜确定待成像区域。</li>
		<li>切换至双光子成像模式。使用高倍率物镜（16倍或25倍），并开启双光子激发激光。 
		注：绿色Lck-GCaMP6f22和红色XCaMP-R36分别使用超快激光在920 nm和1070 nm的激发波长下进行激发。</li>
		<li>以30 Hz频率采集荧光图像。数据采集完成后，使用suite2p软件39的配准功能校正运动伪影。采用与宽场成像相同的方法从图像中获取ROI及ΔF/F值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用Python及以下库绘制数据：NumPy、Matplotlib和Pandas（参见材料表）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种使用聚偏二氯乙烯（PVDC）塑料薄膜、透明硅胶和盖玻片制备大颅窗的低成本方法。利用该方法，我们实现了在大脑皮层较大区域上的宽场钙成像。在同一小鼠上完成宽场成像后，还可对其进行双光子钙成像，以观察多个不同的皮层区域。此外，已有研究表明，在用于颅窗的塑料薄膜上制备丝素蛋白-AAV薄膜，可在皮层较大区域内表达基因编码钙指示剂（GECI）。
关键步骤 
使用塑料膜制作颅窗时，必须避免感染和脑组织损伤。若发生感染或损伤，则无法观察神经元和胶质细胞的活动，也无法对深层区域进行成像。血管损伤会导致出血，血液会阻碍成像。为防止感染，需通过吸除人工脑脊液（ACSF）使脑表面与塑料膜尽可能紧密贴合。术中给予甘露醇对于防止脑压升高所致的脑组织和血管损伤至关重要。这有助于维持脑表面与硬脑膜之间的间隙，避免在去除颅骨和硬脑膜时触碰脑组织和血管。使用高倍体视显微镜和尖端精细的镊子也有助于实现精确的手术操作。
在丝素蛋白-AAV方法中，必须使用新鲜的家蚕茧，不可冷冻丝素蛋白溶液，需将丝素蛋白-AAV溶液充分干燥，并使用足够的溶液量（每3 mm直径使用5 µL）。当使用较陈旧的蚕茧时，表达效率会降低，这是因为陈旧蚕茧中的丝素蛋白可能更容易发生变性。若将丝素蛋白溶液在-80 °C冷冻并在使用时解冻，其表达效率也会较差，这可能是由于冻融过程导致蛋白质变性所致。由于4 °C保存的丝素蛋白溶液在发生凝胶化之前仍可有效使用，因此建议将丝素蛋白溶液冷藏保存，并在发生凝胶化后重新从蚕茧中纯化制备。丝素蛋白-AAV溶液应至少干燥3小时，因为干燥时间少于3小时会导致表达效果不佳。最后，表达区域的大小取决于所使用的丝素蛋白-AAV溶液的量。如图3M所示，该示例中使用的溶液量较少（5 µL），因此丝素蛋白-AAV薄膜仅覆盖了观察窗的上半部分，导致在整个观察窗上的表达不均匀。若使用足量的丝素蛋白-AAV溶液，则可在整个观察窗范围内实现均匀表达。
技术的改进 
这种新型颅窗技术可使研究者在同一小鼠中同时观察皮层环路的宏观活动及其在单细胞水平上的基础活动。因此，该方法可应用于多种神经科学研究。例如，可用于观察决策任务、运动学习过程中以及脑损伤和脑疾病小鼠模型中的皮层活动。我们还认为，该方法不仅可用于啮齿类动物，也可应用于非人灵长类动物。
本文证明，大颅窗技术在对转基因小鼠以及注射了表达功能性蛋白的AAV的小鼠进行成像时具有良好的效果。特别是，与传统的AAV注射方法相比，包裹在薄膜上的丝素蛋白-AAV（fibroin-AAV）薄膜能够更简便地在整个大脑皮层广泛区域表达基因编码的钙指示剂（GECIs）。通过使用编码两种不同颜色GECIs的AAV混合物41，可同时在大脑皮层的大范围区域内成像神经元与胶质细胞活动之间的相关性。此外，丝素蛋白-AAV薄膜方法也可应用于其他基因编码的生物传感器42,43,44,45,46,47。
更大的颅窗成像技术可同时观测两个半球，现已成为可能。近年来已开发出视场范围更广（约25 mm2）的双光子显微镜25,26,27,28,29。将此处所述的宽颅窗进行单光子宽场成像与该双光子成像技术相结合，将使我们能够以前所未有的尺度研究群体神经元活动与单细胞活动之间的关系。
局限性 
食物保鲜膜不允许任何物质通过，这使得该方法难以用于药理学实验。同时，保鲜膜难以移除，无法插入玻璃移液管或电极，因此难以与其他技术联用，例如同步进行钙成像与电生理记录，或通过玻璃移液管局部给药。解决这些局限性的可能方案是使用带孔的保鲜膜与玻璃窗，从而实现对脑组织的访问 通过 玻璃移液管或记录电极，同时长期保持颅窗无菌48.

宽场钙成像可有效研究动物大脑大范围区域的时空活动模式1,2,3。由于啮齿类动物的大脑皮层相对平坦，宽场成像已被广泛用于观察其整个皮层表面2,3,4,5,6,7,8,9,10。转基因小鼠或注射了腺相关病毒（AAV）的小鼠，可在神经元和胶质细胞等多种细胞中特异性表达GECIs，因而可用于宽场钙成像11,12,13。然而，该技术的空间分辨率通常不足以在活体（in vivo）条件下分辨单个细胞的活动14。此外，该方法也不适用于成像位于更深脑层的细胞。
另一方面，双光子钙成像能够以亚细胞级空间分辨率同时观测多个细胞的活动，从而可以在神经元树突和胶质细胞突起中观察单个细胞的活动15,16,17,18,19,20,21,22。它还能够观测大脑皮层更深层的细胞23,24。尽管近年来双光子显微镜的技术进步使得可以从毫米级宽的皮层区域进行成像25,26,27,28,29，但双光子成像仍难以达到宽场成像所覆盖的视场范围。
为了理解从单细胞到全脑水平脑活动的生理学意义，关键在于弥合全皮层范围内皮层区域活动与局部神经环路中单细胞分辨率活动之间的差距。因此，在同一只小鼠中结合使用宽场成像和双光子钙成像尤为有效。为实现这一目标，必须创建一个广阔且稳定的颅窗，并尽可能长期保持其稳定。
此前，已开发出多种制作颅窗的技术，以实现在同一只小鼠上进行大视野和双光子成像30,31。梯形盖玻片窗（晶状颅骨）可被塑造成与皮层表面形状一致，以替代被移除的颅骨，从而实现对整个皮层的光学通透32。此外，也可使用基于聚合物的颅窗，例如聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）33或聚环氧乙烷包覆的非晶态氟聚合物纳米薄膜34。每种方法均已被证明可维持稳定的颅窗超过1个月。然而，这些颅窗的制备并不容易，且所用材料和设备通常较为昂贵。
本研究描述了一种利用聚偏二氯乙烯（PVDC）薄膜（塑料食品保鲜膜）制作大型颅窗的新方法图1）。利用此窗口， 体内 宽场和双光子成像实验可在同一只小鼠上进行。已有研究表明，通过在包裹物上形成含有腺相关病毒（AAV）颗粒的薄膜层，可实现GECI在小鼠大脑皮层广泛区域的神经元中表达。

<table><tbody><tr><td>4% 多聚甲醛磷酸盐缓冲液</td><td>NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan</td><td>TritonX</td><td>丝素蛋白-AAV薄膜包裹法的表达效率</td></tr><tr><td>50 mL 烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>采集软件</td><td>Brain vision</td><td>BV_Ana</td><td>用于GCaMP6f的宽场钙成像</td></tr><tr><td>采集软件</td><td>Hamamatsu photonics</td><td>高速记录软件：HSR</td><td>用于XCaMP-R的宽场钙成像</td></tr><tr><td>采集软件</td><td>Vibrio Technologies</td><td>scanImage</td><td>用于双光子钙成像</td></tr><tr><td>人工脑脊液（ACSF）</td><td></td><td></td><td>150 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 用1M NaOH调节pH至7.4</td></tr><tr><td>ACSF吸引针</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>腺相关病毒</td><td>VectorBuilder</td><td>定制</td><td>AAV-DJ/8-Syn1-XCaMP-R</td></tr><tr><td>生物用粘合剂</td><td>Daiichi Sankyo</td><td>Aron Alpha-A</td><td></td></tr><tr><td>麻醉机</td><td>Shinano seisakusho</td><td>SN-487</td><td></td></tr><tr><td>麻醉剂</td><td>Kyoritsu Seiyaku Corporation</td><td>戊巴比妥钠</td><td>丝素蛋白-AAV薄膜包裹法的表达效率</td></tr><tr><td>辅助耳杆</td><td>Narishige</td><td>EB-5N</td><td></td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>Brain vision</td><td>MiCAM02-HR</td><td>用于GCaMP6f的宽场钙成像</td></tr><tr><td>透明乙烯基聚硅氧烷</td><td>GC</td><td>Exaclear</td><td></td></tr><tr><td>CMOS相机</td><td>Hamamatsu photonics</td><td>ORCA-spark</td><td>用于XCaMP-R的宽场钙成像</td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Matsunami</td><td>18 x 18 NO.1</td><td>尺寸：18 x 18 mm，厚度：0.13–0.17 mm，材质：硼硅酸盐玻璃</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td>丝素蛋白-AAV薄膜包裹法的表达效率</td></tr><tr><td>透析盒</td><td>3.5K MWCO, Slide-A-Lyzer</td><td>ThermoFisher</td><td></td></tr><tr><td>牙科粘接树脂水泥</td><td>SUN MEDICAL</td><td>Super-Bond</td><td></td></tr><tr><td>牙科钻</td><td>Nakanishi</td><td>VOLVERE Vmax</td><td></td></tr><tr><td>电子天平</td><td>Dretec</td><td>KS-243</td><td></td></tr><tr><td>滤光片</td><td>Brain vision</td><td></td><td>发射光滤光片（EM）：BP466/40-25，二向色镜（DM）：DM506，激发光滤光片（EX）：BP520/36-50</td></tr><tr><td>滤光片</td><td>Olympus</td><td></td><td>U-MRFPHQ，发射光滤光片（EM）：BP535-555HQ，二向色镜（DM）：DM565HQ，激发光滤光片（Ex）：BA570-625HQ</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td>丝素蛋白-AAV薄膜包裹法的表达效率</td></tr><tr><td>荧光微球</td><td>Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres</td><td>0.1 &amp;micro;m</td><td>评估传统与新型颅窗在双光子成像中点扩散函数的表现</td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>No. 11252-20</td><td>尖端细小，用于去除硬脑膜</td></tr><tr><td>镊子</td><td>KFI</td><td>K-7, No.J 18-8</td><td>通用型</td></tr><tr><td>止血明胶</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson</td><td>Spongostan</td><td></td></tr><tr><td>硫酸庆大霉素</td><td>Iwaki seiyaku</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃移液管</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>脱毛剂</td><td>Reckitt Japan</td><td>Veet</td><td></td></tr><tr><td>头部固定装置</td><td>定制</td><td></td><td>小鼠开颅进行皮层电压敏感染料成像。Suzuki, T., and Murayama, M. Bio-protocol 2016 6:e1722。</td></tr><tr><td>头板</td><td>定制</td><td></td><td>材质：铝或树脂，尺寸：40 x 25 mm，厚度：1.5 mm 或 2 mm，中央孔：15 x 10 mm（head_plate_06 v3.f3d）</td></tr><tr><td>加热垫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>图像处理软件（用于钙成像数据分析）</td><td></td><td>ImageJ</td><td>https://imagej.net</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>光源</td><td>Hayashi-repic</td><td>LA-HDF108AA</td><td></td></tr><tr><td>光源</td><td>Brain vision</td><td>LEX2-LZ4-B</td><td>用于GCaMP6f的宽场钙成像</td></tr><tr><td>光源</td><td>Olympus</td><td>U-HGLGPS</td><td>用于XCaMP-R的宽场钙成像</td></tr><tr><td>甘露醇溶液（15%生理盐水配制）</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>微型刮匙</td><td>FST</td><td>No. 10080-05</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Brain vision</td><td></td><td>用于GCaMP6f的宽场钙成像</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>用于XCaMP-R的宽场钙成像</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Sutter Instruments</td><td>MOM</td><td>用于双光子钙成像</td></tr><tr><td>组织切片机</td><td>Dosaka EM</td><td>DTK-1000N</td><td>丝素蛋白-AAV薄膜包裹法的表达效率</td></tr><tr><td>混合头</td><td>GC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>针头（30 G）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯泡沫</td><td>AS ONE</td><td>1-4656-01</td><td></td></tr><tr><td>聚偏二氯乙烯（PVDC）薄膜</td><td>Asahi Kasei</td><td>Asahi Wrap（或Saran Wrap）</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Mundipharma</td><td>Isodine</td><td></td></tr><tr><td>Python库</td><td></td><td>NumPy</td><td>科学计算包，https://numpy.org/doc/stable/index.html#</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Matplotlib</td><td>可视化库，https://matplotlib.org/stable/index.html#</td></tr><tr><td></td><td></td><td>pandas</td><td>数据分析与处理工具，https://pandas.pydata.org</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Kai</td><td>No. 11</td><td></td></tr><tr><td>动物用剃毛器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅胶分配器</td><td>GC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蚕茧</td><td>Satoyama Craft News</td><td></td><td>https://sato-yama.jp/</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>LEICA</td><td>MZ6</td><td>物镜：0.63x，目镜：25x</td></tr><tr><td>表面活性剂</td><td>NACALAI TESQUE</td><td>TritonX</td><td>丝素蛋白-AAV薄膜包裹法的表达效率</td></tr><tr><td>手术剪</td><td>FST</td><td>No. 91460-11</td><td></td></tr><tr><td>甘露醇注射用注射器</td><td>Terumo</td><td>1mL</td><td></td></tr><tr><td>透皮麻醉剂</td><td>AstraZeneca</td><td>利多卡因</td><td></td></tr><tr><td>用于星形胶质细胞钙成像的转基因小鼠</td><td></td><td></td><td>小鼠通过以下方法获得。&lt;br/&gt; AldH1l1-CreERT2小鼠：B6N.FVB-Tg(Aldh1l1-cre/ERT2)1Khakh/J（The Jackson laboratory，品系编号：031008）&lt;br/&gt; 他莫昔芬可诱导的Cre重组酶在绝大多数星形胶质细胞中高水平表达&lt;br/&gt; Flx-Lck-GCaMP6f小鼠：C57BL/6N-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-GCaMP6f)Khak]/J（The Jackson laboratory，品系编号：029626）&lt;br/&gt; Cre依赖性表达定位于细胞膜的GCaMP6f。&lt;br/&gt; 将上述小鼠杂交所得后代经他莫昔芬（20 mg/mL）处理5天（0.05 mL/10g体重，腹腔注射）以诱导GCaMP6f表达。</td></tr><tr><td>可调谐超快激光器</td><td>Spectra-Physics</td><td>InSight X3</td><td>用于双光子钙成像</td></tr><tr><td>防水膜</td><td>Nichiban</td><td>BFR5</td><td></td></tr><tr><td>野生型小鼠</td><td>Japan SLC</td><td>C57BL/6J</td><td>雄性和雌性，&gt;4周龄</td></tr></tbody></table>

体内 宽场与双光子钙成像技术在小鼠大颅窗中的应用

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

对小鼠新皮层进行宽场钙成像，可观察与多种脑功能相关的全皮层神经活动。另一方面，双光子成像能够在单细胞水平上解析局部神经环路的活动。为了在同一小鼠中结合使用这两种成像技术进行多尺度分析，制作一个较大的颅窗至关重要。为此，必须移除颅骨的较大区域，并用透明材料覆盖暴露的皮层表面。此前已开发出玻璃颅骨和基于聚合物的颅窗，但这些材料不易制备。本实验方案描述了一种简便的方法，使用市售的聚偏二氯乙烯（PVDC）保鲜膜、透明硅胶塞和盖玻片来制作大颅窗。为实现对整个半球背侧表面的成像，颅窗尺寸约为 6 × 3 mm2。尽管窗口较大，但未观察到严重的脑组织振动。重要的是，脑表面的状态在超过一个月的时间内未出现恶化。对星形胶质细胞特异性表达基因编码钙指示剂（GECI）GCaMP6f的小鼠进行宽场成像，揭示了数毫米范围内的同步反应。同一小鼠的双光子成像显示，单个星形胶质细胞在数秒内表现出显著的钙信号响应。此外，将腺相关病毒的薄层施加于PVDC膜上，成功实现了在颅窗覆盖区域的皮层神经元中表达GECI。该技术可靠且成本低廉，适用于制作大颅窗，有助于在宏观和微观层面研究行为过程中神经元与胶质细胞的动态及其相互作用。

使用PVDC包裹法制作的大颅窗评估 
手术后可立即通过皮层表面状况（如出血、因损伤或缺血导致的颜色变化）直观判断手术成功或失败。术后较长时间，皮层表面可能因感染被不透明的白色膜覆盖，或因出血导致血液覆盖颅窗（图2G）。在这些情况下，皮层可能处于非健康状态，成像可能无法进行。这些问题可能由包裹部分断裂或粘合剂对包裹固定不充分引起。若反复出现感染，可在放置颅窗时于脑表面应用抗生素（例如硫酸庆大霉素，10 µL，50 mg/mL），可能有效。当皮层表面与包裹之间存在较大垂直间隙时，也可能观察到脑膜或骨组织再生。为防止此现象，在制备颅窗时应尽可能将包裹紧密贴合脑表面。可通过将塑料膜覆盖于脑表面并尽可能吸除人工脑脊液（ACSF）来实现。若无ACSF，可直接将塑料膜置于脑表面。通过观察脑组织颜色无异常、血管未断裂，可判断脑组织和血管未受损伤。
窗口的长期稳定性在很大程度上取决于手术质量。当状态良好时，术后1个月以上无感染、出血或再生迹象（图2F 和 图3B）。在10只小鼠中的8只，窗口可保持清晰达10周或更长时间。其中2只小鼠的窗口因感染或出血而无法正常维持。尽管较大的窗口可能更容易受到机械应力或冲击的影响，但未观察到窗口破裂或裂纹的情况。
为了评估带有包裹层、硅胶和玻璃的新式颅窗的成像质量，通过成像琼脂中的0.1 µm荧光微珠，比较了新式颅窗与传统玻璃颅窗下的点扩散函数（参见补充文件1）。结果显示，两种条件下在半高全宽（FWHM）上无显著差异。[X轴（µm）：仅玻璃组1.99 ± 0.07，包裹组1.76 ± 0.13；Y轴（µm）：仅玻璃组2.11 ± 0.27，包裹组1.90 ± 0.15；Z轴（µm）：仅玻璃组25.29 ± 0.71，包裹组26.64 ± 1.02；N = 7个微珠，p &gt; 0.05，Mann-Whitney U检验，补充图2A,B]。因此，新增的组件（包裹层和硅胶）并未降低成像质量。
由呼吸、心跳和身体运动引起的振动伪影在宽场和双光子成像中普遍存在。为确定新型颅窗的振动程度，从图像中选取了一个微小的荧光颗粒 体内 双光子成像数据，并分析其图像在60秒内的移动程度。结果发现，该荧光颗粒质心的标准差约为 0.3 µm，这与传统玻璃窗下的情况相当（补充图2C这表明，由于大脑被透明硅胶塞和盖玻片固定，所产生的振动与传统较小窗口中观察到的相当，因此离线图像配准足以消除振动伪影。
在宽场钙成像中，可观察到由感觉刺激诱发的皮层活动在皮层上传播（图3A-D,K-N）。双光子成像可观察到特异性标记神经元和胶质细胞的单细胞荧光图像（图3E,O）。在单个细胞中可观察到由感觉刺激诱导的荧光变化（图3E-J,O-T）。
利用PVDC包裹和AAV在大脑皮层大范围表达遗传编码的钙指示剂（GECIs） 
可用于窗口的PVDC包裹可实现功能蛋白在皮层大范围区域的表达。该方法通过使用AAV以及丝素蛋白（fibroin）实现，后者是蚕茧的一种组分蛋白，已被广泛用作生物材料37。先前研究表明，丝素蛋白可与AAV混合，形成可植入脑内的薄膜，用于表达功能性蛋白，如光激活视蛋白或GECIs36。在本研究中，将表达GECI的AAV与丝素蛋白混合后干燥于包裹膜上，并将涂有AAV的包裹膜用于颅窗。术后2-4周，皮层大范围区域成功表达了GECI（图3K-M）。由于颅窗面积较大，可在同一只小鼠中对不同皮层区域进行成像（图3M-T）。
为了验证该方法的表达效率，在固定脑组织中统计了表达GECI的细胞数量（补充图2D）。结果表明，采用丝素蛋白包裹AAV的当前策略，在浅层和深层脑区均实现了约20%的GECI表达效率（L2/3层：20.78%，表达XCaMP-R的细胞：32个，DAPI标记位点：154个；L5层：20.08%，表达XCaMP-R的细胞：51个，DAPI标记位点：254个）。因此，该方法不仅可在表层脑区细胞中表达GECI，也可在深层脑区细胞中实现表达。
<img alt="小鼠颅窗手术示意图，暴露大脑皮层，硅胶覆盖盖玻片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：大颅窗的概念示意图。 （A）左侧，新型颅窗的示意图，其尺寸大于传统颅窗（直径 3 mm）。右侧，横截面视图。该大颅窗制备方法使用食品保鲜膜、透明硅胶弹性体和盖玻片，可在同一只小鼠上实现宽场成像和双光子成像。（B）颅窗制备流程：（a）去除颅骨。（b）移除保鲜膜下方的人工脑脊液（ACSF）。（c）通过移除 ACSF 使保鲜膜贴附于脑表面。（d）剪除多余的保鲜膜。（e）涂抹透明硅胶。（f）固定盖玻片。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="啮齿类动物颅窗手术装置示意图；从准备到植入结果的流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：颅窗手术概览。 (A) 颅窗手术所需材料与设备。(a) 聚偏二氯乙烯（PVDC）包裹膜。(b) 带混合尖端的透明硅胶弹性体分配器。(c) 盖玻片。(d) 两片盖玻片之间夹有透明硅胶。(B) 小鼠头部皮肤切开后暴露颅骨的实物照片。小鼠已麻醉，并使用耳杆固定头部。随后去除毛发，进行局部镇痛处理，并切开皮肤。(C) 安装头板后的实物照片。使用牙科水泥将头板（由3D打印机树脂制成）固定在小鼠头部。(D) 颅窗的实物照片。颅窗位于小鼠脑右半球皮层。已去除硬脑膜，并将包裹膜粘附固定。(E) 由包裹膜、透明硅胶和盖玻片组成的窗口照片。(F) 手术成功窗口的典型示例（右半球，术后7周）。(G) 窗口失败的示例（双侧半球，术后5周）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="表达GCaMP6f的转基因小鼠进行钙成像；气流刺激；荧光变化图示；ΔF/F分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64224/64224fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：大窗口允许对同一只小鼠进行宽场和双光子钙成像。（A）在星形胶质细胞中表达膜锚定型GECI（Lck-GCaMP6f）的转基因小鼠中进行钙成像40。（B）左图：使用塑料薄膜、透明硅胶和盖玻片制作大窗口，并通过该窗口进行宽场成像。右图：颅窗植入后第79天拍摄的照片。（C）当对同侧须垫施加气流刺激时，观察到荧光变化。（D）绘制了体感皮层（C中红色方框区域）荧光变化的时间进程。红线和蓝线分别表示气流刺激的时间点以及（C）中的“刺激前”、“刺激中”和“刺激后”时间段。（E）双光子钙成像的视野（C中的FOV 1）。由于GCaMP6f表达定位于细胞膜，因此手动放置感兴趣区域（白色方框），以检测星形胶质细胞突起的局部反应。（F）绘制了（E）中彩色方框区域的荧光变化。（G）绘制了（E）中所有方框区域的荧光变化，横轴和纵轴分别表示时间与细胞编号。（H–J）显示（C）中位于视觉皮层的第二个视野（FOV 2）的数据。FOV 2在完成FOV 1成像后进行成像。（K）在野生型小鼠中，通过fibroin-AAV方法在神经元中表达红色GECI（XCaMP-R）。（L）使用fibroin膜制作窗口后两周拍摄的照片。（M）对该小鼠进行宽场钙成像。（N）从最显著的位点（体感皮层，M中红色方框）绘制由须垫刺激诱发的荧光变化。红线和蓝线分别表示气流刺激的时间点以及（M）中的“刺激前”和“刺激中”时间段。（O）在深度为300 µm处对体感皮层（M中FOV 1）进行双光子钙成像。手动将感兴趣区域置于神经元胞体上。（P）绘制了（O）中彩色方框区域的荧光变化。（Q）以彩色方式绘制了（O）中所有方框区域的荧光变化。（R–T）显示位于顶叶皮层的（M）中FOV 2的数据。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/64224fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1：手术刀使用提示。 全新手术刀的刀尖（上方）与用于切割颅骨后变钝的手术刀刀尖（下方）的对比。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：新型颅窗及丝素蛋白-AAV表达方法的验证 (A荧光强度分布曲线 0.1 µm 琼脂中的荧光微球。上排显示仅在混合有荧光微球的琼脂上覆盖盖玻片条件下的数据，下排显示覆盖保鲜膜、透明硅胶和盖玻片条件下的数据。灰色迹线表示对每个微球荧光强度分布的高斯拟合，红色迹线表示其平均值（n = 7）。(B)（中）数据汇总A）。每个图表显示了点扩散函数在XYZ轴上的半高全宽（FWHM）。灰色曲线表示每个微珠的数据，红色表示其均值和标准误。C从2,000帧（60秒记录）中 体内 成像数据，选取了一个小的荧光颗粒，检测其在60秒内的图像移动程度。中心的荧光图像代表2,000帧的平均值。图像通过在X轴和Y轴方向上进行平均投影。直方图显示了每帧中质心的分布情况。质心的标准偏差为X：0.36，Y： 0.315 µm. (D) 丝蛋白-AAV 方法实现 GECI 表达的示例。左图：采用丝蛋白-AAV 表达方法的大脑皮层切片。红色和蓝色分别表示 XCaMP-R 和 DAPI 的荧光信号；XCaMP-R 不仅在第 2/3 层细胞中表达，也在第 5 层细胞中表达。中图和右图：左图中第 2/3 层和第 5 层区域（青色方框）的放大视图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件 1：（A）丝素-AAV 薄膜法的包裹表达效率和（B）双光子成像过程中点扩散函数的评估。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64224/Supplementary%20File%201_FINAL.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了制备一个大型（6 x 3 mm）2) 使用食品保鲜膜、透明硅胶和盖玻片制作颅窗。该颅窗可允许 体内 在同一小鼠中进行的宽场和双光子钙成像实验

小鼠新皮层的宽场钙成像可实现对与多种脑功能相关的全皮层神经活动的观测。在……

本方案展示了如何创建大范围颅窗，以在同一小鼠中测量全脑视野和单细胞分辨率水平的神经活动。通过我们的方法，可使用食品保鲜膜以较低成本制备出大而稳定的颅窗。该方法适用于在宏观和微观尺度上研究动物行为过程中的神经元和胶质细胞活动。建议从小的颅窗开始。如果成功，再逐步扩大颅窗尺寸。首先使用牙科钻去除颅骨表面多余的水泥。用记号笔标记需要切割的区域。使用钝头手术刀切削骨面，确保刀尖不穿透颅骨。反复用手术刀刮削骨面以加深切痕，直至待修剪区域的骨片在轻触时可活动。使用精细镊子移除切下的骨片。注意不要将骨瓣推入脑组织，以免损伤脑部。为去除硬脑膜，使用拉制的玻璃微吸管（尖端锥形直径约10微米）剪开硬脑膜。使用U形针将切口在整个窗口区域扩大。在体视显微镜下以60至100倍放大倍数，用超细镊子去除已切断的硬脑膜。若发生出血，用aCSF冲洗或使用明胶海绵止血。然后，通过高压灭菌和70%乙醇对一大块PVDC膜进行灭菌。在体视显微镜下，使用镊子和手术刀切割出所需大小的膜片。将膜片放置在脑表面，同时保留aCSF在表面。从包裹边缘吸出aCSF，使包裹牢固地贴附在脑表面。使用手术刀和镊子修剪包裹，使包裹边缘与颅窗边缘之间保留约一毫米的间距。包裹就位后，使用生物粘合剂将包裹边缘粘附到颅骨上。让粘合剂干燥约30分钟。使用带有混合尖端的分配器，在包裹层上方涂布一层透明硅酮弹性体。将厚度为0.12至0.17毫米的盖玻片置于其上。用防水膜、超级胶水或牙科水泥密封盖玻片的边缘。首先，在小样品管中按1:4的比例混合丝素蛋白与AAV溶液。取一份该溶液滴加到颅窗的塑料膜上，并干燥至少三小时。然后按照前文所述方法将包裹物附着在脑表面。定期检查小鼠及颅窗的状态，间隔时间为两到四周。此时，经过腺相关病毒（AAV）处理的颅窗区域，遗传编码的钙指示剂已得到充分表达。采用该方案，10只小鼠中有8只的颅窗可维持长达10周。在表达星形胶质细胞膜锚定型遗传编码钙指示剂的转基因小鼠中，使用塑料薄膜、透明硅胶和盖玻片制备了大视野颅窗。通过该颅窗进行宽场钙成像，当对同侧须部施加气流刺激时，可观察到荧光信号的变化。体感皮层荧光变化的时间过程显示了皮层活动。双光子成像技术实现了对胶质细胞特异性单细胞荧光图像的观察。在来自不同皮层区域的单个细胞中，观察到了由感觉刺激诱导的荧光变化。使用表达基因编码钙指示剂的腺相关病毒（AAV）包裹编码物；丝素蛋白用于制作颅窗。宽场钙成像显示，在手术后两周至四周，由感觉刺激诱发的皮层活动在皮层范围内传播。由于颅窗较大，可对同一只小鼠的不同皮层区域进行成像，并观察到感觉刺激在单个细胞中诱导的荧光变化。在制作颅窗时，必须注意避免对大脑造成损伤。可以在具有较大颅窗的小鼠上进行行为学任务，从而能够研究神经活动与小鼠行为之间的关系。该方法可应用于多种神经科学研究。例如，可用于观察决策任务、运动过程以及脑损伤和疾病大规模模型中的皮层活动。

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