Name: 基于简单快速的滚动圆扩增检测粗生物样品中的拓扑异构酶1活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T12:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学习使用滚环扩增技术检测粗生物样品中的拓扑异构酶1活性。该方法操作简便，检测限可达0.1纳克，适用于药物筛选和细胞反应测量，为不同经验水平的研究人员提供了高灵敏度的酶学分析工具。

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作者感谢奥胡斯大学分子生物学与遗传学系实验室技术员 Noriko Y. Hansen 在 Phi29 和 TOP1 酶纯化方面的技术支持。

注意：所需缓冲液配方、设备及其他材料的清单见材料表。
1. 细胞培养
<ol>
	<li>在合适的培养基中培养优选的细胞，并按照说明进行生长。例如，将来源于结肠直肠腺癌的Caco2细胞培养于添加了20%胎牛血清（FBS）、1%非必需氨基酸（NEAA）、100单位/毫升青霉素和100毫克/毫升链霉素的最低必需培养基（MEM）中。将细胞培养物维持在加湿的培养箱中（37 °C，5% CO2/95%空气环境）。将细胞接种至组织培养瓶中，每3天传代一次，以保持细胞汇合度为70%。</li>
	<li>通过胰蛋白酶处理（0.25%胰蛋白酶，0.02% EDTA溶液）从70%汇合度的培养瓶中收获细胞，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。</li>
	<li>用PBS重悬细胞沉淀，调节细胞浓度至每管0.5 × 106个细胞。在200 × g下离心5分钟，小心吸除上清液。 
	&#8203;注意：用于REEAD检测的细胞必须新鲜使用并置于冰上。使用Caco2细胞获得的结果最近已有发表17。该检测已测试多种细胞系，包括结肠、乳腺、肺和宫颈癌来源的细胞18,19,20,21,22,23，但也可用于所有含有TOP1的粗生物样品，如组织、血液和唾液。</li>
</ol>
2. 功能化载玻片的制备
<ol>
	<li>将定制设计的硅胶隔离网格连接到功能化载玻片上，从而制成微孔阵列。按压硅胶以避免产生气泡（见图1A）。</li>
	<li>在1×打印缓冲液中配制5 µM的5'-氨基引物混合液。向每个孔中加入4 µL该混合液，并将微孔阵列置于含有饱和NaCl的杂交盒中，在15 °C至25 °C条件下避光孵育。 
	注意：杂交盒可简单地使用装有饱和NaCl的移液器吸头盒制作。杂交时间最少为16小时，最长为72小时。5'-氨基引物的序列见图1B。载玻片表面经NHS基团功能化处理，以实现氨基修饰寡核苷酸的结合。</li>
</ol>
3. 环状闭合底物的制备
<ol>
	<li>使用重组TOP1或细胞提取物制备闭合环状底物。
	<ol>
		<li>将0.5 × 106个细胞的细胞沉淀在500 µL裂解缓冲液中裂解，使细胞密度达到1,000个细胞/µL。冰上孵育10分钟。</li>
		<li>在16 µL的1× TOP1反应缓冲液中，加入2 µL浓度为5 µM的TOP1特异性底物（底物序列为：5'-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3'）以及2 µL重组TOP1酶或2 µL细胞提取物（见步骤3.1.1），配制成环化反应混合液。 
		&#8203;注意：所用重组TOP1的浓度取决于所选检测方法（见图2、图3、图4和图5）。TOP1特异性底物的序列见图1C。</li>
		<li>在37 °C孵育30分钟（见图1C、D）。</li>
		<li>加入2 µL 1% SDS终止反应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在药物存在下制备闭合环状底物
	<ol>
		<li>在14 µL的1× TOP1反应缓冲液中，加入2 µL浓度为5 µM的TOP1特异性底物和1 µL 100% DMSO或1 µL 1.6 mM喜树碱（CPT），配制成环化反应混合液。再加入2 µL浓度为5 ng/µL的重组TOP1酶。 
		注意：也可使用其他小分子化合物或药物。在此情况下，应进行化合物的浓度梯度测试。若化合物溶解于非DMSO溶剂中，则应以该溶剂作为对照，而非DMSO。</li>
		<li>在37 °C孵育1分钟。</li>
		<li>加入2 µL 1% SDS终止反应。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
&#8203;注意：步骤3可与步骤2同时进行，且环状产物可在4 °C下过夜保存。或者，DNA环状结构也可在步骤4进行时制备并立即使用。TOP1特异性底物的序列见图1C。该底物折叠成哑铃形结构，包含一个具有优选TOP1切割位点的双链茎区以及两个单链环。开放型哑铃状底物通过TOP1介导的切割与连接反应转化为闭合环状底物，此后简称其为“环状物”。由于5'-氨基引物过量存在，开放型与闭合型TOP1特异性底物之间不会发生竞争。
4. 封闭井板制造器
<ol>
	<li>将wellmaker浸入盛有预热至50 °C的Buffer 1的5 cm × 5 cm托盘中。使用移液器将液体推入各孔内，确保无气泡残留。在50 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>移除Buffer 1，用dH2O洗涤2次，每次1分钟。手动剧烈振荡。</li>
	<li>加入预热至50 °C的Buffer 2。确保各孔内无气泡。在50 °C下孵育30分钟。</li>
	<li>用dH2O洗涤2次，每次1分钟。手动剧烈振荡。</li>
	<li>用70% EtOH洗涤1分钟。手动剧烈振荡。</li>
	<li>让wellmaker装置自然风干。 
	&#8203;注意：可使用压缩空气吹干各孔。或者，也可使用巴斯德移液器吹入空气。确保各孔完全干燥后再进行后续操作。</li>
</ol>
5. 将环状探针杂交至wellmaker
<ol>
	<li>将第3步制备的环状产物各4 µL加入对应的孔中。</li>
	<li>将孔板置于湿度 chamber 中，在37 °C下孵育1小时，并加入dH2O。 
	&#8203;注意：湿度 chamber 可通过在移液枪吸头盒中加入dH2O制备。或者，也可在湿度 chamber 中于25 °C过夜进行杂交反应。</li>
</ol>
6. 清洗
<ol>
	<li>用缓冲液3清洗wellmaker。</li>
	<li>移除缓冲液3，并替换为缓冲液4。</li>
	<li>移除缓冲液4，用70%乙醇洗涤。</li>
	<li>移除乙醇，让wellmaker自然干燥。 
	&#8203;注意：所有洗涤步骤均在5 cm × 5 cm的托盘中完全浸没载玻片进行，持续1分钟。务必确保各孔内无气泡残留。</li>
</ol>
7. 滚环扩增
<ol>
	<li>配制RCA反应混合液：在1x Phi29反应缓冲液中添加0.2 µg/µL BSA、1单位Phi29聚合酶，以及以下任一种核苷酸组合：用于荧光检测时，加入0.25 mM dNTP和0.0125 mM ATTO-488-dUTP；用于比色/化学发光检测时，加入0.1 mM dATP、0.1 mM dTTP、0.1 mM dGTP、0.09 mM dCTP和0.01 mM Biotin-dCTP。每孔加入4 µL。参见图1E。 
	注意：RCA反应混合液的配制必须在冰上进行。若RCA反应中使用荧光标记核苷酸，从本步骤开始应避免直接光照，以保护荧光基团。</li>
	<li>在湿化室中37 °C孵育2小时。若使用荧光标记核苷酸，需将湿化室置于避光环境中。参见图1F,G。</li>
</ol>
8. 清洗
<ol>
	<li>对于化学发光或比色读出方案，按照步骤6清洗反应板，然后继续进行步骤11。</li>
	<li>对于荧光读出方案，在以下步骤清洗前，先用镊子移除硅胶网格。
	<ol>
		<li>在缓冲液3中清洗载玻片10分钟。</li>
		<li>移除缓冲液3，并替换为缓冲液4，清洗5分钟。</li>
		<li>移除缓冲液4，在70%乙醇（EtOH）中清洗1分钟。</li>
		<li>移除乙醇，并让反应板自然干燥。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. 使用荧光扫描仪可视化荧光滚环扩增产物
<ol>
	<li>使用与所用荧光染料相对应的滤光片，在荧光扫描仪中扫描载玻片。使用尽可能高的光电倍增管增益，但不得导致信号饱和。 
	注意：本方案中用于图像采集的荧光扫描仪配备有473 nm激光器，以及FAM滤光片（激发波长490 nm，发射波长520 nm）。</li>
	<li>将图像导入 ImageJ，并将图像类型更改为8位（图像 | 类型 | 8位）。为单独测量各条带，可使用工具栏中的矩形绘图工具限定测量区域。绘制所需区域后进行强度测量（分析 | 测量）。然后将最初绘制的区域移至下一个条带位置并再次测量。</li>
	<li>在所需的软件中绘制数据。来自ImageJ的代表性图像及定量结果如图2所示。</li>
</ol>
10. 使用荧光显微镜观察荧光滚环扩增产物
<ol>
	<li>使用耐乙醇的记号笔在硅胶网格移除前标记好孔的位置，然后按照步骤8.2清洗载玻片。清洗完成后，用1 µL不含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片，并加盖盖玻片。为便于相机成像，将载玻片粘附于76 mm × 26 mm的显微镜载玻片上。</li>
	<li>使用配备60倍油镜和相机的荧光显微镜进行观察。每份样品/孔采集12至15张图像。</li>
	<li>导入图像至ImageJ软件，并将图像堆叠（图像 | 堆栈 | 图像形成堆栈）。将图像类型更改为8位（图像 | 类型 | 8位）。</li>
	<li>设置阈值（图像 | 调整 | 阈值）。
	<ol>
		<li>按如下方式设置阈值：固定下限滑块，调节上限滑块，使仅有真实信号呈红色，背景为黑色。确保在真实信号开始消失之前，阈值尽可能低。</li>
		<li>逐帧浏览各图像，确认其与设置阈值前的图像一致。注意阈值可能因实验而异。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计数信号（分析 | 分析颗粒）。确保ImageJ设置中的“汇总”字段已被勾选。
	<ol>
		<li>将结果导出至电子表格或其他软件以进行进一步数据处理。代表性图像及从ImageJ提取的定量结果见图3。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
11. 将HRP偶联的抗生物素抗体与生物素标记的滚环扩增产物偶联
<ol>
	<li>向每孔中加入 4 µL 用添加了 5% 脱脂奶粉和 5% BSA 的 Buffer 5 按 1:300 稀释的 HRP 标记抗生物素抗体。</li>
	<li>在湿度培养箱中 15–25 °C 条件下孵育 50 分钟（参见 图 1H）。</li>
	<li>用 Buffer 5 洗涤 3 次，每次 3 分钟。</li>
	<li>干燥反应孔板。</li>
</ol>
12. 生物素标记的滚环扩增产物的可视化
<ol>
	<li>使用 ECL 显影
	<ol>
		<li>使用前立即混合 40 µL ECL Luminol 和 40 µL H2O2，每孔加入 2 µL。</li>
		<li>使用 CCD 相机或 X 射线胶片观察切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 TMB 显影
	<ol>
		<li>完成步骤 11.4 后，移除硅胶网格。然后在整张切片上加入 400 µL TMB，并将切片置于湿盒中。等待约 5–10 分钟以显色。显色完成后，用 70% EtOH 洗涤切片。</li>
		<li>肉眼观察显色结果。使用相机或手机拍摄切片照片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导入图像至 ImageJ，并将图像类型更改为8 位（图像 | 类型 | 8 位）。为分别测量各条带，使用工具栏中的矩形绘图工具限定测量区域。绘制所需区域并测量其强度（分析 | 测量）。然后将最初绘制的区域移至下一个条带并进行测量。</li>
	<li>在所需软件中绘制数据图。从 ImageJ 提取的代表性图像及定量结果见图 4、图 5和图 6。</li>
</ol>

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</ol>

作者 C.T. 和 K.M. 是 VPCIR biosciences ApS 的员工。C.T.、B.R.K. 和 M.S. 为股东和/或持有股票期权。C.T.、B.R.K. 和 M.S. 宣布，他们作为发明人，以 VPCIR biosciences ApS 的名义提交了专利 EP2022/057172。其他作者声明不存在竞争利益。

拓扑异构酶是一类DNA修饰酶，因其可作为具有抗癌治疗潜力或可用于对抗传染性疾病的小分子化合物的作用靶点，而受到广泛的研究和临床关注。此外，人源TOP1的活性已被证实是癌症预后和治疗的有效生物标志物18,19,23。尽管化疗抑制剂的疗效实际上取决于TOP1的活性26，但在临床实践中通常检测的是DNA-RNA的量或TOP1蛋白的含量。这主要是由于目前缺乏快速、简便且无需凝胶电泳的工具，能够在各类实验室条件下对拓扑异构酶活性进行准确而精确的定量分析。
本文描述了一种无需凝胶的REED检测方法，用于测量TOP1活性。在该方案中，将纯化的TOP1或细胞粗提物与一种特别设计的哑铃形DNA底物共同孵育；该底物在TOP1介导的切割/连接反应后，会转化为闭合的环状分子。随后，这些环状分子杂交到玻璃表面，并通过RCA（滚环扩增）进行扩增。为了便于在载玻片上进行反应操作，将一个硅胶网格固定在玻璃表面，形成多个独立的反应孔，使反应可在各自的孔中进行。该方案由此利用了一种称为wellmaker的多孔系统——即硅胶网格。
本方案用于检测重组TOP1以及从结直肠腺癌细胞Caco2中提取的TOP1的活性，后者作为示例使用。此外，为展示REEAD作为药物筛选工具的应用，本方案还用于检测已知的TOP1抑制剂CPT24,25对TOP1活性的抑制作用。该检测可结合多种检测方法：荧光显微镜法具有高灵敏度；而荧光扫描仪、化学发光或比色法所需的专用设备和操作培训较少。高灵敏度的荧光显微镜检测方法存在以下局限性：需要高质量的荧光显微镜设备、熟练的技术人员，且图像采集与分析过程耗时较长。
基于这些原因，本文介绍了荧光扫描读数方法，该方法虽然在灵敏度上有所牺牲，但能够实现更快的信号采集与分析。&#160;若无荧光扫描仪，也可采用另外两种优秀的替代方法：化学发光法和比色法。这两种方法均快速简便，无需昂贵设备或专业培训。在所有读数模式中，与当前主流的检测方法相比，REEAD 具有诸多优势：主流方法通常更为耗时，依赖凝胶电泳（需使用嵌入染料），且定量性较差。然而，本实验方案中仍存在几个关键步骤需要注意。在进行药物筛选时，应针对所研究的药物优化时间点、药物浓度以及 TOP1 酶量与 DNA 底物的比例，而不能直接沿用为喜树碱（CPT）优化的实验条件。可通过将药物预先与 DNA 底物孵育，或预先与 TOP1 酶孵育的方式开展研究。这些实验设计可提供有关该分子抑制 TOP1 能力的重要信息，并有助于揭示其作用机制。
此外，如果出现信号偏低或无信号的情况，最可能的原因是粗样品裂解效率低下，或由于蛋白酶抑制剂使用不当导致提取物中的TOP1发生降解。另外，这种情况也可能源于关键检测组分的储存不当，例如重组TOP1、phi29聚合酶、核苷酸、底物和引物。最后，应避免寡核苷酸反复冻融，因为这会显著影响检测性能。当使用粗提物时，需要优化特定生物样品的提取效率，且其中TOP1的含量和活性可能与本文报道的示例有所不同。因此，每种待测粗提物均需进行滴定，以确定使用该特定样品时检测的灵敏度范围和检测限。本方案已针对人TOP1的检测进行了优化。其他真核生物TOP1的活性也可测定，但可能需要根据酶的纯化方法及其最适酶活性，对NaCl浓度和孵育时间进行优化。延长孵育时间将产生更多的环化底物，而缩短孵育时间则会导致环化底物减少。
除了上述应用外，REEAD 还可用于检测癌症患者小块活检组织粗提物中的 TOP1 活性18，预测喜树碱（CPT）在癌细胞系中的细胞毒性抗癌效应20,21,22，甚至可检测单个细胞内的酶活性20,21。此外，结合 wellmaker 使用的 REEAD 检测系统可实现基于多孔板的药物筛选，适用于合成或天然化合物文库。除此之外，还开发了一种名为 REEAD C/L 的改进版 REEAD 检测方法，该系统可分别研究 TOP1 反应中的切割和连接步骤27。利用 REEAD C/L，可以确定小分子抑制剂的作用机制，并将其表征为具有潜在抗寄生虫效应的 TOP1 催化抑制剂28，或作为用于抗癌治疗的 TOP1 毒素24,25。最后，通过针对其他 TOP1 酶的不同需求（如 DNA 结合或切割-连接反应）对 DNA 底物进行特定重新设计后，REEAD 还已被用于检测传染病（例如引起疟疾的Plasmodium falciparum29，或Leishmania donovani 和猴痘病毒（数据未显示）），也可用于鉴定具有抗病原体效应的小分子化合物。本研究所提供的实验方案为 TOP1 领域的科研人员提供了一种简便的方法，可无需或仅需极少优化即可检测酶活性，并具备未来拓展至更广泛应用的潜力。

拓扑异构酶属于DNA修饰酶类，其中许多已被证实可作为人类疾病的生物标志物1,2,3,4,5,6。TOP1参与缓解与DNA复制、基因转录、重组以及染色体分离等细胞过程相关的拓扑应力7。TOP1通过在DNA中形成瞬时单链断裂的机制，能够解除负超螺旋和正超螺旋8,9。在结合DNA后，TOP1将活性位点的酪氨酸（Tyr723）定位，以对磷酸二酯骨架进行亲核攻击。随后形成一个TOP1-DNA切割复合物，其中酶共价连接于断裂DNA链的3'端。通过允许断裂链的5'端围绕完整链旋转，从而释放扭转应力。最后，断裂链5'端的羟基对3'-磷酸酪氨酸键进行亲核攻击，导致TOP1被释放，同时DNA骨架得以恢复8。
已开发出多种检测方法用于研究TOP1催化循环的各个步骤，包括松弛实验10电泳迁移率变动分析（EMSA）11,12DNA自杀性切割-连接实验13,14，以及 体内 酶复合物（ICE）检测15然而，这些检测方法存在若干局限性，因为它们依赖于凝胶电泳，需要使用DNA嵌 intercalating agents，或者需要高度专业化的培训和设备。此外，这些检测需要大量纯化的TOP1酶（解旋实验需1至5 ng，EMSA和切割-连接实验需50至200 ng），或至少10个样本的提取物6 使细胞发挥最佳功能。因此，开发了一种高灵敏度的方法，称为 REEAD 检测法，可实现对粗制生物样品中 TOP1 活性的特异性检测，并达到单个催化事件水平。16.
本文介绍了一种利用REEAD检测法16检测TOP1活性的实验方案。该检测方法的示意图见图1。将定制设计的硅胶网格固定在功能化载玻片上，形成一种多孔玻璃载片装置，下文称之为wellmaker（图1A）。随后，将5'-氨基修饰的引物偶联至载片孔内的功能化NHS基团上（图1B）。在TOP1介导的切割与连接反应中，特定的DNA底物被转化为闭合环状结构。TOP1特异性底物（图1C）可自发折叠成哑铃状结构，包含一个双链茎区和两个单链环区。其中一个环区与固定在表面的引物互补。茎区包含一个位于3'-端上游三个碱基处的优选TOP1切割位点，以及一个5'-羟基突出端。底物的环化反应可通过细胞/组织提取物（图1C）或重组纯化的TOP1蛋白（图1D）实现。
当底物被TOP1切割后，该酶会瞬时结合在3'-末端，同时三碱基片段发生扩散，使得5'-突出端能够与底物退火，并促进TOP1介导的连接反应。连接反应导致底物环化，随后TOP1解离。闭合的环状产物与固定在表面的引物杂交（图1E），并作为phi29 DNA聚合酶介导的等温滚环扩增（RCA）的模板。phi29聚合酶具有链置换能力，可产生约103个串联重复的扩增产物。在RCA过程中，可掺入荧光标记的核苷酸（图1F）或生物素偶联的核苷酸（图1G）17。掺入荧光标记的核苷酸后，可通过荧光显微镜或荧光扫描仪检测滚环扩增产物（RCPs）。或者，可使用辣根过氧化物酶（HRP）偶联的抗生物素抗体（图1H）结合生物素化的核苷酸，从而通过增强型化学发光（ECL）或催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）生成可检测的颜色信号来检测滚环扩增产物（RCPs）。RCA反应遵循线性反应动力学，因此REEAD检测具有直接定量性，每个RCP代表一次独立的TOP1介导的切割-连接反应。本文展示了该检测方法可用于检测纯化的重组TOP1酶活性或粗提样品中的TOP1活性，并可作为抗TOP1药物筛选的工具。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于荧光图像分析的相机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD 相机</td><td></td><td></td><td>用于化学发光图像分析</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>配备 60 倍油镜物镜和 GFP 滤光片（https://www.edmundoptics.com/p/gfp-filter-cube-set-olympus/21527/）</td></tr><tr><td>荧光扫描仪</td><td>Typhoon</td><td>FLA 9500</td><td>配备 473 nm 激光和 FAM 滤光片</td></tr><tr><td>含 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 的湿度培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含饱和 NaCl 的杂交培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>Fiji</td><td></td><td>下载地址：https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;细胞培养&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>适用于所选细胞系的细胞生长培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>#T4174</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>#P4300</td><td></td></tr><tr><td>组织培养瓶</td><td>ThermoFisher</td><td>#178983</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>#10270106</td><td></td></tr><tr><td>NEEA</td><td>Sigma</td><td>#M7145</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>#10010023</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;功能化载玻片&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5'-氨基修饰的 anti-TOP1 引物</td><td>Sigma</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-/5AmMC6/CCA ACC AAC CAA CCA AAT AAG-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>活化 Codelink HD 载玻片</td><td>SurModics</td><td>#DHD1-0023</td><td></td></tr><tr><td>硅胶网格</td><td>Grace-biolabs</td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>Pertex 胶水</td><td>Histolabs</td><td>#00801</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片 76 × 26 mm</td><td>Hounisen</td><td>#2510 1201BL</td><td>可使用其他相同尺寸的显微镜载玻片</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;DNA 环与滚环扩增&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TOP1 特异性底物</td><td>Sigma</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AGA AAA ATT TTT AAA AAA ACT GTG AAG ATC GCT TAT TTT TTT AAA AAT AAA TCT AAG TCT TTT AGA TCC CTC AAT GCA CAT GTT TGG CTC CGA TCT AAA AGA CTT AGA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>ATTO-488-dUTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>#95387</td><td></td></tr><tr><td>生物素-dCTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>#NU-809-BIO16L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ThermoFisher</td><td>#R0181</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 聚合酶</td><td>VPCIR Biosciences</td><td>#10010041</td><td></td></tr><tr><td>重组 TOP1</td><td>VPCIR Biosciences</td><td>#10010001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;滚环扩增产物的检测&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioFX TMB</td><td>SurModics</td><td>#ESPM-0100-01</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECL 混合液</td><td>Cytiva</td><td>#RPN2236</td><td></td></tr><tr><td>HRP 标记的抗生物素抗体</td><td>Merck</td><td>#A4541</td><td></td></tr><tr><td>封片剂（Vectashield）</td><td>Vector laboratories</td><td>#H-1000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;缓冲液列表&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PE 缓冲液</td><td></td><td></td><td>1 mM EDTA，8.12 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，1.88 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H2O</td></tr><tr><td>6x 打印缓冲液</td><td></td><td></td><td>300 mM Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，pH 8.5</td></tr><tr><td>封闭液</td><td></td><td></td><td>Buffer 5 补充 5% 脱脂奶粉和 5% BSA，pH 9</td></tr><tr><td>裂解缓冲液</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA + 蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>10x TOP1 反应缓冲液</td><td></td><td></td><td>50 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，100 mM Tris-HCl，pH 7.5</td></tr><tr><td>10x Phi29 反应缓冲液</td><td></td><td></td><td>330 mM Tris-乙酸盐，pH 7.5，100 mM Mg-乙酸盐，660 mM K-乙酸盐，1% Tween20，200 mM DTT</td></tr><tr><td>Buffer 1</td><td></td><td></td><td>50 mM Tris，50 mM Tris-HCl，32 mM 乙醇胺。注意：储存于 50 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td></td><td></td><td>4x SSC，0.1% SDS。注意：储存于 50 &amp;deg;C。</td></tr><tr><td>Buffer 3</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.3% SDS</td></tr><tr><td>Buffer 4</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.05% Tween20</td></tr><tr><td>Buffer 5</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.05% Tween20</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;缓冲液用化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>#T1506</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>#1.00317.2011</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>#1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>#05056489001</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Applichem</td><td>#436143</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>#1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>#1.06346.1000</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma</td><td>#411000</td><td></td></tr><tr><td>SSC</td><td>Invitrogen</td><td>#15557-036</td><td></td></tr><tr><td>Tris-乙酸盐</td><td>Sigma</td><td>#T1258</td><td></td></tr><tr><td>Mg-乙酸盐</td><td>Sigma</td><td>#M0631</td><td></td></tr><tr><td>K-乙酸盐</td><td>Sigma</td><td>#1.04820.1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>#8.22184.0500</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>#D0632</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>#1.02382.1000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>#M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>#1.06404.5000</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Sigma</td><td>#70166</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>#A4503</td><td></td></tr></tbody></table>

基于简单快速滚环扩增的粗生物样品中拓扑异构酶1活性检测

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

基于等温扩增的技术（如滚环扩增）已成功用于核酸、蛋白质含量或其他相关分子的检测。这些方法已被证明是临床和科研应用中PCR或ELISA的重要替代方案。此外，通过蛋白质印迹或免疫组织化学检测蛋白质含量往往不足以提供癌症诊断所需的信息，而酶活性的测定则是一种有价值的生物标志物。酶活性的测定还有助于病原体相关疾病的诊断和潜在治疗。在所有真核生物中，拓扑异构酶是参与调控DNA拓扑状态的关键DNA结合酶，在细胞重要生命过程中发挥关键作用，同时也是癌症预后判断和治疗的重要生物标志物之一。
多年来，拓扑异构酶一直是抗寄生虫和抗癌药物的潜在靶点，每年都有大量天然和合成的小分子化合物库被研究。本文介绍一种称为滚环扩增增强酶活性检测（REEAD）的方法，可简单、快速且无需凝胶地定量测定拓扑异构酶1（TOP1）的活性。TOP1通过切割并连接一种特别设计的DNA底物，将一条DNA寡核苷酸转化为闭合的环状结构，该环状结构可作为滚环扩增的模板，产生约103个串联重复的滚环扩增产物。根据扩增过程中核苷酸的掺入情况，可采用多种检测方法，包括荧光、化学发光和比色法。由于每一个由TOP1介导的切割-连接反应都会生成一个闭合的DNA环，该检测方法具有高度敏感性且可直接定量。

本文介绍了一种利用REEAD检测法检测TOP1活性的实验方案16。该方案曾用于检测重组TOP1的活性，采用了四种不同的检测方法：荧光扫描仪、荧光显微镜、化学发光和比色法。该方案还曾用于检测从Caco2细胞中提取的TOP1活性（以粗提物为例），采用化学发光或TMB显色法进行检测。此外，该方案还被用作药物筛选工具，以喜树碱（CPT）为例（一种TOP1特异性抑制剂），通过化学发光检测法检测其对重组TOP1活性的抑制作用。
使用荧光检测法分析TOP1活性所得结果如图2和图3所示。图2展示了荧光玻片的代表性扫描图像及其相应的定量结果。从定量结果可以看出，该检测方法对TOP1的检测限为12.5 ng。使用荧光显微镜检测法获得的代表性图像及其相应的定量结果如图3所示。采用该检测方法时，TOP1的检测限低至0.1 ng。使用化学发光检测法分析TOP1活性的结果如图4所示，比色检测法的结果如图5所示。这些检测方法的检测限为6 ng TOP1，或相当于从312个Caco2细胞中提取的TOP1量。图6展示了在80 µM CPT或DMSO存在下测定TOP1活性的结果，作为药物筛选应用的示例。三次独立实验的代表性图像及其定量结果表明，CPT可抑制TOP1介导的底物环化，结果符合预期24,25。
<img alt="用于DNA检测的基因编辑过程示意图，包含RCA、Phi29聚合酶和生物素化标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64484/64484fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：REEAD方案的示意图。 (A，B功能化载玻片的制备。将硅胶网格固定于功能化载玻片上，随后将5'-氨基引物偶联至载玻片，从而实现TOP1特异性底物的扩增。C,D) 环状闭合底物的制备。TOP1特异性底物折叠成哑铃形结构，其双链茎部含有一个优选的TOP1切割位点，其中一个单链环含有引物结合序列。C) 细胞裂解后释放TOP1。在TOP1介导的切割与连接反应后，底物转化为闭合环状结构； (D) 使用纯化的重组TOP1。E滚环扩增。将闭合的环状底物与固定在表面的引物杂交，并利用Phi29聚合酶通过滚环扩增（RCA）进行扩增。RCA可通过掺入荧光标记的核苷酸实现，如 F 或生物素标记的核苷酸，如 G荧光滚环扩增产物可使用荧光显微镜或荧光扫描仪进行观察。H) HRP标记的抗生物素抗体的结合。将生物素化的滚环扩增产物与HRP标记的抗生物素抗体孵育。信号的产生由HRP酶介导，信号可通过增强化学发光法（ECL）结合CCD相机检测，或通过TMB显色反应实现比色法可视化。缩写：REEAD = 滚环增强酶活性检测；RCA = 滚环扩增；TOP1 = 拓扑异构酶1；HRP = 辣根过氧化物酶；ECL = 增强化学发光；TMB = 3,3',5,5'-四甲基联苯胺。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64484/64484fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光强度与TOP1浓度的关系；凝胶图像及定量分析图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64484/64484fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
图2：使用荧光扫描仪检测TOP1活性。 左侧图显示采用荧光扫描读出法分析3–50 ng TOP1活性时芯片的代表性图像。右侧图为相应的定量结果。t检验（Welch校正），p = 0.0064，n = 4。缩写：TOP1 = 拓扑异构酶1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64484/64484fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，TOP1浓度效应，图像分析，图表，定量结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64484/64484fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
图3：使用荧光显微镜测量TOP1活性。 左侧面板显示了使用荧光显微镜读出方案分析0.1–12.5 ng TOP1活性时载玻片的代表性图像。请注意，这些图像是裁剪后的版本，以便清晰显示信号点。因此，它们与右侧面板中所示定量结果的信号数量不完全一致。t检验采用Welch校正，p = 0.0136，n = 3。缩写：TOP1 = 拓扑异构酶1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64484/64484fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="化学发光 ECL，TOP1 强度，纯化蛋白与 Caco2 细胞，图表，印迹分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64484/64484fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：使用化学发光检测法测定 TOP1 活性。（A）左图显示采用化学发光检测方案分析 3–50 ng TOP1 活性时芯片的代表性图像。右图显示相应的定量结果。t 检验结合 Welch 校正，p &lt; 0.0001，n = 4。（B）左图显示采用化学发光检测方案分析从 156–40,000 个 Caco2 细胞中提取的 TOP1 活性时芯片的代表性图像。右图显示相应的定量结果。t 检验结合 Welch 校正，p = 0.0224，n = 3。缩写：TOP1 = 拓扑异构酶 1。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64484/64484fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显色TMB检测显示TOP1纯化结果、信号强度与蛋白量（ng）关系以及Caco2细胞计数结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64484/64484fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：使用显色法检测TOP1活性的结果。（A）左图显示采用显色法检测程序分析3–50 ng TOP1时的代表性图像；右图显示相应的定量结果。t检验结合Welch校正，p = 0.0012，n = 4。（B）左图显示采用显色法检测程序分析从156–40,000个Caco2细胞中提取的TOP1活性时的代表性图像；右图显示相应的定量结果。t检验结合Welch校正，p = 0.0117，n = 3。缩写：TOP1 = 拓扑异构酶1；TMB = 3,3',5,5'-四甲基联苯胺。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64484/64484fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="药物筛选结果；DMSO、CPT、阴性对照的强度图和印迹；实验比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64484/64484fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：使用化学发光检测方案测定药物处理后TOP1活性的结果。 左侧图显示了在5% DMSO或80 µM CPT存在下，分析10 ng TOP1反应1分钟时芯片的代表性图像。右侧图为定量分析结果。t检验采用Welch校正，p = 0.0017，n = 3。缩写：TOP1 = 拓扑异构酶1；CPT = 喜树碱；DMSO = 二甲基亚砜；Neg = 阴性对照。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64484/64484fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文描述了一种利用滚环扩增增强型酶活性检测法对拓扑异构酶1活性进行高灵敏度和定量检测的实验方案。该方法可用于检测纯化组分或细胞/组织提取物中的拓扑异构酶1活性。本方案在涉及酶活性检测的各个研究领域均具有广泛的应用价值。

基于等温扩增的技术，如滚环扩增，已成功用于核酸的检测，……

本方案展示了一种通过滚环扩增方法快速、简便地检测粗提样品中拓扑异构酶1活性的技术。该方法的主要优势在于操作简单，即使无经验的研究人员也能轻松掌握；并且在使用粗提物时，其灵敏度高于其他基于凝胶的检测方法。本方案的应用范围广泛，可从药物处理反应的测定，扩展到具有潜在抗癌或抗感染疾病作用的小分子化合物的筛选。本实验操作将由本实验室的开发专家 Karol Mizielinski 演示。首先，将定制设计的硅胶隔离网格附着于功能化载玻片上，从而制成点阵制备装置。按压硅胶网格，以避免玻璃表面与硅胶之间产生气泡。接下来，通过在1倍打印缓冲液中加入5微摩尔的5'氨基引物来制备引物混合液。然后将4微升该混合物加入每个孔中，并将孔板置于含有饱和氯化钠的杂交室中孵育。为生成闭合环状底物，向16微升1倍拓扑异构酶反应缓冲液中加入2微升5微摩尔的拓扑异构酶1特异性底物以及2微升重组拓扑异构酶1酶或制备好的细胞提取物。将该环状混合物在37摄氏度下孵育30分钟，然后加入2微升1% SDS以终止酶反应。将制孔器浸入盛有预热至50摄氏度缓冲液1的托盘中。用移液器将缓冲液加入孔内，确保制孔器内部无气泡残留，随后将托盘在50摄氏度下孵育30分钟。孵育后，移除缓冲液1，并用蒸馏水洗涤两次，每次洗涤之间剧烈振荡一分钟。去除水后，接着将预热至50摄氏度的缓冲液2加入托盘中，然后按照缓冲液1的操作方法对孔板模具进行孵育和洗涤。随后，用70%乙醇洗涤孔板模具，剧烈振荡一分钟，并使用压缩空气使装置干燥。进行杂交时，将4 µL制备好的环状混合物加入到每个相应的孔中，并将孔板置于含有蒸馏水的湿盒内，在37 °C条件下孵育1小时。孵育结束后，依次用缓冲液3、缓冲液4和70%乙醇各洗涤孔板1分钟，然后使其自然晾干。随后，制备并往孔板的每个孔中加入4 µL的RCA混合物，在湿盒中37 °C孵育2小时。为了在显微镜下观察扩增的荧光滚环产物，首先用缓冲液3、缓冲液4和70%乙醇洗涤载玻片。用压缩空气吹干载玻片，然后将其粘附到显微镜载片上。用记号笔标记出各孔的位置，随后用镊子移除硅胶网格。为了便于相机成像，使用两微升不含 DAPI 的封片剂将样品封片，并加盖盖玻片。使用荧光显微镜配合 60 倍油镜物镜和相机对样品进行观察。成像后，将图像导入 ImageJ 软件，依次点击 Image（图像）、Stacks（堆栈）和 Images to Stack（图像转为堆栈）以合并图像，然后将图像类型更改为 8 位。设置阈值时，点击图像，调整，然后选择阈值。将下限设为 255，并调节上限，使仅右侧信号显示为红色，背景为黑色。逐帧浏览单个图像，确保其与调整阈值前的图像一致。在真实信号开始消失之前，确保将阈值设置为尽可能低。为计数信号，单击“分析”，然后选择“分析颗粒”，并确保图像J设置中的“汇总”字段已被勾选。向每个孔中加入4 µL稀释的辣根过氧化物酶标记的抗生物素抗体，在湿盒中于15至25 °C孵育50分钟。孵育结束后，用缓冲液5洗涤微孔板三次，每次三分钟，然后使其干燥。为检测化学发光，向各孔中加入2微升新配制的ECL鲁米诺和过氧化氢混合液，并使用CCD相机或X射线胶片对玻片进行成像。或者，若使用TMB显色，在缓冲液5洗涤后移除硅胶网格，并在整张玻片上加入400微升TMB溶液。将载玻片置于湿盒中，静置5到10分钟以显色。显色完成后，用70%乙醇洗涤载玻片，并用相机或手机拍照，以便使用ImageJ软件进行分析。将图片导入ImageJ，点击“Image Type”，然后选择“8 bit”，将图像类型更改为8位。使用工具栏中的矩形绘制工具限定测量区域，分别测量条带并绘制所需区域。通过单击“分析”然后选择“测量”来测定光密度。接着，将最初绘制的区域移动到下一个条带并进行测量。测量所有条带的强度后，使用所需的软件绘制数据。此处显示的是通过荧光扫描仪读数确定的拓扑异构酶1活性，定量结果清晰可见。该读数方法的检测限为12.5纳克，此处还展示了使用荧光显微镜读数获得的代表性图像及相应的定量结果。该检测方法的检测限为0.1纳克，增强化学发光法和比色法的检测阈值为6纳克。使用相同的检测方法时，ECL法的检测限为1,250个细胞，TMB法为312个细胞。当从结肠直肠腺癌来源细胞的提取物中测定拓扑异构酶1活性时。以药物筛选应用为例，在喜树碱或二甲基亚砜存在下检测了拓扑异构酶1的活性。定量结果表明，喜树碱可抑制拓扑异构酶1介导的底物环化，结果符合预期。该实验方案简单，仅需特别注意洗涤步骤和反应孵育时间。还可以利用Reid方法研究药物如何抑制拓扑异构酶1的活性，该方法灵敏度高且操作简便，可用于快速筛选潜在的拓扑异构酶1抑制剂，并将拓扑异构酶1活性作为癌症药物反应的生物标志物。

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