基于简单快速的滚动圆扩增检测粗生物样品中的拓扑异构酶1活性

该协议展示了一种滚动环扩增方法，以快速简单的方式检测粗样品中的拓扑异构酶1活性。该方法的主要优点是，没有经验的研究人员也很容易遵循，并且与其他基于凝胶的测定相比，当使用粗提取物时，它更灵敏。该方案的应用从测量对药物治疗的反应，扩展到筛选具有潜在抗癌或抗传染病作用的小分子化合物。

演示该程序的将是来自我们实验室的Karol Mizielinski开发专家。首先，将定制设计的硅胶隔离器网格连接到功能化载玻片上，从而使制井机。按下硅胶格栅，避免玻璃表面和硅胶之间形成气泡。

接下来，通过在一次打印缓冲液中加入五微摩尔、五素氨基引物来制备引物混合物。然后向每个孔中加入四微升这种混合物，并将制井机在含有饱和氯化钠的杂交室中孵育。为了产生封闭的圆形底物，将两微升五微摩尔拓扑异构酶1特定底物和两微升重组拓扑异构酶1酶或制备的细胞提取物加入到16微升一次性拓扑异构酶反应缓冲液中。

将该圆形混合物在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，并通过加入两微升 1%sds 来停止酶反应。将制井机浸入装有缓冲液 1 的托盘中，预热温度为 50 摄氏度。将缓冲液移入孔中，以确保孔机内没有气泡残留，然后将托盘在 50 摄氏度下孵育 30 分钟。

孵育后，除去缓冲液1，用蒸馏水洗涤两次，两次洗涤之间剧烈摇动一分钟。取出水，接下来，加入缓冲液2，在50摄氏度下预热到托盘中，然后孵育并清洗孔机，如前所述缓冲液1。接下来，用70%乙醇清洗制井机，剧烈摇晃一分钟，并使用压缩空气使装置干燥。

为了进行杂交，将四微升准备好的圆形混合物添加到每个相应的孔中，并将制井机置于装有37摄氏度蒸馏水的湿度室中一小时。在孵育结束时，分别洗涤孔机一分钟，缓冲液3，缓冲液4和70%乙醇，然后风干。准备并向制井机的每个孔中加入四微升RCA混合物，并在湿度室中在37摄氏度下孵育两个小时。

为了在显微镜下可视化放大的荧光滚动圈产物，首先用缓冲液3，缓冲液4和70%乙醇洗涤载玻片。用压缩空气干燥载玻片并将其粘在显微镜载玻片上。用记号笔标记孔的位置，然后用镊子取出硅胶网格。

为了在相机中进行可视化，请使用两微升不含dapi的安装介质安装载玻片，并添加盖玻片。使用荧光显微镜，使用60倍油浸物镜和相机分析载玻片。成像后，将图片导入图像J并通过单击图像堆叠图像，然后单击堆叠和图像到堆叠，然后将图像类型更改为8位。

要设置阈值，请单击图像、调整，然后单击阈值。将下栏设置为 255 并调整上栏，以便只有正确的信号为红色，背景为黑色。在调整阈值之前，扫描单个图像并确保它们与图像相对应。

确保在实际信号开始消失之前将阈值设置得尽可能低。要对信号进行计数，请单击分析，然后单击分析粒子，并确保选中图像J设置中的汇总字段。向每个孔中加入四微升稀释的马萝卜过氧化物酶偶联的抗生物素抗体，并在湿度室中在 15 至 25 摄氏度下孵育 50 分钟。

在孵育结束时，用缓冲液5洗涤孔机三次，每次三分钟，然后干燥。为了可视化化学发光，向孔中加入两微升新鲜制备的ECL鲁米诺和过氧化氢混合物，并使用CCD相机或X射线胶片可视化载玻片。或者，为了用TMB可视化，在缓冲液5洗涤后去除硅胶网格，并在整个载玻片上加入400微升TMB。

将载玻片放在湿度室中，等待 5 到 10 分钟以显色。显色后，用70%t乙醇清洗载玻片，并用相机或手机拍摄载玻片，以便使用Image J软件进行分析。将图片导入图像J，并通过单击图像类型，然后单击8位将图像类型更改为8位。

通过使用工具栏中的矩形绘制工具限制测量区域，以单独测量波段并绘制所需区域。通过单击、分析，然后单击测量来测量强度。接下来，将最初绘制的区域移动到下一个波段并测量。

测量所有波段的强度后，在所需的软件中绘制数据。此处描述了由荧光扫描仪读数确定的拓扑异构酶1活性，从定量中可以明显看出。该读数的检测限为12.5 ng，代表性图像和使用荧光显微镜读数获得的定量结果如下所示。

该读数法的检测限为0.1 ng，增强化学发光和彩色o'metric读数方法的检测阈值为6 ng。使用相同的读数，ECL的检测限为1，250个细胞，TMB的检测限为312个细胞。当从结直肠腺癌衍生细胞的提取物中测量拓扑异构酶1活性时。

作为药物筛选应用的一个例子，在喜树碱或二甲基亚砜存在下测量拓扑异构酶1活性。定量结果表明，喜树碱抑制拓扑异构酶1一介导的底物如预期的那样循环化。这是一个简单的方案，只需要特别注意洗涤步骤和反应孵育时间。

还可以研究药物如何抑制拓扑异构酶1活性，使用Reid具有高度灵敏度且易于执行，它允许快速筛选潜在的拓扑异构酶1抑制剂，以及使用拓扑异构酶1活性作为癌症药物反应的生物标志物。